一種IdeS蛋白酶、其制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物酶技術領域，具體設及一種IdeS蛋白酶、其制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 免疫球蛋白G降解酶IdeS(immunoglubulinG-degradingenzymeof Str巧tococ州spyogenes,Ide巧是由人類致病菌釀脈鏈球菌（Str巧tococ州spyogenes) 產(chǎn)生并分泌至胞外的一種半脫氨酸水解酶。該蛋白酶具有極高的底物特異性，僅識別IgG， 在抗體下較鏈區(qū)的特定位點進行酶切，使IgG水解為完整的F(ab') 2片段和Fc片段。除了 人源IgG，IdeS還可W切割多種動物來源的IgG，如小鼠、家兔、恒河猴、羊W及人動物嵌合 IgG等。IdeS具有獨特的酶活特異性，可W作為工具酶應用于IgG的F油'和F(油'）2亞單 位制備、抗體藥物或者抗體融合蛋白藥物的結構表征分析。
[0003] 到目前的研究發(fā)現(xiàn)，IdeS作用底物只有IgG類抗體，而且與胃蛋白酶和木瓜蛋白 酶不同，IdeS切割位點專一性高，產(chǎn)物均一，酶切IgG后可W獲得完整的F(油'）2片段和Fc 片段，其中，與抗原結合的F(ab' )2片段分子量大小約為lOOkDa，F(xiàn)c片段的分子量大小為 25kDa。隨著抗體藥物的發(fā)展及表征鑒定的常態(tài)化，蛋白酶IdeS的用量越來越大，原有的宿 主菌提取純化已經(jīng)不能滿足該酶的需求。
[0004] 許靜等人發(fā)表的"半脫氨酸蛋白酶IdeS的原核表達、純化及活性鑒定"，中國生物 工程雜志，2014, 34(10) :8-14,利用原核表達載體Pgex-4T-2構建了一種新的雙標簽表達 系統(tǒng)，對IdeS進行了高效重組表達。但是該酶的重組表達亦具有一定的局限，其表達量不 高，較難大規(guī)模應用。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明為了克服上述缺陷，本發(fā)明提供了一種IdeS蛋白酶、其制備方法及應用， 該IdeS蛋白酶能夠在大腸桿菌和/或畢赤酵母中可溶性高效表達，表達量高，仍具有IdeS 蛋白酶的特性。
[0006] 為達到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用W下技術方案：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供了一種IdeS蛋白酶，所述IdeS蛋白酶的氨基酸序列包含如 SEQIDNO. 1所示的片段，所述片段的序列如下： 陽00 引 DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNG邸DLLCGA ATAG醒L冊W抑QN邸QIKRYL邸HP邸QKINFNGEQM抑VKEAIDTKN朋LDSKLFEYF邸KAFP化STKHLGV FPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGS邸PRGGI抑AVFTRGDQS化LTS畑DFKEKNLKEISDLIK邸LTEG KALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNG化KAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQ VLGLFTLSTGQDSWNQTNHHHH皿SSG。
[0009] 本發(fā)明中，通過釀脈鏈球菌現(xiàn)有基因數(shù)據(jù)庫，通過基因工程手段將IdeS蛋白酶進 行了改造，改造后的IdeS蛋白酶可在大腸桿菌和/或畢赤酵母中可溶性高效表達，仍具有IdeS蛋白酶的特異性酶活，可W特異性的酶切IgG抗體獲得所要的抗體片段，IdeS作用底 物只有IgG類抗體，而且與胃蛋白酶和木瓜蛋白酶不同，IdeS切割位點專一性高，產(chǎn)物均 一，酶切IgG后可W獲得完整的F(油'）2片段和Fc/2片段，且純化后的IdeS蛋白酶可進行 固定，W利于工業(yè)生產(chǎn)上的固定化生產(chǎn)，使得IdeS蛋白酶作為一種特異、有效的酶制劑，可 局效、反復使用。
[0010] 優(yōu)選地，所述IdeS蛋白酶含有319個氨基酸。
[0011] 優(yōu)選地，所述IdeS蛋白酶的核巧酸序列包含如SEQIDNO. 2-3所示的片段， 陽01引所述SEQIDNO. 2所述片段的序列如下：
[0016] 第二方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的IdeS蛋白酶的制備方法，所述方 法包括如下步驟：
[0017] (1)通過基因合成技術獲得所述IdeS蛋白酶的核巧酸序列，并將IdeS蛋白酶的核 巧酸序列重組到表達載體中，構建重組載體；
[0018] (2)將重組載體轉(zhuǎn)化到表達菌中，得到含有所述IdeS蛋白酶核巧酸序列的陽性表 達菌，對所述陽性表達菌擴大發(fā)酵培養(yǎng)，誘導所述IdeS蛋白酶蛋白表達。
[0019] 優(yōu)選地，所述IdeS蛋白酶的核巧酸序列包含如SEQIDNO. 2-3所示的片段。
[0020] 優(yōu)選地，步驟（2)所述的表達菌為大腸桿菌和/或畢赤酵母。
[002U優(yōu)選地，所述SEQIDNO. 2所示的片段在大腸桿菌中可溶性表達。 陽02引優(yōu)選地，所述SEQ ID NO. 3所示的片段在畢赤酵母中可溶性表達。 陽02引優(yōu)選地，步驟似所述的發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為30-37°C，例如可W是30°C、3rC、 32°(：、33°(：、34°(：、35°(：、36°(：或37°(：。
[0024] 優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溶氧量為20-30%，例如可^是20%、21%、22%、23%、 24%、25%、26%、27%、28%、29% 或 30%。 陽0巧]優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)的抑為6. 8-7. 2,例如可W是6. 8、6. 9、7、7. 1或7. 2。
[00%] 優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)中通過底物限制流加及好氧深層發(fā)酵培養(yǎng)12-7化，例如可 U是 12h、13h、14h、15h、18h、20h、22h、25h、26h、28h、30h、35h、38h、40h、42h、45h、48h、50h、 5化、5化、60h、6化、6化、6化、70h或72h，優(yōu)選為15-6化加入誘導劑誘導所述IdeS蛋白酶蛋 白表達。
[0027] 優(yōu)選地，所述陽性表達菌經(jīng)過驗證正確后，進行擴大工業(yè)化生產(chǎn)IdeS蛋白酶。
[0028] 第Ξ方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的IdeS蛋白酶在免疫球蛋白G降解中 的應用。 陽029] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0030] (1)本發(fā)明制備的IdeS蛋白酶可在大腸桿菌和/或畢赤酵母中可溶性高效表達， 表達量高，仍具有IdeS蛋白酶的特異性酶活，可W特異性的酶切IgG抗體獲得所要的抗體 片段，且能進行固定化，W利于后期的工業(yè)化應用；
[0031] (2)本發(fā)明制備的IdeS蛋白酶可通過工業(yè)化進行大規(guī)模生產(chǎn)，使得IdeS蛋白酶的 大量生產(chǎn)成為可能，為IdeS的應用奠定了基礎。
【附圖說明】
[0032] 圖1為本發(fā)明構建的大腸桿菌表達載體-IdeS的質(zhì)粒示意圖；
[0033] 圖2為本發(fā)明構建的酵母表達載體-IdeS的質(zhì)粒示意圖；
[0034] 圖3為本發(fā)明表達載體-IdeS在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物及其純化產(chǎn)物，其中，1-蛋 白marker, 2-誘導前表達產(chǎn)物，3-誘導比后表達產(chǎn)物，4-誘導化后表達產(chǎn)物，5-誘導化 后表達產(chǎn)物；
[0035] 圖4為本發(fā)明制備的IdeS蛋白酶對免疫球蛋白G的酶切效果，其中，1-蛋白 marker, 2-完整的免疫球蛋白IgG，3-免疫球蛋白IgG使用IdeS蛋白酶酶切后產(chǎn)生F(油'）2 片段和Fc/2片段。
【具體實施方式】
[0036] 為更進一步闡述本發(fā)明所