一種酶法合成6-磷酸己糖的方法
【專利說明】
[0001] 本申請(qǐng)涉及序列表。
[0002] 本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，通過引用將其并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，特別涉及一種酶法生產(chǎn)6-磷酸己糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 在蛋白質(zhì)代謝過程中，與細(xì)胞核內(nèi)體、細(xì)胞膜和細(xì)胞外分泌物有關(guān)的蛋白質(zhì)必須 經(jīng)過修飾才能轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的最終位置。6-磷酸甘露糖（mannose-6-phosphate，M-6_P)就 是廣泛存在于生命體中的與蛋白質(zhì)修飾密切相關(guān)的磷酸化糖類化合物。M-6-P與其相應(yīng)的 受體 6_ 磷酸甘露糖受體（mannose-6-phosphate receptor, M-6-P receptor)結(jié)合，在溶酶 體酶發(fā)生效應(yīng)的過程中起著重要的作用，M-6-P是溶酶體酶的分揀員和投送員。
[0005] 溶酶體病是由于基因缺陷而使溶酶體缺乏某種水解酶，使相應(yīng)的底物無(wú)法被降 解，造成細(xì)胞代謝障礙?，F(xiàn)今，人們已經(jīng)能夠利用酶替代法治療6種溶酶體缺陷疾病。大多 數(shù)的用于治療溶酶體缺陷疾病的酶都是通過將酶用M-6-P修飾，使其與目標(biāo)細(xì)胞以及器官 上的M-6-P受體結(jié)合，從而達(dá)到治療的目的。溶酶體酶的糖鏈上修飾有M-6-P對(duì)于有效地治 療溶酶體病非常關(guān)鍵。專利號(hào)201080035798. 3中提到了甘露糖-6-磷酸及其鹽、其前體或 其類似物有減少皮膚發(fā)紅的用途，同時(shí)具有美容效果，并且能夠加快受損皮膚的愈合。近年 來(lái)，以M-6-P為前體的藥物研宄日益受到關(guān)注，人們對(duì)于M-6-P的需求也隨之提升。因此， 尋找一種大規(guī)模生產(chǎn)M-6-P的方法是非常有必要的。
[0006] 目前，人們大多數(shù)采用化學(xué)法來(lái)合成M-6-P的類似物，而利用酶法來(lái)合成M-6-P 非常的少。化學(xué)法基本都是以甲基a-D-吡喃甘露糖苷或者甲基2, 3, 4-三-0-b苯甲 基-a -D-吡喃甘露糖苷為起始物經(jīng)過3-5步的合成步驟，形成與M-6-P具有相似結(jié) 構(gòu)的類似物。Audrey Jeanjean 等（Synthesis of new sulfonate and phosphonate derivatives for cation-independent mannose 6-phosphate receptor targeting, [J] Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters, 18 (2008) 6240 - 6243)提到了 一種以甲基 2, 3, 4-三-0-b苯甲基-a -D-吡喃甘露糖苷為起始物，經(jīng)過氧化以及羥基保護(hù)，再對(duì)6號(hào)位 碳原子上的基團(tuán)進(jìn)行脫保護(hù)并加上相應(yīng)的磺酸集團(tuán)，再對(duì)其他碳原子上的基團(tuán)進(jìn)行加氫處 理，從而得到相應(yīng)的6-磷酸甘露糖的類似物。合成過程所需要的條件比較苛刻，需要低溫 環(huán)境或者需要重金屬或有毒試劑的參與，并且總回收率也不高。
[0007] 相比于化學(xué)法合成M-6-P的類似物來(lái)說，酶法合成M-6-P具有催化效率高、反應(yīng)條 件溫和的優(yōu)點(diǎn)，且無(wú)需有機(jī)試劑以及重金屬的參與，更加有利于后期的藥物合成。酶法合成 M-6-P需要已糖激酶的參與，己糖激酶目前已知有4種不同的型態(tài)，這些型態(tài)差異是來(lái)自相 同基因的選擇性剪接，也就是將基因上的外顯子（由內(nèi)含子隔開的部分）重新組合。此外 在不同類型的細(xì)胞中，也有許多功能或結(jié)構(gòu)與己糖激酶相似的酶，包括己糖激酶I、己糖激 酶II、己糖激酶III，以及與前三者差異較大的己糖激酶IV(又稱為葡萄糖激酶）。這類酶 稱為同工酶，它們擁有相同的作用，但是卻是由不同的基因所制造。己糖激酶是一種能夠以 一種或多種己糖為底物，并能使己糖磷酸化的酶的統(tǒng)稱，己糖激酶對(duì)底物并沒有明顯的特 異性。
[0008] 在己糖激酶進(jìn)行磷酸化過程中所需要的磷酸供體，根據(jù)己糖激酶的來(lái)源不同而不 同，有的利用三磷酸腺苷（ATP)，有的則可以利用二磷酸腺苷（ADP)。例如：大部分生物中 的己糖激酶在發(fā)揮作用時(shí)都必須要ATP的參與，ATP-方面作為能源供體，另一方面作為磷 酸供體參與到該反應(yīng)過程中來(lái)，例如人來(lái)源的己糖激酶以及釀酒酵母來(lái)源的己糖激酶，而 嗜熱高溫球菌則是利用ADP來(lái)進(jìn)行磷酸化（Shigeyuki Kawai，Takako Mukai，Shigetarou Mori,Bunzo Mikami，Kousaku Murata,Hypothesis:Structures, Evolution, and Ancestor of Glucose Kinases in the Hexokinase Family, Journal of Bioscience and Bioengin eering，2005, 90 (4)，320 - 330.)。已有文獻(xiàn)報(bào)道利用己糖激酶催化甘露糖合成M-6-P，但該 反應(yīng)過程需要ATP來(lái)提供磷酸基，由于ATP價(jià)格昂貴，且不是很穩(wěn)定，不易于保存?；谝?上因素該過程不利于大規(guī)模的生產(chǎn)M-6-P。
[0009] 本發(fā)明提供了一種利用無(wú)機(jī)多聚磷酸型己糖激酶來(lái)合成M-6-P的方法，該無(wú)機(jī)多 聚磷酸型己糖激酶能夠利用多聚磷酸鹽將甘露糖轉(zhuǎn)化為M-6-P。多聚磷酸鹽相比于ATP來(lái) 說價(jià)格便宜，因此利用該無(wú)機(jī)多聚磷酸型己糖激酶催化反應(yīng)來(lái)生產(chǎn)M-6-P將大大降低生產(chǎn) 成本，為大規(guī)模生產(chǎn)M-6-P提供了一種新途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種酶法合成6-磷酸己糖的方法，通過異源表達(dá)得到無(wú) 機(jī)多聚磷酸型己糖激酶來(lái)催化合成M-6-P，開辟了一條以多聚磷酸鹽和/或ATP鹽為磷酸供 體合成M-6-P的酶催化合成途徑，為實(shí)現(xiàn)M-6-P大規(guī)模工業(yè)化提供一種新途徑。
[0011] 本發(fā)明涉及一種酶法合成6-磷酸己糖的方法，其特征在于，所述方法以己糖為底 物，以多聚磷酸鹽和/或ATP鹽為磷酸供體；將上述反應(yīng)物置于pH緩沖體系中并向其中 加入無(wú)機(jī)多聚磷酸型己糖激酶和輔因子，在無(wú)機(jī)多聚磷酸型己糖激酶的催化作用下合成 6-磷酸己糖。其中，本文上下文中涉及的"無(wú)機(jī)多聚磷酸型己糖激酶"指的是由分枝桿菌菌 株中表達(dá)無(wú)機(jī)多聚磷酸型己糖激酶的基因重組表達(dá)得到的一種己糖激酶。
[0012] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述無(wú)機(jī)多聚磷酸型己糖激酶通過以下步驟制備：
[0013] (1)克隆分枝桿菌（Mycobacterium sp. MCS)中表達(dá)無(wú)機(jī)多聚磷酸型己糖激酶的 基因；該基因的核苷酸序列如說明書核苷酸和氨基酸序列表中所示；
[0014] (2)構(gòu)建所述分枝桿菌中表達(dá)無(wú)機(jī)多聚磷酸型己糖激酶的基因的重組載體；
[0015] (3)將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞中并誘導(dǎo)無(wú)機(jī)多聚磷酸型己糖激酶基因 表達(dá)，得到表達(dá)菌體；
[0016] (4)超聲破碎所述表達(dá)菌體，提取無(wú)機(jī)多聚磷酸型己糖激酶。所述無(wú)機(jī)多聚磷酸型 己糖激酶的氨基酸序列如說明書核苷酸和氨基酸序列表中所示。
[0017] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述無(wú)機(jī)多聚磷酸型己糖激酶為游離酶或固定化酶。
[0018] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述己糖為甘露糖、果糖或葡萄糖。
[0019] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述磷酸供體為多聚磷酸鹽。
[0020] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多聚磷酸鹽為多聚磷酸鈉（(NaP03)n)或多聚磷酸鉀； 獨(dú)立地，所述輔因子為二價(jià)金屬陽(yáng)離子。其中所有的激酶都需要輔因子的存在，如二價(jià)金屬 離子，輔因子起穩(wěn)定供體分子高能鍵的作用，且為磷酸化的發(fā)生提供可能性。
[0021] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多聚磷酸鈉為六偏磷酸鈉或四聚磷酸鈉；獨(dú)立地，所述 輔因子為Mg 2+或Mn2+。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述多聚磷酸鈉為六偏磷酸鈉；所述輔因子為Mg2+。
[0022] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)體系中所述己糖的濃度為5-500mmol/L ;獨(dú)立地，所述 多聚磷酸鹽的濃度、或所述多聚磷酸鹽和所述ATP鹽的濃度之和為5-500mmol/L ;獨(dú)立地， 所述反應(yīng)時(shí)間為l-25h ;獨(dú)立地，所述反應(yīng)溫度為10-50°C ;獨(dú)立地，所述反應(yīng)體系的pH為 4-10〇
[0023] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)體系中所述己糖的物質(zhì)的量與所述多聚磷酸鹽的物 質(zhì)的量，或所述己糖的物質(zhì)的量與所述多聚磷酸鹽和所述ATP鹽的總物質(zhì)的量的比例為 1:1-1:10。
[0024] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述pH緩沖體系為羥甲基氨基甲烷（Tris)-鹽酸pH緩沖 體系、檸檬酸-檸檬酸鉀pH緩沖體系或甘氨酸-NaOH pH緩沖體系。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述pH 緩沖體系為Tris-HCl pH緩沖體系。
[0025] 如本文所用，下列術(shù)語(yǔ)將具有以下含義：
[0026] "PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）"：是指DNA在體外95°C高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng) 常是60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反 應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互補(bǔ)鏈的反應(yīng)。
[0027] "宿主細(xì)胞":是指將外源的核酸序列或者載體導(dǎo)入進(jìn)去的細(xì)胞。
[0028] "表達(dá)載體":是指能將目的DNA片段帶入宿主細(xì)胞，并能進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行表達(dá)的一 類DNA分子，比較常用的是質(zhì)粒，它是存在于細(xì)菌染色體以外的獨(dú)立的DNA分子。
[0029] "感受態(tài)細(xì)胞"：是指處于能吸收外源DNA的生理狀態(tài)的細(xì)胞。
[0030] "異源表達(dá)":是指將來(lái)自其他物種或者生物體的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。
[0031] "過表達(dá)":使克隆的基因在宿主細(xì)胞中超過正常水平表達(dá)。
[0032] "限制性內(nèi)切核酸內(nèi)切酶":是一類能特異性地識(shí)別雙鏈DNA序列并進(jìn)行切割的酶。
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