一株產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的重組釀酒酵母及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的重組釀酒酵母及其制備方法與應(yīng)用，屬于基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]低聚果糖又稱寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式為:G-F-Fn，n=l?3(G為葡萄糖，F(xiàn)為果糖)。低聚果糖是蔗糖分子的果糖殘基上通β-1-2糖苷鍵連接1?3個果糖基而形成的果糖寡聚體:蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。與傳統(tǒng)糖類相比，新型低聚果糖可作為益生元，促進(jìn)雙歧桿菌的生長、減少有害菌。低聚果糖具有水溶性膳食纖維的功效，且無任何毒副作用。低聚果糖廣泛存在于大麥、西紅柿、黑麥等植物中，但其含量較少(〈1%)，開發(fā)較難。利用微生物低聚果糖生產(chǎn)酶(果糖基轉(zhuǎn)移酶)可得到高純度、高產(chǎn)量的低聚果糖，果糖基轉(zhuǎn)移酶是一種具有果糖基轉(zhuǎn)移活性的酶，能作用于蔗糖催化獲得蔗果三糖等低聚糖。
[0003]在果糖轉(zhuǎn)移酶研究方面，目前國內(nèi)主要集中在野生菌篩選、性質(zhì)測定等方面。王立梅等對一株曲霉果糖轉(zhuǎn)移酶酶學(xué)性質(zhì)及底物特異性進(jìn)行研究，在pH 5.5，30°C條件下，果糖基轉(zhuǎn)移酶具有最高活性。鄭氏金云等研究了在不同蔗糖濃度下從黑曲霉AS0023純化的轉(zhuǎn)化酶(INV)和果糖轉(zhuǎn)移酶(FTS)的酶催化活力。在將來的研究過程中，具有優(yōu)良催化性能的優(yōu)良果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的挖掘與發(fā)現(xiàn)顯得尤為重要
[0004]近年來，以S.cerevisiae作為宿主菌表達(dá)異源蛋白日益引起重視。釀酒酵母表達(dá)宿主在具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如食品安全型宿主、基因操作簡單、易培養(yǎng)、快速分裂等。因此，采用高效異源表達(dá)食品酶一一果糖基轉(zhuǎn)移酶對于低聚果糖的生產(chǎn)及其他食品酶的大規(guī)模生產(chǎn)均具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一株產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的重組釀酒酵母及其制備方法與應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明所述的產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的重組釀酒酵母菌株，其特征在于:該菌株命名為S.cerevisiae W303-pYX212_Nl，可異源表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0007]上述的重組S.cerevisiae W303-pYX212_Nl，由如下方法制得:
[0008](1)酶編碼基因的獲得:通過RT-PCR方式，獲得來源于A.niger的果糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因fru。
[0009](2)表達(dá)載體的構(gòu)建:以質(zhì)粒pYX212構(gòu)建重組質(zhì)粒，獲得含有果糖基轉(zhuǎn)移酶基因fru的重組質(zhì)粒pYX212-fru。
[0010]( 3 )重組菌株的構(gòu)建:將步驟(2 )中構(gòu)建的重組質(zhì)粒p YX 2 1 2 -f r u轉(zhuǎn)化到
S.cerevisiae W303中，通過篩選得到轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子。
[0011](4)發(fā)酵產(chǎn)酶驗(yàn)證:采用250mL搖瓶培養(yǎng)重組菌株，測定果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力，獲得高效表達(dá)重組菌株:S.cerevisiae W303-pYX212_Nl。
[0012]上述重組S.cerevisiae菌株構(gòu)建方法中:步驟(1)所述果糖基轉(zhuǎn)移酶基因fru來源于黑曲霉(Aspergillus niger)，其已提交GenBank數(shù)據(jù)庫，其GenBank Access1n N0.為KT724055。
[0013]上述重組S.cerevisiae構(gòu)建方法中:步驟(2)所述質(zhì)粒載體為pYX212。
[OOM] 上述重組S.cerevisiae構(gòu)建方法中:步驟(3)所述轉(zhuǎn)化方法優(yōu)選醋酸鋰轉(zhuǎn)化法。
[0015]上述重組S.cerevisiae菌株構(gòu)建方法中:步驟(3)所述篩選得到轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子的方式優(yōu)選為:用添加15-25g/L葡萄糖的全合成營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SC-Ura篩選正確的轉(zhuǎn)化子。
[0016]重組S.cerevisiae菌株發(fā)酵生產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法是:重組菌S.cerevisiaeW303-pYX212-Nl在250mL搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-35°C，發(fā)酵時間為30-60h。
[0017]上述表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶的重組S.cerevisiae，即S.cerevisiae W303的菌學(xué)特征為:該酵母菌株是單細(xì)胞真核微生物，橢球形，不運(yùn)動，營養(yǎng)細(xì)胞為單倍體，固體或液體的全合成營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SC-Ura)下為出芽生殖，液體培養(yǎng)條件下以單細(xì)胞形式存在，固體培養(yǎng)時，成菌落存在，菌落表面濕潤、光滑、呈乳白色。
[0018]果糖基轉(zhuǎn)移酶制備:4°C條件下，5000-10000rmp離心5-20min，獲得菌體細(xì)胞。用相同體積的磷酸-檸檬酸緩沖液(pH 55)洗滌菌體細(xì)胞3-6次。再加入等體積的緩沖液混勻后，采用超聲破碎儀破碎細(xì)胞。4°C條件下，5000-10000rmp離心5-20min，獲得含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。
[0019]果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力測定:高效液相色譜(HPLC)法，具體參數(shù)如下:Chromaster高效液相色譜儀。色譜柱:XBridgeTM Amide 5μηι，4.6_X250mm。流動相:60-75%乙腈。流速:1.0-1.5mL/min。柱溫:28_30°C。進(jìn)樣量:1 OyL。檢測器:RI示差折光檢測器。
[°02°]本發(fā)明所述的重組S.cerevisiae菌株的應(yīng)用，主要體現(xiàn)在基于食品級表達(dá)宿主構(gòu)建的重組菌S.cerevisiae W303-pYX212_Nl進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0021]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【附圖說明】
[0022]圖1:重組質(zhì)粒pYX212_fru的構(gòu)建圖譜
[0023]圖2:果糖基轉(zhuǎn)移酶高表達(dá)重組S.cerevisiae菌株轉(zhuǎn)化子篩選
[0024]圖3:S.cerevisiaeW303-pYX212_Nl發(fā)酵產(chǎn)酶曲線
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1:構(gòu)建重組載體pYX212_fru
[0026]通過RT-PCR方法與PCR方法，獲得果糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因。用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切消化并純化后的fru基因和穿梭載體pYX212，用T4DNA連接酶于16°C連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化菌液涂布在氨芐青霉素濃度為lOOmg/1的LB平板。37°C過夜培養(yǎng)，挑選陽性克隆子用酶切和PCR方法鑒定，并進(jìn)行測序驗(yàn)證。最終獲得含有正確f ru基因的酵母表達(dá)質(zhì)粒pYX212-f ru。
[0027]實(shí)施例2:重組載體pYX212_fru轉(zhuǎn)化釀酒酵母
[0028]將重組質(zhì)粒pYX212-f ru通過化轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入S.cerevisiae感受態(tài)細(xì)胞，由于質(zhì)粒pYX212中帶有Ura3基因，與尿嘧啶缺陷型菌株遺傳互補(bǔ)，得到能在MM平板正常生長的基因工程菌。釀酒酵母化轉(zhuǎn)的方法:1 )W303單菌落接入50mL YH)培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至0D= 1.0。2 )TE溶液清洗，重懸在lmL 100mM LiCl中。3)30°C 200rpm培養(yǎng)比。4) 10yL DNA樣品，88yL細(xì)胞，2yL鮭魚精混勻，30°C培養(yǎng)3011^11。5)加入900yL PEG3350溶液，30°C 200rpm培養(yǎng)比。6)42°(3熱激5min，快速冷卻至室溫。7)離心水洗，涂布MM平板，篩選陽性克隆。
[0029]實(shí)施例3:S.cerevisiaeW303-pYX212_Nl發(fā)酵產(chǎn)酶
[0030]將篩選獲得陽性克隆，接種至250mL搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，篩選可高效表達(dá)重組果糖基轉(zhuǎn)移酶S.cere vis iae菌株。如圖2所不，其中S.cerevisiae W303-pYX212_Nl的產(chǎn)酶量最高，為39.79U/mL。將重組菌S.cerevisiae W303-pYX212_Nl接種至250mL搖瓶中，在30°C條件下發(fā)酵168h，取樣測定果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力(圖3)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，當(dāng)發(fā)酵至144h，重組菌S.cerevisiae W303_pYX212_Nl的菌濃(ODsqq)達(dá)到最大，為20.64。4°(3條件下，1 OOOOrmp離心lOmin，獲得菌體細(xì)胞。用相同體積的磷酸-檸檬酸緩沖液(pH 5.5)洗滌菌體細(xì)胞3次。再加入等體積的緩沖液混勻后，采用超聲破碎儀破碎細(xì)胞。4°C條件下，lOOOOrmp離心lOmin，獲得含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，當(dāng)發(fā)酵至144h，重組菌
S.cerevisiae W303-pYX212_Nl的果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力達(dá)到最大，為39.79U/mL。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一株產(chǎn)重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，其特征在于:該菌株命名為S.cerevisiae W303-pYX212_Nl，可異源表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶。2.酶編碼基因的獲得:通過RT-PCR方式，獲得來源于A.niger的果糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因fruo3.表達(dá)載體的構(gòu)建:以質(zhì)粒pYX212構(gòu)建重組質(zhì)粒，獲得含果糖基轉(zhuǎn)移酶基因fru的重組質(zhì)粒pYX212-fru。4.重組菌株構(gòu)建:將步驟(2)中建立的重組質(zhì)粒pYX212-fru轉(zhuǎn)化到S.cerevisiaeW303中，通過篩選得到轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子。5.發(fā)酵產(chǎn)酶驗(yàn)證:采用250mL搖瓶培養(yǎng)重組菌株，測定果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力，獲得高效表達(dá)重組菌株:S.cerevisiae W303-pYX212_Nl。6.權(quán)利要求1所述的表達(dá)重組果糖基轉(zhuǎn)移酶的S.cerevisiae菌株在發(fā)酵生產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶中的應(yīng)用。7.所述重組S.cerevisiae菌株發(fā)酵生產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的方法是:重組菌S.cerevisiaeW303-pYX212-Nl在250mL搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-35°C，發(fā)酵時間為30-60h。8.果糖基轉(zhuǎn)移酶獲得的方法是:4°C條件下，5000-10000rmp離心5-20min，獲得菌體細(xì)胞。用相同體積的磷酸-檸檬酸緩沖液(pH 5.5)洗滌菌體細(xì)胞3-6次。再加入等體積的緩沖液混勻后，采用超聲破碎儀破碎細(xì)胞。4°C條件下，5000-10000rmp離心5-20min，獲得含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的上清液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶的重組釀酒酵母菌株及構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用重組DNA技術(shù)將黑曲霉(Aspergillus？niger)來源的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因(fru)克隆連接到釀酒酵母(Saccharomyces？cerevisiae)表達(dá)載體pYX212，并轉(zhuǎn)化S.cerevisiae？W303宿主。經(jīng)篩選鑒定得到一株高產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的重組菌株，命名為：S.cerevisiae？W303-pYX212-N1。在250mL搖瓶中，重組S.cerevisiae菌株表達(dá)的果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力可達(dá)(39.79U/mL)。這為果糖基轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)與其在工業(yè)中應(yīng)用具有重要意義與巨大的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12N15/81, C12R1/865, C12N1/21
【公開號】CN105483070
【申請?zhí)枴緾N201510993097
【發(fā)明人】楊海泉, 郭文文, 劉晗, 許菲, 陳獻(xiàn)忠, 沈微, 樊游
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2015年12月24日