專利名稱：一種偽狂犬病gEˉ/gIˉ基因缺失毒株、含有該毒株的滅活疫苗及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，與基因工程有關(guān)。本發(fā)明具體涉及一種重組的偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PrV)突變株(毒株編號(hào)WKQ-001)的構(gòu)建以及利用該重組的毒株制備偽狂犬病基因缺失標(biāo)志滅活疫苗，本發(fā)明的毒株缺失了PrV的糖蛋白基因gI、gE，導(dǎo)致PrV毒力下降，因而可以用于制備偽狂犬病安全疫苗。
本發(fā)明還涉及所述的重組偽狂犬病毒株和基因缺失滅活疫苗的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
偽狂犬病病毒(PrV)屬皰疹病毒科a皰疹病毒亞科，具有在細(xì)胞培養(yǎng)物上快速生長(zhǎng)，強(qiáng)烈的神經(jīng)嗜性與潛伏感染性等特性(Roizmorn B，Desrosiers R，F(xiàn)lecbenstein B，Lopez C，Minson Ad and studdertMJ.The family Herpesviridae；an update.Arch Virol.1992，123425-449)。該病毒在自然條件下能感染豬、牛、羊、犬、貓、兔、鼠、野豬、貂、熊、狐等動(dòng)物。除豬以外，其他動(dòng)物感染偽狂犬病毒后，具有發(fā)熱、奇癢和急性腦脊髓炎等典型癥狀，均為致死性感染。該病在豬呈爆發(fā)流行。豬是該病毒的儲(chǔ)藏者和傳染源，主要表現(xiàn)為母豬的繁殖障礙和仔豬大量死亡，其中15日齡以內(nèi)仔豬死亡率高達(dá)100％。偽狂犬病給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
在偽狂犬病疫苗研究和應(yīng)用方面，目前主要包括弱毒疫苗和滅活疫苗兩種。弱毒疫苗由于該病毒的潛伏感染特性，因此存在著不安全和散毒問題。一般認(rèn)為，滅活疫苗的安全性要高于弱毒疫苗，但其效力要差一些。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們研制出了一些針對(duì)偽狂犬病防制的基因缺失疫苗，即利用基因工程方法插入或刪除PrV基因組的一段序列，使某些基因不表達(dá)，達(dá)到致弱PrV而又不影響其免疫原性的目的。此外，基因缺失疫苗還可以降低免疫豬攻毒后的排毒能力，其自身的潛伏感染能力也大大下降。這些人工改造的基因缺失疫苗不僅在安全方面更為可靠，而且還有利于建立鑒別診斷方法。二者相結(jié)合，不但可預(yù)防偽狂犬病，而且能夠區(qū)分出自然感染豬群與免疫豬群，通過逐漸淘汰自然感染豬，建立健康豬群，以致最終達(dá)到根除偽狂犬病的目的。
豬偽狂犬病根除的難點(diǎn)在于偽狂犬病毒的長(zhǎng)期潛伏性以及病毒的免疫逃避而造成的免疫失敗。研究表明，偽狂犬病糖蛋白基因gE是造成偽狂犬病毒潛伏和免疫逃避的主要因素。糖蛋白gE是至今發(fā)現(xiàn)的所有PRV毒株(某些疫苗株除外)均能表達(dá)的蛋白，具有群特異性，在PRV的鑒別診斷中具有重要意義。因此，通過接種偽狂犬病毒gE基因缺失滅活疫苗來(lái)預(yù)防和控制偽狂犬病，已成為國(guó)際上普遍接受和流行的方法。
在偽狂犬病毒gE基因缺失疫苗的研制方面，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)于2003年研制出一種偽狂犬病毒TK-/gE-/gI-基因缺失標(biāo)志活疫苗，該疫苗具有較好的免疫效果，所述的偽狂犬病毒株缺失了TK-/gE-/gI-基因，不含外源基因，屬于一種用基因工程構(gòu)建的活疫苗(參見中國(guó)發(fā)明專利公開說明書，專利申請(qǐng)?zhí)?3156706.1)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào)道了一種偽狂犬病TK-/gE-/gI-/LacZ+基因缺失標(biāo)志致弱活疫苗，該毒株缺失TK-/gE-/gI-基因，但包含外源基因LacZ的表達(dá)盒(參見，郭萬(wàn)柱等，偽狂犬病基因缺失疫苗株(SA215)某些生物學(xué)特性研究，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000年9期)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所構(gòu)建完成了gE/TK基因缺失突變株，該突變株含有外源基因LacZ的表達(dá)盒(參見田志軍等，偽狂犬病病毒gE/TK基因缺失突變株的構(gòu)建，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004年5期)；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào)道了一種偽狂犬病病毒上海株(PRV-SH)/gE-/gI-/GFP+缺失株(參見姜焱等，偽狂犬病病毒上海株(PRV-SH)/gE-/gI-/GFP+缺失株的構(gòu)建)微生物學(xué)報(bào)，2003(2)15-20)，該缺失株含有外源基因綠熒光蛋白GFP的表達(dá)盒。通常來(lái)說，把外源基因引入突變株，對(duì)于該突變株的篩選來(lái)說無(wú)疑是一條捷徑，因?yàn)檫@樣可以大大提高篩選的效率。有專家強(qiáng)調(diào)指出，LacZ，LUC等報(bào)告基因?qū)偻鈦?lái)基因，在生物體內(nèi)有可能影響其生物學(xué)特性，而對(duì)生物體產(chǎn)生一些負(fù)面的影響；再者，用于生物體的生物制劑是不允許隨便帶人外來(lái)基因的，因而這些插入報(bào)告基因的基因缺失疫苗一般只能用來(lái)作為研究偽狂犬病的潛伏感染及其體內(nèi)增殖的動(dòng)力學(xué)的一種手段，不能作為商品進(jìn)入市場(chǎng)(金升藻等，偽狂犬病基因缺失疫苗研究進(jìn)展，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35(1)89-93)。因此上述三種基因缺失疫苗由于存在上面所提到的缺陷，一旦進(jìn)入市場(chǎng)可能存在生物安全問題。本申請(qǐng)人曾經(jīng)研制一種缺失了TK/gE/gI基因的偽狂犬病基因疫苗(參見中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開說明書，專利申請(qǐng)?zhí)?3156706.1)具有較好的免疫效果且不含外源基因，是對(duì)現(xiàn)有疫苗的一大貢獻(xiàn)，但作為致弱的活疫苗依然可能存在著返強(qiáng)的危險(xiǎn)。因此研制一種免疫效果好，又安全的偽狂犬病毒基因缺失滅活疫苗是當(dāng)前生產(chǎn)上急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，通過基因重組方法獲得一株重組的偽狂犬病基因工程毒株，利用該毒株制備一種防制效果好和安全性高的偽狂犬病gE、gI基因缺失標(biāo)志滅活疫苗。
基于上述發(fā)明的思想，本發(fā)明還包括一種缺失gE、gI基因的偽狂犬病毒基因工程毒株、含有該毒株制備的滅活疫苗及其應(yīng)用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明實(shí)施的關(guān)鍵，是本申請(qǐng)人通過基因重組技術(shù)得到一株重組的偽狂犬病毒Pseudorabies virus毒株，該毒株的編號(hào)為WKQ-001，該毒株已于2005年9月2日，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號(hào)為CCTCC-V200511。
本發(fā)明重組的偽狂犬病毒毒株，該毒株具有以下顯著特征1)該重組毒株缺失了gE、gI基因；2)該重組毒株不含外源基因。
本申請(qǐng)人利用該保藏的偽狂犬病毒Pseudorabies virus毒株WKQ-001，CCTCC-V200511制備一種偽狂犬病毒缺失疫苗。
所述的基因缺失疫苗是滅活疫苗，它是按照以下配比制備的按份數(shù)計(jì)A、水相3份每一份水相按96份用權(quán)利要求1或2所述的偽狂犬病毒株制備的滅活的偽狂犬病毒液加4份滅菌吐溫80配制；B、油相6份每一份油相按以毫升計(jì)的94份10號(hào)獸用白油，加入以克計(jì)的2份硬脂酸鋁和以毫升計(jì)的6份司本-80比例配制，和C、混合上述A和B所述的水相和油相，即得到所述的滅活疫苗。
更詳細(xì)的技術(shù)方案如以下所示用于本發(fā)明基因重組的來(lái)源毒株是偽狂犬病毒毒株Ea株(參見陳煥春等，豬偽狂犬病病毒鄂A株的分離鑒定，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，29(2)，972104)作為親本株，將PrV的糖蛋白基因gI、gE編碼區(qū)部分缺失，從而得到缺失突變株，該突變株保藏在CCTCC，保藏號(hào)為CCTCC-V200511。
制備偽狂犬病毒基因缺失標(biāo)志滅活疫苗的具體步驟是1)重組狂犬病毒的毒株的制備用中間轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pIESE(該質(zhì)粒已于2005年9月2日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC NOM205101)，與偽狂犬病毒Ea株(簡(jiǎn)稱PrV Ea，下同)基因組DNA共轉(zhuǎn)染豬腎傳代細(xì)胞IBRS-2，出現(xiàn)病變后，收毒。經(jīng)過PCR篩選和空斑篩選獲得到PrV gE-/gI-突變株，該毒株的編號(hào)為WKQ-001，屬于一種偽狂犬病毒(Pseudorabies virus)毒株，于2005年9月2日，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC-V200511。
2)偽狂犬病毒基因缺失標(biāo)志滅活疫苗的制備用步驟1)得到的偽狂犬病毒毒株(保藏編號(hào)CCTCC-V200511)生產(chǎn)的病毒液加入甲醛溶液充分混勻后，置37℃作用36小時(shí)，然后放室溫(25℃左右)繼續(xù)作用12小時(shí)即成制苗用抗原。按體積份數(shù)計(jì)取3份水相(每一份水相按94份滅活的重組的偽狂犬病毒液中加4份滅菌吐溫80制備6份油相(每一份油相用中國(guó)浙江省杭州市煉油廠生產(chǎn)的10號(hào)獸用白油94份，加入硬脂酸鋁2份(以克為單位計(jì))以及6份司本-80配制而成。
本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明的重組偽狂犬病毒株來(lái)源于申請(qǐng)人首先從國(guó)內(nèi)自主分離和克隆的偽狂犬病毒株，與國(guó)外同類毒株及其產(chǎn)品相比，其應(yīng)用效果更加適合我國(guó)感染和預(yù)防感染偽狂犬病的流行豬群，因而其防制的針對(duì)性更強(qiáng)；(2)本發(fā)明的重組偽狂犬病毒株來(lái)源于感染的豬，與現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的分離于其他動(dòng)物的偽狂犬病毒株相比，本發(fā)明制備的偽狂犬病基因缺失標(biāo)志滅活疫苗的安全性和保護(hù)性更適合于豬偽狂犬病的預(yù)防，有利于我國(guó)豬場(chǎng)偽狂犬病的掙化處理。
(3)本發(fā)明的重組偽狂犬病毒株不含任何外源基因，與現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的同類偽狂犬病毒基因疫苗所含LacZ等標(biāo)記基因的偽狂犬病基因疫苗相比，具有更高的生物安全性。


圖1，顯示了pIESE質(zhì)粒構(gòu)建流程圖，質(zhì)粒pIESE為含有PRV Ea株部分gE基因和gI基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。
圖2，顯示了偽狂犬病病毒gE、gI雙基因缺失轉(zhuǎn)移載體pIESE鑒定的電泳圖譜。圖中115000Marker；2Stu I和BstEII雙酶切質(zhì)粒pIESE。經(jīng)StuI+BstE II雙酶切，產(chǎn)生一條6200bp大小的片段，而不是1247bp和6200bp兩條電泳條帶。圖2顯示了這兩個(gè)酶切位點(diǎn)已經(jīng)消除。
圖3，顯示了重組病毒PrV gE-/gI-構(gòu)建流程。
圖4，顯示了重組病毒PrV gE-/gI-PCR鑒定的電泳圖譜，圖中，1-18為gE-/gI-重組病毒；19為水對(duì)照；20為細(xì)胞對(duì)照；21為pIESE陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照；22為PRV EA株基因組對(duì)照。
由圖4可知，本發(fā)明重組偽狂犬病毒能擴(kuò)增出大小約1400bp的gE-/gI-片段，而傳統(tǒng)分離的偽狂犬病Ea株(PRV EA株)和陰性對(duì)照均不能擴(kuò)出此片段，證明該P(yáng)rV基因組DNA中g(shù)E、gI基因已經(jīng)缺失。
圖5，顯示了重組病毒PrV gE-/gI-的遺傳穩(wěn)定性電泳圖譜，圖中，1-5為第五代重組病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；6-10為第十代重組病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；11-15為第十五代重組病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；16為水對(duì)照；17為細(xì)胞對(duì)照；18為pIESE陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照。
圖6，顯示了重組病毒的間接免疫熒光鑒定圖片結(jié)果，圖中1為gE-/gI-突變株；2為細(xì)胞對(duì)照；3為傳統(tǒng)的PRV Ea株。由間接免疫熒光結(jié)果可知由于缺失了gE-基因，本發(fā)明偽狂犬病突變株(即偽狂犬病重組毒株)無(wú)法與gE-的單抗結(jié)合，因此，圖中1，2顯示為陰性。
圖7，顯示了重組偽狂犬病毒PrV gE-/gI-的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)雜交鑒定圖譜，圖中1偽狂犬病毒Ea株親本病毒株對(duì)照；2PK-15細(xì)胞對(duì)照；3重組偽狂犬病毒PrV gE-/gI-雜交結(jié)果。由蛋白質(zhì)斑點(diǎn)印跡；gE基因刪除后，PrV Ea gE-/gI-不能表達(dá)gE糖蛋白。
以下結(jié)合圖表和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
具體實(shí)施例方式
一、引物設(shè)計(jì)根據(jù)GeneBank已發(fā)表的Prv Ea株gI(基因數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為AF306511)；gE(基因數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為AF171937)基因序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物簡(jiǎn)稱為P1、P2，擴(kuò)增gI、gE雙基因缺失后的DNA片段大小為1400bp。
引物序列如下P15’-TAGACGGGACGCTGCTGTTTCTGGAGG-3’，P25’-CGGTCACGCCATAGTTGGGTCCATTCG-3’PCR擴(kuò)增條件如表1所示表1 本發(fā)明的PCR條件和引物

二、通用轉(zhuǎn)移載體pIESE的構(gòu)建
1、質(zhì)粒pIECMV(含PRV Ea株gD，gI，gE，28k基因部分編碼序列，11k完整編碼框以及質(zhì)粒pcDNA3.1的多克隆位點(diǎn)區(qū))由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物病毒實(shí)驗(yàn)室方六榮博士構(gòu)建。其詳細(xì)制備過程參見中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)?00510012147.3)以限制性內(nèi)切酶STUI，BSTEII雙酶切質(zhì)粒pIECMV，去除其多克隆位點(diǎn)區(qū)，回收剩余片段，用T4 DNA Ligase連接，16℃水浴過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)，然后挑取單克隆菌落，在常規(guī)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后，于-20℃保存待用。該質(zhì)粒保藏在CCTCC，保藏號(hào)為CCTCC NOM2051012、轉(zhuǎn)移載體序列的測(cè)定采用雙脫氧末端終止法(參見分子克隆手冊(cè)，中國(guó)科學(xué)出版社)測(cè)序及常用DNAclub，DNAsis2.5軟件分析。其結(jié)果見附圖1、附圖2所示。
三、偽狂犬病毒Ea株gE基因缺失突變株的構(gòu)建1、偽狂犬病毒Ea株基因組的提取將解毒病變的PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)移至500mL離心管中(5000rpm，5min)。棄去培養(yǎng)液，加入PBS(PH7.4)重懸，轉(zhuǎn)入50mL離心管中(5000rpm，5min)，棄上清，以10mL LCM重懸，冰浴15min，加入1mL氟利昂(2500rpm，8min)，取上清。以24000rpm，2小時(shí)超速離心，棄上清，加10mLTEN重懸。加入10％SDS 500UL，作用3min，酚仿抽提3次，各10000rpm，10min.無(wú)水乙醇沉淀30min，8000rpm，15min，重懸，-20℃保存待用。
2偽狂犬病毒突變株的篩選純化1)共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法(參見invitrogen公司的LipofectamineTM2000操作說明書)，以轉(zhuǎn)移載體pIESE和偽狂犬病毒Ea株基因組共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，出現(xiàn)病變后，收取細(xì)胞液，以100μL接于長(zhǎng)成單層的IBRS-2細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，出現(xiàn)病變后，收毒。以200μL制成病毒模板，PCR篩選陽(yáng)性突變株。
2)偽狂犬病毒突變株突變株的空斑純化將檢測(cè)為陽(yáng)性的共轉(zhuǎn)染產(chǎn)物反復(fù)凍融3次，10-2～10-7稀釋，分別取400μL接種至生長(zhǎng)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的PK-15細(xì)胞單層培養(yǎng)物，于37℃吸附1小時(shí)，傾去培養(yǎng)液，用無(wú)鈣鎂的PBS洗3次，每孔覆蓋低熔點(diǎn)瓊脂糖2.5mL，置37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待空斑形成后，以1/10000的中性紅溶液染色，37℃感作1小時(shí)，將其吸出，然后將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃感作2小時(shí)，使殘留的中性紅溶液充分揮發(fā)。以毛細(xì)玻璃管挑取空斑，接于長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的24孔板中，待病變完全后，收毒，-20℃保存。然后取出200μL制成病毒模板，pcr篩選，空斑純化，如此反復(fù)，直至得到100％陽(yáng)性突變株為止。見附圖3、附圖4所示。
四、重組偽狂犬病毒株WKQ-001的生物學(xué)特性該突變毒株屬皰疹病毒科a皰疹病毒亞科豬皰疹病毒I型，病毒粒子呈圓形或橢圓形外觀，分子量約9.5×106道爾頓，其核蕊直徑為75nm，衣殼殼粒的長(zhǎng)度約12nm，寬9nm；位于細(xì)胞核內(nèi)無(wú)囊膜的病毒粒子直徑約110-150nm，位于胞漿內(nèi)帶囊膜的成熟病毒粒子的直徑約180nm。偽狂犬病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程可分為三個(gè)階段，即吸附、膜融合、核衣殼釋放等，以增殖方式傳代。偽狂犬病毒可在豬腎傳代細(xì)胞上增殖，常用培養(yǎng)基為含有新生牛血清的DMEM(pH7.0)生長(zhǎng)液。該病毒可在4℃短期保存，冷凍干燥后可在-70℃下長(zhǎng)期保存而不喪失活性。
表2 重組偽狂犬病毒株WKQ-001對(duì)乙醚、氯仿、胰蛋白酶敏感性試驗(yàn)

表2的數(shù)據(jù)表明了本發(fā)明的重組偽狂犬病毒株WKQ-001對(duì)乙醚、氯仿以及胰蛋白酶敏感。
表3 重組偽狂犬病毒株WKQ-001對(duì)酸堿的抵抗力

表3表明了本發(fā)明的重組偽狂犬病毒株WKQ-001在pH5.0-9.0之間保持穩(wěn)定。
表4 重組偽狂犬病毒株WKQ-001對(duì)56℃耐受性

表4顯示本發(fā)明的重組偽狂犬病毒株WKQ-001在56℃加熱，30min被完全滅活。
4、空斑試驗(yàn)表明，重組偽狂犬病毒株WKQ-001在gE及gI缺失后，所形成的空斑小于傳統(tǒng)的野毒株偽狂犬病毒Ea株所形成的空斑。重組偽狂犬病毒株WKQ-001接種豬腎傳代細(xì)胞PK-15，在連續(xù)接種15代時(shí)，仍可擴(kuò)出大小約1400bp的gE-/gI-片段，表明該重組偽狂犬病毒株WKQ-001遺傳穩(wěn)定，不會(huì)返強(qiáng)。見附圖55、偽狂犬病病毒Ea株gE-/gI-突變株(即WKQ-001)的檢測(cè)1)間接免疫熒光檢測(cè)缺失突變株WKQ-001用PBS溶液洗長(zhǎng)滿PK-15細(xì)胞的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板3次，自然風(fēng)干，以100％的甲醛固定5min(0.5mL/孔)，PBS溶液洗3次，吸干。每孔加入高免血清200uL，37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min。PBS洗1次，ddH2O洗5次。加入二抗，200uL/孔。37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min。。PBS洗3次，加入適量PBS，熒光顯微鏡觀察。見附圖6。
2)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)雜交檢測(cè)缺失突變株WKQ-001收獲接種PrV Ea gE-/gI-和PrVEa出現(xiàn)CPE的PK-15細(xì)胞，-20℃凍融3次，取凍融液3цl滴于硝酸纖維膜膜上，風(fēng)干后重復(fù)滴加二次。以鼠抗gE單克隆抗體為一抗，羊抗鼠HRP-IgG為二抗，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺顯色。PrV Ea打點(diǎn)后顯出深褐色，為陽(yáng)性；而PrV Ea gE-/gI-及PK-15細(xì)胞對(duì)照為陰性。這表明gE基因刪除后，WKQ-001不能表達(dá)gE糖蛋白。見附圖7。
五、重組偽狂犬病毒滅活疫苗的制備1、病毒的接種量及培養(yǎng)將偽狂犬病毒重組毒株WKQ-001接種于37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)24-36小時(shí)長(zhǎng)成的細(xì)胞單層，接毒量為生長(zhǎng)液的1/10。37℃旋轉(zhuǎn)吸咐1小時(shí)，加入適量的DMED培養(yǎng)基(含3％犢牛血清及青鏈霉素各100u/mL)，置37℃孵育。接種后24-48小時(shí)，當(dāng)細(xì)胞病變(CPE)達(dá)80％以上時(shí)，終止培養(yǎng)。
2、病毒的滅活將病變的病毒液反復(fù)凍融三次后，收取病毒液。經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)，且對(duì)PK-15細(xì)胞的TCID50≥10-6/0.1mL的病毒液混合，用甲醛作滅活劑，加入甲醛溶液充分混勻后，甲醛溶液的最終濃度為千分之八。置37℃作用36小時(shí)，然后放室溫(25℃左右)繼續(xù)作用12小時(shí)即成制苗用抗原。取滅活后的病毒液，接種于PK-15細(xì)胞單層3瓶，37℃培養(yǎng)觀察7天再盲傳二代，應(yīng)無(wú)CPE。
表5 甲醛對(duì)PRV滅活效果的檢查結(jié)果

表5中所列4批病毒懸液滅活后，接種細(xì)胞并盲傳二代，細(xì)胞未出現(xiàn)CPE，TCID50均為0，證明病毒滅活已完全徹底失去復(fù)制能力。
3、乳化工藝研究(1)油相的制備取10號(hào)獸用白油(中國(guó)浙江省杭州煉油廠生產(chǎn))94份(以毫升為單位)，加入硬脂酸鋁2份(以克為單位)，邊加邊攪拌，直到完全透明為止。再加入6份司本-80(以毫升為單位)，充分混勻后，按常規(guī)方法(例如121℃下滅菌30分鐘)高壓蒸氣滅菌備用。
(2)水相制備按體積計(jì)，在96份滅活的重組偽狂犬病毒液中加入4份滅菌吐溫-80，充分搖動(dòng)直到吐溫-80徹底溶解。
(3)乳化取6份油相放入膠體磨中，開動(dòng)機(jī)器慢速攪拌，同時(shí)徐徐加入3份水相，加完后以8000-10000rpm，乳化2.5分鐘，然后加入1份水相，繼續(xù)攪拌30秒，乳化成乳劑型偽狂犬病毒滅活疫苗。
六、偽狂犬病毒滅活疫苗技術(shù)指標(biāo)的檢驗(yàn)(1)物理性狀外觀 本品為乳白色均勻乳劑。
劑型 為油乳劑型 取一清潔吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，應(yīng)呈油滴狀，不擴(kuò)散。
粘度用出口內(nèi)徑為1.2mm吸管吸取疫苗1mL在25℃左右室溫下，令其垂直流出，在8秒鐘內(nèi)應(yīng)流出0.4mL以上判為合格。
(2)無(wú)菌檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》附錄169-171頁(yè)進(jìn)行，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
(3)安全檢驗(yàn) 接種16-18克左右的小白鼠5只，每只皮下注射0.3mL，觀察14天小鼠應(yīng)健活。接種1.5-2kg健康家兔2只，每只臀部皮下注射5mL，觀察14天應(yīng)健活且無(wú)不良反應(yīng)。
(4)效力檢驗(yàn)接種體重10-20kg左右的Prv抗體陰性、健康斷奶仔豬4頭，各頸部肌肉注射疫苗3mL。于注苗后28天采血，分離血清，按《中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》附錄315頁(yè)測(cè)定抗體中和指數(shù)，免疫豬血清中和指數(shù)應(yīng)≥316。
5甲醛含量測(cè)定 按《中國(guó)獸藥典》附錄177頁(yè)進(jìn)行，應(yīng)不超過規(guī)定量。
表6 本發(fā)明的偽狂犬病毒滅活疫苗各項(xiàng)指標(biāo)檢驗(yàn)

說明(1)本發(fā)明的基因缺失滅活疫苗統(tǒng)一制備成油乳劑(下同)(2)檢測(cè)依據(jù)《中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，二○○一年版七、疫苗的安全性、免疫效力、保護(hù)力、免疫期及保存期試驗(yàn)(一)本發(fā)明的基因缺失疫苗的安全性評(píng)價(jià)與生物試驗(yàn)1、小白鼠安全試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室制備的4批疫苗(20瓶/批，100毫升/瓶)隨機(jī)每批取3瓶，混合均勻后，接種18克左右的小白鼠10只，每只皮下注射0.3毫升，觀察14天。
2、新生仔豬安全試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室制備的4批疫苗(20瓶/批，100毫升/瓶)隨機(jī)每批取3瓶，混合均勻后，選擇健康1日齡初生仔豬，每批疫苗接種10頭豬，各肌肉注射2倍劑量4mL偽狂犬油乳劑疫苗，另設(shè)4頭留做空白對(duì)照，所有的仔豬在注射疫苗前及注苗后一周，每天測(cè)量2次體溫并觀察豬的生長(zhǎng)狀況、精神、食欲，共觀察14天。
3、斷奶仔豬安全試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室制備的4批疫苗(20瓶/批，100毫升/瓶)隨機(jī)每批取3瓶，混合均勻后，接種30日齡左右健康斷奶仔豬4頭，每頭接種6毫升，按2倍免疫劑量接種，另設(shè)4頭同齡豬做空白對(duì)照觀察14天。
4、妊娠母豬安全試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)室制備的4批疫苗(20瓶/批，100毫升/瓶)隨機(jī)每批取3瓶，混合均勻后，按2倍免疫劑量接種妊娠80天左右的母豬2頭，每頭肌肉注射10毫升。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照2頭，相同條件下飼養(yǎng)至產(chǎn)仔。觀察疫苗對(duì)妊娠母豬繁殖性能產(chǎn)生的影響及新生仔豬發(fā)育狀況。
其結(jié)果如表7所示表7 本發(fā)明的基因缺失滅活疫苗的安全檢驗(yàn)結(jié)果

小白鼠在接種后均未出現(xiàn)不良反應(yīng)。1日齡初生仔豬、斷奶仔豬加倍劑量接種，精神狀態(tài)良好，食欲正常，接種部位無(wú)腫脹發(fā)熱等不良反應(yīng)。同條件下的陰性對(duì)照組也無(wú)不良反應(yīng)，加倍劑量注射妊娠80天左右的母豬，均未發(fā)生流產(chǎn)，按期正常分娩，不影響母豬妊娠，對(duì)母豬繁殖性能不產(chǎn)生影響。所產(chǎn)仔豬發(fā)育正常。接種部位無(wú)發(fā)熱腫脹等不良反應(yīng)，同條件下飼養(yǎng)的2頭對(duì)照妊娠母豬無(wú)異常臨床反應(yīng)。
(二)疫苗的效力檢驗(yàn)1、后備母豬免疫效力試驗(yàn)將4批疫苗隨機(jī)每批取3瓶，混合均勻后，未經(jīng)配種后備母豬4頭，頸部肌肉注射制品5毫升，另設(shè)4頭作為非免疫對(duì)照，分別于免疫前、免疫后14、21、28天采血，分離血清作微量中和試驗(yàn)，檢測(cè)Prv中和抗體指數(shù)。
2、妊娠母豬免疫效力試驗(yàn)將4批疫苗隨機(jī)每批取3瓶，混合均勻后，選經(jīng)產(chǎn)母豬4頭，于配種前每頭肌注2毫升，另設(shè)4頭為非免疫對(duì)照。到妊娠70天以同樣方法和劑量加強(qiáng)免疫一次，分別采集免疫前、免疫后28天、56天、80天，加強(qiáng)免疫后14天的血清供檢測(cè)抗體用。于加強(qiáng)免疫2周后攻毒，每頭豬經(jīng)耳靜脈注射10-7TCID50/0.1mL Prv鄂A株強(qiáng)毒2mL，滴鼻2mL。到預(yù)產(chǎn)期前即攻毒后14天將免疫豬及對(duì)照豬剖殺，檢查每窩胎兒發(fā)育狀況。
3、斷奶仔豬免疫效力試驗(yàn)將4批疫苗隨機(jī)每批取3瓶，混合均勻后，將疫苗以3毫升劑量分別注射25日齡健康斷奶仔豬各4頭，設(shè)空白對(duì)照4頭。14天后攻毒，每頭豬經(jīng)耳靜脈注射10-7TCID50/0.1mL Prv強(qiáng)毒2mL，滴鼻1mL進(jìn)行攻擊，觀察21天，計(jì)算保護(hù)率。
4、初生仔豬免疫效力試驗(yàn)將4批疫苗隨機(jī)每批取3瓶，混合均勻后，選用健康1日齡初生仔豬4窩，每窩10頭豬，4批疫苗分別注射1窩中的8頭仔豬，各注射2mL，留2頭做為未免疫對(duì)照。于免疫后14天各免疫豬連同對(duì)照豬經(jīng)耳靜脈注射10-6TCID50/0.1mL Prv鄂A株強(qiáng)毒1mL，滴鼻1mL攻毒，觀察21天計(jì)算保護(hù)率。結(jié)果如表8-所示4.1后備母豬表8 本發(fā)明的滅活疫苗對(duì)后備母豬免疫效力試驗(yàn)結(jié)果

說明本表的疫苗的批號(hào)為20050501-20050530，共4個(gè)批次批號(hào)為20050501-20050530 4批疫苗分別免疫后備母豬，免疫14天后，中和抗體指數(shù)升至218-398。21-28天時(shí)，中和抗體指數(shù)最高達(dá)1412。
4.2妊娠母豬免疫28天后，試驗(yàn)豬中和抗體指數(shù)高者可達(dá)1412，免疫后80天，血清中和抗體指數(shù)仍可達(dá)1000，以相同劑量加強(qiáng)免疫后14天，血清中和抗體指數(shù)高者可達(dá)到3548。攻毒后14天剖殺時(shí)血清中和抗體指數(shù)低者可為1258，高者可達(dá)3548。4批疫苗免疫16頭母豬剖殺統(tǒng)計(jì)胎兒數(shù)，共取胎151頭，健活胎為145頭，死胎及弱胎共6頭。4頭非免疫對(duì)照豬共懷胎38頭，健活胎僅2頭，死胎及弱胎共36頭。
表9 本發(fā)明的滅活疫苗對(duì)妊娠母豬免疫效力試驗(yàn)結(jié)果


4.3斷奶仔豬免疫后14天攻毒，仔豬保護(hù)數(shù)均為4/4，保護(hù)率為100％。在觀察期間，免疫豬無(wú)任何不良反應(yīng)，而未免疫對(duì)照仔豬在攻毒后2天有3頭豬體溫升高分別為40℃、41℃、41.8℃，精神沉郁，發(fā)抖，嘔吐、腹瀉。其中1頭對(duì)照豬有神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)失調(diào)，于攻毒后7天死亡；3頭對(duì)照豬在觀察期間，癥狀逐漸減輕，最后恢復(fù)正常。
表10 本發(fā)明的滅活疫苗對(duì)斷奶仔豬免疫效力試驗(yàn)結(jié)果

4.4初生仔豬于免疫后，14天后攻毒，在攻毒后觀察期內(nèi)，有1頭在攻毒后24-72小時(shí)，體溫升高到40.5℃-41.8℃，其他免疫豬攻毒后均無(wú)不良反應(yīng)。總保護(hù)率為90.6％。8頭不免疫對(duì)照豬于攻毒后24小時(shí)，體溫升高至40.5℃-42℃，精神不振，發(fā)抖，嘔吐及腹瀉，其中有6頭分別在攻毒后36-50小時(shí)死亡。死亡豬剖檢病變表現(xiàn)為上呼吸道粘膜及扁桃體出血，肺水腫，腎臟有針尖大的出血點(diǎn)，腦膜充血、出血、水腫。另2頭對(duì)照豬于攻毒后第10天癥狀減輕，體溫有所下降，但在觀察期內(nèi)仍保持40℃左右的微熱。
表11 本發(fā)明的滅活疫苗對(duì)初生仔豬免疫效力試驗(yàn)結(jié)果

5母豬免疫后的仔豬母源中和抗體水平的檢測(cè)挑取一頭配種前注射疫苗2mL，產(chǎn)前一個(gè)月加強(qiáng)免疫一次(2mL)，產(chǎn)前2天采血測(cè)其中和抗體為1∶16。而產(chǎn)后第一天乳汁中的抗體達(dá)到1∶64-128。共產(chǎn)仔11頭，挑其中7頭仔豬在不同日齡采血，進(jìn)行了抗體水平的完整檢測(cè)，其結(jié)果見表表12 本發(fā)明的滅活疫苗對(duì)母豬免疫后的仔豬母源中和抗體水平的檢測(cè)


根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，經(jīng)疫苗免疫母豬的初乳乳汁抗體水平均高出母豬血清中的抗體水平，因而測(cè)得的新生仔豬血清中的抗體水平也較高。但隨著日齡的增大，抗體水平下降也較快，到30日齡已經(jīng)較低了，因此在臨床，將仔豬偽狂犬病的免疫定在斷奶時(shí)進(jìn)行首免是較為合適的。
(三)、疫苗的免疫期1豬免疫后14天開始出現(xiàn)抗體，中和抗體指數(shù)雖未達(dá)到陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)316，但與非免疫對(duì)照豬只相比已明顯上升。免疫后28天時(shí)，5批疫苗中和抗體指數(shù)均達(dá)到398以上，在免疫35-42天達(dá)到高峰，以后抗體水平逐漸下降，到180天時(shí)抗體水平等于或接近臨界值。根據(jù)抗體水平消長(zhǎng)情況，本疫苗的免疫期作為預(yù)防用定為六個(gè)月。對(duì)妊娠母豬，為了初乳中有高水平的母源抗體來(lái)保護(hù)新生仔豬，建議臨產(chǎn)前一個(gè)月加強(qiáng)免疫一次，完全可以保護(hù)仔豬到斷奶。對(duì)育肥用的仔豬斷奶時(shí)注射一次，直到出欄。對(duì)種用的仔豬斷奶時(shí)注射一次，隔4-6周再加強(qiáng)免疫一次，作為基礎(chǔ)免疫，以后每半年免疫一次，具體結(jié)果見下表。
表13 種豬初次免疫后的中和抗體的檢測(cè)

2種豬二次免疫后抗體水平測(cè)定結(jié)果在一次免疫后42天左右時(shí)抗體水平達(dá)到高峰，因而于42天時(shí)進(jìn)行第二次免疫，免疫后14天抗體水平明顯上升，到180天時(shí)，抗體水平明顯高于一次免疫，而且免疫后抗體持續(xù)時(shí)間也較長(zhǎng)，具體結(jié)果見下表。
表14 種豬二次免疫后的中和指數(shù)


(四)、疫苗的保存期疫苗存放在4-8℃保存12個(gè)月及18個(gè)月；20-25℃保存1個(gè)月及3個(gè)月，以3mL使用劑量對(duì)1月齡斷奶仔豬進(jìn)行免疫，分別在免疫后21天和28天采血，檢測(cè)其中和抗體水平，均在316-398之間，產(chǎn)生抗體的水平均在正常范圍內(nèi)，并用強(qiáng)毒攻擊，豬只全部正常，充分證實(shí)在上述保存條件和保存期內(nèi)，疫苗質(zhì)量沒有變化。因而起草標(biāo)準(zhǔn)定為4-8℃保存12月，20-25℃保存1個(gè)月表15 本發(fā)明的滅活疫苗的保存期試驗(yàn)(以斷奶仔豬為例)

如如表15所示，本發(fā)明的滅活疫苗在4-8℃保存12個(gè)月和在4-8℃保存15個(gè)月后，分別免疫動(dòng)物(例如豬、小白鼠、兔等)，28天時(shí)所產(chǎn)生的中和抗體指數(shù)差異不顯著(P＞0.05)，說明本發(fā)明的滅活疫苗在4-8℃可以保存12-15個(gè)月；在20-25℃保存1個(gè)月和在20-25℃保存3個(gè)月后，28天時(shí)所產(chǎn)生的中和抗體指數(shù)差異顯著(0.01＜P≤0.05)。本發(fā)明疫苗在20-25℃可保存1個(gè)月。
權(quán)利要求
1.一種重組的偽狂犬病毒Pseudorabies virus毒株WKQ-001，保藏在CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC-V200511。
2.權(quán)利要求1所述的重組的偽狂犬病毒毒株，其特征在于1)所說的毒株缺失了gE、gI基因；2)所說的毒株不含外源基因。
3.包含權(quán)利要求1或2所述的重組偽狂犬病毒毒株的基因缺失疫苗。
4.權(quán)利要求3所述的基因缺失疫苗，其特征在于，所述的基因缺失疫苗是滅活疫苗。
5.權(quán)利要求3或4所述的基因缺失疫苗，按份數(shù)計(jì)的配比為A、水相3份每一份水相按96份用權(quán)利要求1或2所述的偽狂犬病毒株制備的滅活的偽狂犬病毒液加4份滅菌吐溫80配制；B、油相6份每一份油相按以毫升計(jì)的94份10號(hào)獸用白油，加入以克計(jì)的2份硬脂酸鋁和以毫升計(jì)的6份司本-80比例配制，和C、混合上述A和B所述的水相和油相。
6.權(quán)利要求1或2所述的重組偽狂犬病毒株在制備偽狂犬病毒基因缺失疫苗中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的基因缺失疫苗在防制偽狂犬病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組的偽狂犬病毒Pseudorabies virus，PrV)基因工程株WKQ－001，保藏號(hào)為CCTCC－V200511的構(gòu)建以及利用該毒株制備的偽狂犬病毒基因缺失標(biāo)志滅活疫苗。本發(fā)明的毒株缺失了PrV的糖蛋白基因gI、gE，因而可以作為標(biāo)志基因，用于鑒別和診斷人工免疫豬及自然感染豬。本發(fā)明還涉及重組偽狂犬病毒株和基因缺失滅活疫苗的應(yīng)用。與國(guó)外同類疫苗相比，其針對(duì)性更強(qiáng)，更加適合我國(guó)偽狂犬病的流行豬群；本發(fā)明的毒株來(lái)源于感染的豬，其滅活疫苗的安全性和保護(hù)性更適合于豬偽狂犬病的預(yù)防。同時(shí)本發(fā)明的基因工程株不含任何外源基因，因而具有更高的生物安全性。
文檔編號(hào)A61K39/12GK1940063SQ20051001951
公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者金梅林, 張松林, 宋云峰, 方六榮, 陳煥春 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)