偽狂犬病病毒雙熒光標(biāo)記5基因缺失株的構(gòu)建的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株雙熒光標(biāo)記5基因（gE、gl、US9、UL49. 5、TK)缺失偽狂犬病病毒 的構(gòu)建，屬于生物技術(shù)和動(dòng)物病毒學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬?。≒seudorabies，PR ;又名 Aujeszky' s disease，AD)是由偽狂犬病病毒 (Pseudorabies virus，PRV)引起的一種急性傳染病，可感染多種家畜、伴侶動(dòng)物及野生動(dòng) 物。豬是感染后可以存活的唯一物種，也是病毒貯存宿主。感染豬主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、流 涎、呼吸困難、母豬繁殖障礙、仔豬高死亡率等，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] PRV是皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、水痘病毒屬的成員。PRV基因組為線性雙股 DNA，約145Kb，由長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)（UL)和短獨(dú)特區(qū)（US)及US兩側(cè)的末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)（TR)與內(nèi)部 重復(fù)（IR)組成，可編碼70-100種蛋白質(zhì)，成熟的病毒粒子約有50種蛋白。在上述基因產(chǎn) 物中，UL區(qū)段中的gC、TK及US區(qū)段中的PK、gG、gl、gE、llK和28K為病毒增殖的非必需成 份，一般認(rèn)為，TK、gC、gE、PK和CP (衣殼蛋白）等與PRV毒力相關(guān)。另外，皰疹病毒基因組 中，UL49. 5編碼的囊膜蛋白gN能抑制TAP介導(dǎo)的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在病毒感染的細(xì)胞內(nèi) 阻斷MHC I類復(fù)合體的裝配，從而下調(diào)MHC I類分子在細(xì)胞表面的表達(dá)，使得病毒有可能逃 避宿主CDS+T細(xì)胞的識(shí)別，并在宿主鼻腔及上呼吸道上皮細(xì)胞中復(fù)制，引起化膿性反應(yīng)或組 織潰爛，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌二次感染及嚴(yán)重的肺炎。
[0004] 疫苗免疫接種是防制偽狂犬病的主要策略。偽狂犬疫苗主要分為三種：一是常 規(guī)疫苗，即滅活疫苗和弱毒活疫苗，如目前應(yīng)用較多的Bartha-Kei株活疫苗；二是基因缺 失疫苗，即通過(guò)分子生物學(xué)方法，人工缺失某些基因，使其毒力減弱的同時(shí)又保留其免疫原 性。目前構(gòu)建的偽狂犬病病毒基因工程疫苗大多為T(mén)K、gl、gE、gG基因的單基因缺失或多 基因缺失突變株。
[0005] PRV作為基因工程載體具備相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)：（I)PRV不感染人，具有很好的安全性。現(xiàn) 有的活疫苗株Bartha-K61或'783'等在世界上已應(yīng)用了幾十年，未發(fā)生重大的安全事故。 (2)基因組容量大：在PRV長(zhǎng)達(dá)145Kb的基因組中，約一半基因被認(rèn)為是非必需的，如gl、 gE、gM、TK、PK、gC和dUTPase等，在這些區(qū)域可先后或同時(shí)插入和表達(dá)多種外源基因而不 顯著影響其繁殖及免疫原性。（3)生產(chǎn)原材料來(lái)源方便，生產(chǎn)成本低：PRV疫苗可以接種SPF 雞胚成纖維細(xì)胞及PK15、ST等傳代細(xì)胞生產(chǎn)，原材料充足，生產(chǎn)工藝成熟，且PRV病毒滴度 很容易達(dá)到免疫要求，大大降低了生產(chǎn)成本。（4)免疫期長(zhǎng)：PRV以細(xì)胞免疫為主，病毒可以 較長(zhǎng)時(shí)間感染，外源基因可以在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)。（5)宿主范圍廣，多種家畜、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物（如狐 和貂）、伴侶動(dòng)物及野生動(dòng)物均可感染PRV，可研制針對(duì)不同動(dòng)物的活載體疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是將自行分離并經(jīng)鑒定命名為偽狂犬病病毒SX株作為親本毒，經(jīng) 基因工程方法構(gòu)建缺失gE、gl、US9、部分UL49. 5基因和TK基因并插入GFP和RFP標(biāo)記的 重組病毒；并以該重組病毒作為疫苗候選毒株或偽狂犬活病毒載體系統(tǒng)，用于基因工程疫 苗的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案
[0008] 1. -種偽狂犬病病毒株，其特征在于所述該病毒株為偽狂犬病毒（Pseudorabies virus)rPRV/gE _ /gl _ /US9 _ / Λ UL49. 5/TK _ /GFP+/RFP+株已于 2015 年 11 月 11 日送交 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為：CGMCC No. 11493。
[0009] 2. 一種偽狂犬病病毒株，其特征在于該偽狂犬病病毒株同時(shí)缺失了 gE基因、gl基 因、US9基因、TK基因和部分UL49. 5基因五種偽狂犬病病毒基因，在基因缺失的部位通過(guò)同 源重組分別插入綠色熒光蛋白（GFP)基因和紅色熒光蛋白（RFP)基因作為標(biāo)記物。
[0010] 3.如權(quán)利要求1所述偽狂犬病病毒株，其特征在于缺失的UL49. 5部分基因包括其 所表達(dá)的gN蛋白的胞外域37~40氨基酸所對(duì)應(yīng)的12個(gè)核苷酸序列及胞質(zhì)尾區(qū)（CT)全 部51個(gè)核苷酸序列。
[0011] 4.如權(quán)利要求1所述的偽狂犬病病毒株的構(gòu)建方法，其特征在于該毒株構(gòu)建的步 驟為：
[0012] (1)親本毒株：用自主分離和鑒定并命名為偽狂犬病病毒（PRV)SX株作為親本毒 株；
[0013] (2)轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建：以pMD-18T克隆載體為骨架載體，構(gòu)建四種轉(zhuǎn)移載體： 第一種轉(zhuǎn)移載體為PMD-US6-GFP-US2,插入偽狂犬病病毒gl、gE和US9兩端的US6 和US2部分基因序列作為同源臂，左右同源臂間插入GFP基因；第二種轉(zhuǎn)移載體為 PMD-UL50-UL49. 5- Λ 37~40-CT-RFP-UL49,插入U(xiǎn)L49. 5基因 CT序列兩端部分基因序列 作為同源臂，左右同源臂間插入RFP基因；第三種轉(zhuǎn)移載體為PMD-UL50-UL49. 5- Λ 37~ 40-CT-UL49,插入U(xiǎn)L49. 5基因 CT基因兩端部分基因序列作為同源臂，將第二種轉(zhuǎn)移載體 引入的RFP基因敲除；第四種轉(zhuǎn)移載體為pMD-UL24-RFP-UL22,插入偽狂犬病病毒TK基因 兩端的UL24和UL22部分基因序列作為同源臂，左右同源臂間插入RFP基因；
[0014] (3)雙熒光標(biāo)記缺失病毒的構(gòu)建：首先將（2)中的pMD-US6-GFP-US2轉(zhuǎn)移載體 與親本株P(guān)RVSX株共轉(zhuǎn)染ΡΚ15細(xì)胞，通過(guò)克隆篩選，獲得含GFP標(biāo)記蛋白的缺失病毒株 (rPRV/gE /gl /US9 /GFP+株）；第二步將上一步缺失株與 pMD-UL49. 5- Λ 37-40-CT-RFP 轉(zhuǎn) 移載體共感染ΡΚ15細(xì)胞，篩選出缺失株（rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/GFP+/RFP+株）后， 再通過(guò)同源重組將RFP標(biāo)記基因敲除；第三步將篩選的rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5缺失 株再與PMD-UL24-RFP-UL22轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染ΡΚ15細(xì)胞，通過(guò)克隆篩選獲得雙熒光標(biāo)記缺失 病毒 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株。
[0015] 5.權(quán)利要求1所述的偽狂犬病病毒株的應(yīng)用，其特征在于rPRV/gE/gl / US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株作為候選毒株，敲除其中GFP和RFP后作為疫苗生產(chǎn)毒株 用于制備偽狂犬病活疫苗。
[0016] 6.權(quán)利要求1所述的偽狂犬病病毒株的應(yīng)用，其特征在于rPRV/gE/gl / US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+株作為活載體病毒插入一種和/或多種動(dòng)物病原抗原基因， 以獲得表達(dá)外源基因的重組病毒，制備基因工程活載體疫苗，達(dá)到同時(shí)防制多種疾病的目 的。
[0017] 本發(fā)明技術(shù)路線如下：
[0018] 1.通過(guò)基因克隆技術(shù)以PRV(SX株）部分US6和US2基因序列作為同源臂，以及 綠色熒光蛋白基因 GFP作為篩選標(biāo)記構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pMD-US6-GFP-US2,將PRV(SX株）病毒 和轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞獲得缺失gE、gl和US9基因，同時(shí)插入GFP標(biāo)記的重組病毒 rPRV/gE /gl /US9 /GFP+〇
[0019] 2.以PRV SX株的UL49. 5基因?yàn)槟０澹瑯?gòu)建兩個(gè)克隆載體pMD18T-A 37-40和 pMD18T-CT-null，分別缺失UL49. 5中胞外域37-40氨基酸基因序列和胞質(zhì)尾區(qū)（CT)80-96 氨基酸，并將缺失了這兩部分的基因片段通過(guò)引入酶切位點(diǎn)AflII進(jìn)行連接，構(gòu)建含有CT 基因兩端部分基因序列的同源臂的轉(zhuǎn)移載體PMD-UL50-UL49. 5- Λ 37~40-CT-RFP-UL49， 將rPRV/gE /gl /US9 /GFP+病毒和轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染ΡΚ15細(xì)胞獲得缺失gE、gl、US9、部分 UL49. 5基因（37-40氨基酸基因序列和CT基因序列）的缺失病毒，獲得同時(shí)插入RFP標(biāo)記 的重組病毒rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/GFP+/RFP+。再通過(guò)同源重組將RFP缺失，最終篩 選 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/GFP+缺失病毒。
[0020] 3.以TK基因兩測(cè)的UL24和UL22部分基因序列為同源臂，以紅色熒光蛋白 基因（RFP)作為篩選標(biāo)記構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pMD-UL24-RFP-UL22，將其與rPRV/gE /gl / US9 / Λ UL49. 5/GFP+病毒共轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞獲得缺失TK基因同時(shí)插入RFP標(biāo)記的重組病 毒 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+。
[0021] 4.對(duì)重組病毒 rPRV/gE /gl /US9 / Λ UL49. 5/TK /GFP+/RFP+進(jìn)行生物特性分析， 試驗(yàn)結(jié)果表明該重組病毒能在PK15細(xì)胞上穩(wěn)定遺傳，對(duì)小鼠安全，與未缺失UL49. 5部分基 因序列的重組病毒rPRV/gE /gl /US9 /TK /GFP+/RFP+相比，在PK15細(xì)胞上出現(xiàn)病變的時(shí)間 提前8小時(shí)左右
【具體實(shí)施方式】
[0022] 1.載體
[0023] PMD-18T載體，用于克隆測(cè)序及轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公 司。含有GFP基因的載體pU-EGFP和含有RFP基因的載體pU-ERFP，均由專利申請(qǐng)人所在實(shí) 驗(yàn)室保存。
[0024] 2.引物設(shè)計(jì)
[0025] 根據(jù)GenBank上發(fā)表的PRV序列設(shè)計(jì)合成以下引物：
[0026] (1)擴(kuò)增gl基因左同源臂：
[0027] US6F :5' -GACTTAAGGATCTCCGACCCGCAGGTGG-3'（序列 1)
[0028] US6R :5' -GACTTAAGGGAGCCGGGTCACGTCGCGC G-3'（序列 2)
[0029] (2)US9基因右同源臂：
[0030] US2F :5' -GACTAGTATGGGGGTGACGGCCATCAC-3'（序列 3)
[0031] US2R :5' -GACTAGTCGGAGAGATCCTGCCGTCTAGG-3'（序列 4)
[0032] (3) GFP 基因：
[0033] EGFP-F :5' -GGTATACGGATCCAAGGAGATATAACA-3'（序