專利名稱：蛋白HtpX-P3及應(yīng)用其提高酶熱穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于提高酶的熱穩(wěn)定性的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種融合蛋白HtpX-P3，及利用 該蛋白增強(qiáng)酶熱穩(wěn)定性的方法。該融合蛋白序列包含來源于嗜熱古菌硫礦硫化葉菌 (6W/b7otos so /^aric"s)中的一種熱激蛋白基因力tpJ-3所表達(dá)的蛋白序列。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)生物技術(shù)和酶工程的不斷發(fā)展，酶的應(yīng)用越來越普遍，酶作為生物催化劑具有 催化效率高、催化專一性強(qiáng)、作用條件溫和等顯著特點(diǎn),但是在酶作為蛋白，普遍存在熱穩(wěn) 定性差的特點(diǎn)。這使得一些工業(yè)生產(chǎn)不得不在反應(yīng)器中增加冷卻系統(tǒng)，增加了工業(yè)成本和 各種代謝物對(duì)產(chǎn)物的污染。另外，酶的低熱穩(wěn)定性使得商業(yè)酶在分離純化和包裝運(yùn)輸過程 中都容易失活。因此，酶的熱穩(wěn)定性是酶生產(chǎn)和工業(yè)催化中需要解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。
目前，已經(jīng)有很多方法應(yīng)用于提高酶的熱穩(wěn)定性。包括酶分子的化學(xué)修飾、理性設(shè)計(jì) 以及定向進(jìn)化等。應(yīng)用最廣泛的酶化學(xué)修飾技術(shù)是利用大分子或小分子修飾劑對(duì)酶分子的 側(cè)鏈進(jìn)行改造，以獲得具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的蛋白。利用化學(xué)修飾技術(shù)已經(jīng)成功地使一些酶 的熱穩(wěn)定性得到顯著的提高，所用到的修飾劑包括大分子物質(zhì)如糖類等以及一些小的化學(xué) 分子 (Davis BG, 2G03, Chemical modification of biocatalysts. Curr Opin Biotechnol， 14:379)。酶分子的理性設(shè)計(jì)是指在己知酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，有目 的地改變酶的某一活性基團(tuán)或氨基酸殘基，從而使酶產(chǎn)生新的性狀。利用理性設(shè)計(jì)提高酶 的熱穩(wěn)定性，主要以目標(biāo)酶蛋白的氨基酸序列與一些高溫酶蛋白序列的同源性作為氨基酸 取代的標(biāo)準(zhǔn)，由于多數(shù)情況下對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)制沒有完全了解，所以，并非所 有的理性設(shè)計(jì)都能取得預(yù)期的結(jié)果(Uwe T Bornscheuer等，2001， Improved biocatalysts by directed evolution and rational protein design. Current Opinion in Chemical Biology, 5:137 - 143)。酶的體外定向進(jìn)化(簡(jiǎn)稱定向進(jìn)化)是近些年興起的改造酶分子的 新策略，它是由兩個(gè)相互獨(dú)立的關(guān)鍵技術(shù)組成。 一個(gè)是隨機(jī)基因文庫(kù)的構(gòu)建,另一個(gè)是特定 酶(特別是增加催化活性、增強(qiáng)選擇性或穩(wěn)定性)的篩選策略。目前，已經(jīng)通過定向進(jìn)化技
3術(shù)得到了一些熱穩(wěn)定性得到顯著提高的酶(G. J.Williamsa等，2004， Directed evolution of enzymes for biocatalysis and the life sciences. Cellular and Molecular Life Sciences, 61:3034 - 3046)。
提高酶熱穩(wěn)定性的方法還包括固定化和添加保護(hù)劑。固定化以后的酶，其中一些作用 溫度可以達(dá)到80'C以上(Cesar Mateo等，2007， Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques. Enzyme and Microbial Technology, 40:1451 - 1463)。由于方法簡(jiǎn)單、成本低下和易于操作等多方面原因，添加 保護(hù)劑是目前工業(yè)上提高酶穩(wěn)定性的最重要手段(Manning MC等，1995， Approaches for increasing the solution stability of proteins. Biotechnology and Bioengineering， 48(5) :506-512)，大部分商業(yè)酶成品中都添加有一定的保護(hù)劑以延緩酶的失活。保護(hù)劑的 成分包括一些單糖、多糖類物質(zhì)以及一些有機(jī)小分子物質(zhì)等。
熱激蛋白(heat shock proteins,簡(jiǎn)稱Hsps)廣泛存在于包括真核生物、細(xì)菌和古菌 在內(nèi)的各種生物體內(nèi)，根據(jù)分子量的不同分為不同的類別，其中分子量為35kDa以下的一 類稱為小分子量熱激蛋白(small heat shock proteins, sHsps)。這類蛋白是最常見的分 子伴侶，廣泛存在于所有生物體內(nèi)。
sHsps具有廣泛的功能，目前對(duì)它們的研究主要它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的功能，以及它們的分 子伴侶功能上。例如，1999年，AlvaroSoto等的實(shí)驗(yàn)表明這種作用的機(jī)制是sHsp可以結(jié) 合到一些細(xì)胞質(zhì)蛋白上，維持它們的活性結(jié)構(gòu)，使其保持在可發(fā)揮生物活性的可溶性狀態(tài)。 他們?cè)诖竽c桿菌中表達(dá)來源于植物的CsHspl7.5蛋白，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細(xì)胞的抗熱能力明顯 提高。2007年，楊等在畢赤酵母中表達(dá)HsP20，發(fā)現(xiàn)可以提高其抗熱脅迫的能力。另外， sHsps可以在體外發(fā)揮分子伴侶的功能，維持蛋白的生物活性。，其作用機(jī)制可能是在蛋白 失活溫度下，sHsps結(jié)合到目標(biāo)蛋白上，形成穩(wěn)定的中間體，維持蛋白的活性結(jié)構(gòu)。sHsps 可以阻止熱脅迫以及其他逆境條件下蛋白的聚合作用，2006年，Szabolcs Bellyei等利用 大腸桿菌表達(dá)來源于人的Hspl6.2，得到的重組蛋白可以抑制醛縮酶以及3-磷酸甘油醛脫 氫酶的聚合。2007年，Denis I. Markov等發(fā)現(xiàn)Hsp27可以抑制熱脅迫下肌球蛋白SI亞基 的聚合作用。在一些情況下，sHsp可以幫助解體后的蛋白重新折疊，獲得有生物活性。2000 年，Zsolt Torok等研究了一種sHsp，該蛋白可以作為分子伴侶結(jié)合到熱變性的豬心臟線 粒體蘋果酸脫氫酶上，形成一種穩(wěn)定的中間結(jié)構(gòu)，利于其他的分子伴侶與酶作用，從而重 新折疊成活性結(jié)構(gòu)。2001年，Keisuke Usui等研究了嗜熱古菌r/ arawcocc"s印.strain KS-1的一種小熱激蛋白，發(fā)現(xiàn)該蛋白可以形成同源多聚體，并對(duì)由熱引起的豬心臟檸檬酸鹽合成酶的聚合起抑制作用，同時(shí)對(duì)酸變性的綠色熒光蛋白的重折疊起輕微促進(jìn)作用。另 夕卜，Pongpan Uks纖lamai等發(fā)現(xiàn)嗜熱古菌尸， 的sHsp可以在體外抑
制由熱脅迫引起的大腸桿菌蛋白以及牛谷氨酸脫氫酶的聚合作用。
sHsp具有一些細(xì)胞水平上的功能，以及分子伴侶的能力，但是它們?cè)诿腹I(yè)中的應(yīng)用， 尤其是利用它們直接加入酶制劑中以提高酶的熱穩(wěn)定性尚未見報(bào)道報(bào)道。另外熱激蛋白的 功能具有多樣性，給定一個(gè)熱激蛋白，并不能預(yù)知它的具體功能。在現(xiàn)有的文獻(xiàn)中，也沒
有3基因的具體功能研究報(bào)道，更沒有利用該基因提高酶熱穩(wěn)定性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可用于提高酶熱穩(wěn)定的含有HtpX-P3 融合蛋白表達(dá)載體pSEPHLKl的大腸桿菌菌株BL21 (DE3)，并提供由該菌株表達(dá)的蛋白 HtpX-P3。
本發(fā)明另一目的是提供應(yīng)用蛋白HtpX-P3提高蛋白酶熱穩(wěn)定性的方法，以及應(yīng)用蛋白 HtpX-P3提高限制性內(nèi)切酶熱穩(wěn)定性的方法。
本發(fā)明用到的嗜熱古菌硫礦硫化葉菌，其基因組序列已經(jīng)測(cè)序，生長(zhǎng)溫度為85'C，用 于本發(fā)明的力*/-3基因的全序列可以在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中得到，它在Genbank核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中 為硫礦硫化葉菌基因組(NC—002754)的一部分，即從2369804到2370178堿基，它所編碼 的蛋白序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)為NP—343935， GI號(hào)為15899330。雖然硫礦硫化葉 菌的基因組序列已經(jīng)測(cè)定并發(fā)表，3的全序列已經(jīng)可以在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中得到，但 是，關(guān)于該基因功能的描述還是模糊的。
本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
如圖1所示，本發(fā)明利用來自嗜熱古菌硫礦硫化葉菌的熱激蛋白基因力tpiS ，構(gòu)建融 合蛋白HtpX-P3載體，將該HtpX-P3載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化和純化， 得到的蛋白可作為保護(hù)劑，以溶液狀態(tài)加入酶中，提高酶在較高溫度下的耐熱性。具體步
驟如下
第一步，釆用PCR技術(shù)，從嗜熱古菌硫礦硫化葉菌的基因組DNA中分離得到熱激蛋白 基因力tpJJ，并對(duì)其序列進(jìn)行測(cè)序分析。
第二步，構(gòu)建融合蛋白HtpX-P3的表達(dá)載體pSEPHLKl。
第三步，將上一步得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，該菌株是一種含有 HtpX-P3融合蛋白表達(dá)載體pSEPHLKl的大腸桿菌菌株。轉(zhuǎn)入該表達(dá)載體的大腸桿菌菌株已經(jīng)于2008年6月23日保藏在CCTCC，保藏號(hào)為 CCTCCM 208093。
第四步，蛋白HtpX-P3表達(dá)條件的優(yōu)化，通過對(duì)培養(yǎng)時(shí)間，誘導(dǎo)溫度、時(shí)間等條件的 摸索和優(yōu)化，基本上處于可溶狀態(tài)。
第五步，蛋白HtpX-P3的純化，表達(dá)產(chǎn)物的超聲裂解液經(jīng)鎳柱(Ni2+ chelating s印harose)親和層析后，得到純度較高的蛋白，經(jīng)過進(jìn)一步的G50凝膠柱層析后，得到純 度高達(dá)90%以上的目標(biāo)蛋白。該蛋白HtpX-P3由含有表達(dá)載體pSEPHLKl的大腸桿菌菌株 BL21(DE3)表達(dá)出來。
第六步，以第五步得到的蛋白作為保護(hù)劑，以溶液狀態(tài)加入菠蘿蛋白酶或限制性內(nèi)切 酶^boRI的酶液中，提高酶在較高溫度下的耐熱性。
具體是一種應(yīng)用蛋白HtpX-P3提高蛋白酶熱穩(wěn)定性的方法，每1單位蛋白酶加入蛋白 HtpX-P3或其融合蛋白0.7-1.7ug。所述的酶優(yōu)選為菠蘿蛋白酶。
一種應(yīng)用蛋白HtpX-P3提高限制性內(nèi)切酶熱穩(wěn)定性的方法，每1單位限制性內(nèi)切酶加 入蛋白HtpX-P3或其融合蛋白0. 5-1. 3ng。所述的酶優(yōu)選為限制性內(nèi)切酶fcoRI。
相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
本發(fā)明提供一種小分子量熱激蛋白作為保護(hù)劑，添加到酶中提高酶的熱穩(wěn)定性。提供 的利用蛋白HtpX-P3作為保護(hù)劑添加到酶中，提高酶熱穩(wěn)定性的方法簡(jiǎn)單方便，所涉及的 熱激蛋白基因是應(yīng)用于提高蛋白熱穩(wěn)定性的一個(gè)新的基因，因此本方法是該領(lǐng)域的一個(gè)新 方法。利用本方法對(duì)菠蘿蛋白酶和限制性內(nèi)切酶5boRI進(jìn)行改造，可以明顯提高它們?cè)?0 t:下的熱穩(wěn)定性。由于菠蘿蛋白酶和限制性內(nèi)切酶^boRI屬于性質(zhì)完全不同的兩種酶，熱 激蛋白HtpX-P3對(duì)兩者都能起到作用，說明它的作用不具有專一性，所以HtpX-P3有希望 作為一種酶的通用保護(hù)劑，這克服了利用理性設(shè)計(jì)，基因工程等方法中必須在對(duì)目標(biāo)酶十 分了解的弊端，以及定向進(jìn)化方法的工作量巨大的弊端。


圖1是本發(fā)明提供的以重組蛋白HtpX-P3為保護(hù)劑提高酶熱穩(wěn)定性方法的流程圖； 圖2是含基因力tpJ-3的表達(dá)質(zhì)粒pSEPHLKl的結(jié)構(gòu)示意圖；' — 圖3是本發(fā)明通過純化后最后得到的重組蛋白HtpX-P3的SDS-PAGE電泳圖。 圖4是本發(fā)明實(shí)施例5中重組蛋白HtpX-P3對(duì)菠蘿蛋白酶6(TC下熱穩(wěn)定性的影響結(jié)果； 圖5是本發(fā)明實(shí)施例6中重組蛋白HtpX-P3對(duì)限制性內(nèi)切酶^boRI6(TC下熱穩(wěn)定性的影響結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制 本發(fā)明。
實(shí)施例1:從硫礦硫化葉菌的基因組DNA中PCR擴(kuò)增得到Z^pJ-3基因及其序列的測(cè)定 和分析
根據(jù)對(duì)硫礦硫化葉菌基因組序列的預(yù)測(cè)，以及相關(guān)sHsp基因的比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)一對(duì)引
物
HtpX-31 5'TCTA GGATCC ATA GGTACC TGA CTGCAG ATGATGAATGTGATAATGAG HtpX-32 5' AAAA GAATTC ATA GGTACC TTA CTGCAG ATTATTCTATTCTGATTGAG 以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為模板2ul， dNTPs lul， primers 0. 5ul+0. 5ul, probest Taq 0. 5ul'buffer 5ul'ddH20 41. 5ul, total 50ul; PCR反應(yīng)程序 為94°C 2min; 94。C變性45秒，53。C復(fù)性45秒，72。C延伸2分鐘，循環(huán)30次；72。C延 伸5分鐘；4'C終止反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在預(yù)期大小432bp處得到一條帶。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，得到的序列(432bp)如SEQ.ID.NOl所示。
粗體部分為它的編碼序列，編碼的蛋白序列(124aa)如SEQ.ID.N02所示。 對(duì)該蛋白序列的分析表明，該蛋白屬于小熱激蛋白hsp20家族中的一員，定位于基因 組的2369804.. 2370178。將該蛋白序列與古菌中其他同源序列的比較發(fā)現(xiàn)，它具有小分子 量熱激蛋白特有的一些保守的氨基酸位點(diǎn)。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有a-crystallin保守結(jié) 構(gòu)域。
實(shí)施例2:融合蛋白htpX-P3的表達(dá)載體的構(gòu)建
將實(shí)施例1中得到的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后純化的產(chǎn)物，克隆到載體pET-28a (來源于Novagen公司)上，構(gòu)建成為表達(dá)載體pSEPHLKl。該表達(dá)載體用尸Wl酶切鑒定， 得到一條400bp左右的帶和一條5. 3k大小的帶，與預(yù)期結(jié)果一致。
表達(dá)載體pSEPHLKl的物理圖譜如圖2所示，其大小為5781bp，以T7為啟動(dòng)子，在目 標(biāo)基因力^JJ的C端有編碼6XHis標(biāo)簽的序列，使目標(biāo)蛋白可'以通過鎳柱親和層析純化。 表達(dá)載體pSEPHLKl經(jīng)過尸"I完全酶切后，可得到381bp的片段，即為熱激蛋白基因力^J-3 的編碼序列。本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒的復(fù)制方法，CaCh法在ADH5 a或BL21 (DE3)菌株中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，用含有卡那霉素(25pg/ml)的LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化細(xì)菌，堿法提取質(zhì)粒的方法，都 參照 Sambrook (Sambrook, et al., 1989, Molecular cloning. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA)。
實(shí)施例3:蛋白HtpX-P3的表達(dá)
將pSEPHLKl轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，該大腸桿菌BL21(DE3)由Novagen公司提供。 BL21 (DE3)菌株中包含pSEPHLKl蛋白表達(dá)所需的T7 RNA聚合酶基因，可以用于外源基因在 大腸桿菌中的表達(dá)?；蚬こ叹暳呀馍锨逡航?jīng)12%SDS-PAGE電泳分析表明，菌體誘導(dǎo) 后有明顯的特異表達(dá)產(chǎn)物帶，分子量與用軟件Clone5預(yù)測(cè)的重組蛋白的分子量理論值16. 1 kD相符。
經(jīng)過培養(yǎng)時(shí)間，誘導(dǎo)IPTG濃度，溫度等條件的摸索以及菌體擴(kuò)大培養(yǎng)不同時(shí)間后誘導(dǎo) 表達(dá)比較，基因工程菌的培養(yǎng)條件為接單菌落于50M加油0.2W葡萄糖的卡納抗性LB培 養(yǎng)基中，37°C， 250rpm培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng)物5ml接種于100ral卡納抗性LB培養(yǎng)基中， 37°C ， 250rpm培養(yǎng)至0D600=0. 6 (擴(kuò)大培養(yǎng)約2h)，加入IPTG至終濃度為0. 5mM， 25°C ， 250rpm 誘導(dǎo)培養(yǎng)6h后，4'C， 12000rpm離心2min收獲菌體。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，在此條 件下，HtpX-P3蛋白的表達(dá)量最大，占菌體總蛋白的10%左右，大部分處于可溶狀態(tài)。
實(shí)施例4:蛋白HtpX-P3的純化及成熟蛋白的獲得
將收獲的總菌體用TE(8.0)洗滌，再用Tris-HC1 (20mM,pH8.0)懸浮，超聲處理后， 裂解上清液中加入終濃度為500mM的NaCl和30mM咪唑，然后經(jīng)鎳親和色譜層析一步純化， 選用較簡(jiǎn)化的洗脫條件20mMTris， 500mMNaCl， 30raM咪唑，pH8.0 (A液)；20mMTris， 500mMNaCl， 100mM咪唑，pH8.0(B液)；20mMTris， 500mMNaCl， 300mM咪唑，pH8. O(C液)； 目標(biāo)蛋白HtpX-P3在C液中被洗脫下來。從SDS-PAGE結(jié)果來判斷，是分離效果最好的部分。 得到的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析和薄層掃描分析表明融合蛋白的純度達(dá)到80%。
上述得到的融合蛋白，進(jìn)一步經(jīng)過G50凝膠柱層析進(jìn)行純化，以H20為洗脫液，得到 的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE分析，純度達(dá)到90%以上。如圖3所示，圖中第1泳道為蛋白質(zhì)低分 子量Marker;第2泳道為純化后的目標(biāo)蛋白條帶，大小在14. 4 kD和20. 0 kD之間，與預(yù) 期的16. 1 kD—致。
實(shí)施例5: HtpX-P3作為保護(hù)劑提高菠蘿蛋白酶的熱穩(wěn)定性菠蘿蛋白酶是一種重要的水解酶，其失活溫度為55t:。實(shí)驗(yàn)中菠蘿蛋白酶活力的測(cè)定
方法為FIP法，其原理是菠蘿蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸，后者在275nm處有光吸收， 利用三氯醋酸溶液沉淀反應(yīng)后剩余的酪蛋白，過濾后測(cè)濾液在275nm處的光吸收值。菠蘿 蛋白酶的活力的定義是在37°C， pH值7.0的情況下，每分鐘釋放出的三氯乙酸可溶物在 275nm處的光吸收值相當(dāng)于1 U g酪氨酸的吸光值，所需的酶量為1單位。
稱取O. lg菠蘿蛋白酶(購(gòu)自上海生工生物科技有限公司，3-7單位/mg)，溶于100ml 水中，得到初始酶液。取3個(gè)三角瓶，各瓶中都加入10ml的初始菠蘿蛋白酶酶液，然后分 別加入5ml酶稀釋液(0.26g L半胱氨酸，0. 22g EDTA溶于100ral水，pH值為4.5)， 5ml 濃度為10"g/ml的BSA (牛血清蛋白)水溶液以及5ml濃度為10"g/ml的HtpX-P3蛋白 水溶液(每lmg酶加入蛋白HtpX-P3約5 y g,也相當(dāng)于每單位菠蘿蛋白酶加入蛋白HtpX-P3 約0.7-1.7iig)，將三個(gè)三角瓶分別放于55。C水浴中溫育。取溫育后O、 20、 40、 60、 80、 l(Xkin的不同處理的酶液，測(cè)酶活。溫育Omin (熱處理前)樣品測(cè)得的酶活為初始酶活， 以后面不同時(shí)間取得的樣品測(cè)得的酶活相對(duì)于各自的初始酶活的百分比為縱坐標(biāo)，如圖4 所示，得到不同樣品的剩余酶活一時(shí)間曲線。結(jié)果顯示加入酶稀釋液的(圖中為CK)或BSA 的在熱處理40分鐘時(shí)已經(jīng)幾乎完全失活，半衰期大約為20分鐘，而加入HtpX-P3 (圖中 PHLK1)的在熱處理40分鐘時(shí)仍然有約40%的相對(duì)活性，半衰期約為40分鐘，這說明HtpX-P3 可以增加酶的熱穩(wěn)定性，使半衰期增加20分鐘左右。
實(shí)施例6: HtpX-P3作為保護(hù)劑提高限制性內(nèi)切酶fcoRI的熱穩(wěn)定性
取3支1. 5ml離心管，各管中加入限制性內(nèi)切酶￡coRI (來源于TAKARA公司，8-20單 位/y 1) lOwl，然后在3支管中分別加入酶稀釋液(0.26g L半胱氨酸，0.22g EDTA溶 于100ml水，pH值為4.5)、濃度為10ug/ml的BSA(牛血清蛋白)水溶液、濃度為10ug/ml 的HtpX-P3蛋白水溶液各10u 1 (相當(dāng)于每U 1 ^boRI加入蛋白HtpX-P3約10 ng，也相當(dāng) 于每單位y5boRI加入蛋白HtpX-P3約0. 5-1. 3ng)，將各離心管置于6(TC溫育。分別從各管 中取溫育后0、 10、 20、 30、 40、 50分鐘后的酶2ul，冰浴中放置。待全部取完后，用取 得的各不同處理的酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，底物為lug入DNA(購(gòu)自上海生工生物科技有限公司)， 酶切體系為lug入DNA,酶2"1， 10Xbuffer (來源于TAKARA公司)2 u 1，加水至終體 積20u 1。 37°C， 2h，加入6XLoading buffer終止反應(yīng)。取5u 1酶切反應(yīng)產(chǎn)物，0. 8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果。如圖5所示，圖中l(wèi)、 4、 7、 10、 13、 16泳道分別為5boRI 在60'C下溫育0、 10、 20、 40、 50min后酶切入DNA的結(jié)果；2、 5、 8、 11、 14、 17泳道為加入BSA后的^coRI在60。C下溫育0、 10、 20、 40、 50min后酶切入DNA的結(jié)果；3、 6、 9、 12、 15、 18泳道為加入重組蛋白htpX-P3后的i5boRI在6(TC下溫育0、 10、 20、 40、 50min 后酶切入DNA的結(jié)果。結(jié)果表明60。C溫育20min后，fcoRI基本全部失活；加入BSA對(duì) 酶的失活時(shí)間沒有影響；而加入HtpX-P3后，可以明顯看到，60'C溫育40min時(shí)，還有一 定的活性，酶的失活可以延緩20min。所以，HtpX-P3能抑制^:oRI在高溫下的失活作用， 對(duì)提高其熱穩(wěn)定性具有明顯的作用。序列列表
SEQ,ID.NOl:〉鄉(xiāng)U
TCTAGGATCCATAGGTACCTGACTGCAGATGATGAATGTGATMTGAGAGAAATAGGTAAAAAATTAGATGMC TGTCTAGAGAATTTTATGMTCAGTTATTCCGCCCATAGATATGTATGAAGAAGGGGGAGAGTTAGTAGTGGTAGCA GATCTAGCGGGTTTTAAT嵐GATAAGATAAGTGTMGGTTATCTGCACAGMCGMCTGATMTTMCGCTGAAAG GG嵐TACAGTATATTGGTACT嵐TACGCTACTCAGAGACCTCTTMGATACATMGGTAATTCGTTTACCGGTM AGGTTAAGAGGGATTCTCMGTTACAGCGAAATATGAAAATGGTGTATTGACTATMGGATACCAGTGGAGGGTTCA GTCTCMTCAGAATAGMTAATCTGCAGTAAGGTACCTATGAATTCTTTT
SEQ.ID.N02:
MMNVIMREIGKKLDELSREFYESVIPPIDMYEEGGELWVADLAGFNKDKISVRLSA
SIRIE
權(quán)利要求
1、一種含有HtpX-P3融合蛋白表達(dá)載體pSEPHLK1的大腸桿菌菌株BL21(DE3)，其保藏號(hào)為CCTCC M 208093。
2、 一種蛋白HtpX-P3，其特征在于該蛋白HtpX-P3由權(quán)利要求l所述的含有表達(dá)載體 pSEPHLKl的大腸桿菌菌株BL21(DE3)表達(dá)出來。
3、 一種應(yīng)用蛋白HtpX-P3提高蛋白酶熱穩(wěn)定性的方法，其特征在于每l單位蛋白酶加 入蛋白HtpX-P3或其融合蛋白0. 7-1. g。
4、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用蛋白HtpX-P3提高蛋白酶熱穩(wěn)定性的方法，其特征在于 所述的酶為菠蘿蛋白酶。
5、 一種應(yīng)用蛋白HtpX-P3提高限制性內(nèi)切酶熱穩(wěn)定性的方法，其特征在于每l單位限 制性內(nèi)切酶加入蛋白HtpX-P3或其融合蛋白0. 5-1. 3ng。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用蛋白HtpX-P3提高限制性內(nèi)切酶熱穩(wěn)定性的方法，其特 征在于所述的酶為限制性內(nèi)切酶^boRI。
全文摘要
本發(fā)明公開了蛋白HtpX-P3及應(yīng)用其提高酶熱穩(wěn)定性的方法，本發(fā)明以硫礦硫化葉菌的基因組DNA為模板，通過PCR的方法克隆得到htpX-3基因，得到含有該基因片段的重組載體；將此載體轉(zhuǎn)到大腸桿菌中，并表達(dá)出蛋白。應(yīng)用蛋白HtpX-P3提高蛋白酶熱穩(wěn)定性的方法是每1單位蛋白酶加入蛋白HtpX-P3或其融合蛋白0.7-1.7μg。應(yīng)用蛋白HtpX-P3提高限制性內(nèi)切酶熱穩(wěn)定性的方法是每1單位限制性內(nèi)切酶加入蛋白HtpX-P3或其融合蛋白0.5-1.3ng。本發(fā)明的重組熱激蛋白HtpX-P3可以降低高溫下酶失活的速度，延長(zhǎng)其半衰期，在提高酶的熱穩(wěn)定性方面優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101525588SQ20081021935
公開日2009年9月9日 申請(qǐng)日期2008年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月24日
發(fā)明者李文成, 博 楊, 王小寧, 王永華, 謝明權(quán), 聞?wù)嬲?申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)