一種小桐子組培苗原生質(zhì)體的制備及基因瞬時表達的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種小桐子組培苗原生質(zhì)體的制備及基因瞬時表達的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]小桐子(Jatropha carcas L.)，又名麻瘋樹，為大戟科麻風樹屬落葉灌木或小喬木。小桐子種子含油率高，經(jīng)過加工可制成生物柴油，有著較強的市場開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。瞬時表達技術(shù)是在相對短的時間內(nèi)將目標基因轉(zhuǎn)入靶細胞內(nèi)，獲得該基因短暫的高水平表達的技術(shù)，是一種快速、方便的研究基因-蛋白質(zhì)的方法。目前，關(guān)于獲得小桐子原生質(zhì)體的技術(shù)信息十分匱乏。因此，我們通過已有的擬南芥原生質(zhì)體制備的方法，調(diào)整改進后可以獲得小桐子高活性的原生質(zhì)體，可以用于瞬時表達分析研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種小桐子組培苗原生質(zhì)體的制備及基因瞬時表達的方法。
[0004]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
[0005]一種小桐子組培苗原生質(zhì)體的制備及基因瞬時表達的方法，包括以下操作步驟:
[0006](I)稱取1.82g甘露醇溶于20ml雙蒸水中，配制甘露醇溶液裝在滅菌小燒杯里；
[0007](2)在超凈臺上取小桐子組培苗葉片，用刀片切成0.5?Imm寬的葉條，將切好葉條放入甘露醇溶液中；
[0008](3)將葉條撈出放入預(yù)先配好的裝有15ml酶解液的50ml錐形瓶中，避光，22?25°C靜置酶解6?7h ;當酶解液變綠時搖晃錐形瓶，促使原生質(zhì)體釋放出來；
[0009](4)加入15ml等體積預(yù)冷的W5溶液，用100目的濾網(wǎng)進行過濾，濾液于50ml圓底離心管中置于冰上；
[0010](5)用離心力80g離心2min，去除上清，沿管壁加入5ml預(yù)冷的W5溶液，冰上放置30min，同時取20 μ I溶液用細胞計數(shù)板計數(shù)；
[0011](6)原生質(zhì)體沉淀在離心管底部，去除上清，用MMg溶液將原生質(zhì)體懸浮制成濃度為2 X 15個/mL的原生質(zhì)體懸浮液；
[0012](7)在2ml的滅菌離心管中加入10 μ I的質(zhì)粒DNA溶液；質(zhì)粒DNA溶液中含有10?20 μ g 質(zhì)粒 DNA ；
[0013](8)向步驟(7)所得質(zhì)粒DNA溶液中加入100 μ I步驟(6)所得原生質(zhì)體懸浮液；
[0014](9)再加入110 μ I PEG4000/Ca2+溶液，用剪頭的槍頭吸打混勻；
[0015](10) 22?25°C下避光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化混合物15?30min ；
[0016](11)加入440 μ I的W5溶液稀釋轉(zhuǎn)化混合液，然后顛倒離心管使之混合以終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)；
[0017](12)80g離心2min然后去除上清；
[0018](13)再用Iml的W5溶液重懸原生質(zhì)體于六孔組織培養(yǎng)皿中，在W5溶液中加入50 μ 1/ml氨芐青霉素；
[0019](14)在避光和23°C條件下培養(yǎng)原生質(zhì)體18?40h ；
[0020](15)用離心力80g離心2min，然后去上清，留下10?20 μ I的溶液，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察基因瞬時表達；
[0021]所述酶解液是按照以下方法制備得到:將纖維素酶RlO (Cellulase R10)、離析酶RlO (Mecerozyme R10)、甘露醇(mannitol)、氣化鐘(KCl)和pH為5.7的2-嗎琳乙橫酸(MES)加入到ddH20中混合后，55°C水浴加熱10分鐘；冷卻至室溫后加入氯化鈣(CaCl2)、牛血清蛋白(BSA)和β -巰基乙醇(β -Mercaptoethanol)，用0.45 μ m濾膜過濾后，得到酶解液；各組分在酶解液中的濃度如下:質(zhì)量分數(shù)2.0 %的纖維素酶R10、質(zhì)量分數(shù)0.4 %的離析酶R10、0.4M甘露醇、20mM氯化鉀、20mM 2-嗎啉乙磺酸、1mM氯化鈣、質(zhì)量分數(shù)0.1 %的牛血清蛋白、50 μ I β -巰基乙醇；
[0022]所述W5溶液是按照以下方法制備得到:將葡萄糖(glucose)、氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl2)、氯化鉀(KCl)和pH為5.7的2-嗎啉乙磺酸混合后，用0.45 μ m濾膜過濾后使用；各組分在W5溶液中的濃度如下:5mM葡萄糖、154mM氯化鈉、125mM氯化鈣、5mM氯化鉀、2mM 2-嗎啉乙磺酸；
[0023]所述溶液是按照以下方法制備得到:將氯化鎂(MgCl2)、pH為5.7的2_嗎啉乙磺酸和0.4M甘露醇混合后，用0.45 μ m濾膜過濾后使用；各組分在MMg溶液中的濃度如下:15mM氯化鎂、4mM 2-嗎啉乙磺酸、0.4M甘露醇；
[0024]所述PEG4000/Ca2+溶液是按照以下方法制備得到:將PEG4000、甘露醇和氯化鈣(CaCl2)混合后，用無菌水定容至Iml ;各組分在PEG4000/Ca2+溶液中的濃度如下:質(zhì)量體積分數(shù)40% (即10ml的溶液中含有40g的PEG4000)的PEG4000、0.2M甘露醇、10mM氯化鈣。
[0025]步驟(13)所述六孔組織培養(yǎng)皿在使用之前預(yù)先用質(zhì)量分數(shù)5%的BSA充分浸潤。
[0026]步驟(9)所述PEG4000/Ca2+溶液是在使用之前Ih配置。
[0027]所述離心均是將加速(Accel)與減速(Decel)均調(diào)至O檔。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果:
[0029](I)本發(fā)明不需要用真空栗于黑暗中抽30min，節(jié)省步驟和時間。
[0030](2)本發(fā)明改進了酶解液配方，使木本植物的原生質(zhì)體更易游離出來。
[0031](3)本發(fā)明調(diào)整了 PEG4000/Ca2+溶液的配方，更有效的提高轉(zhuǎn)化效率。
【附圖說明】
[0032]圖1是使用本發(fā)明方法提取的小桐子原生質(zhì)體，得到的小桐子JcSUT4_GFP瞬時表達圖；其中，GFP-Vector為空載體對照、GFP為綠色熒光、Auto-為葉綠體自發(fā)熒光、Brightfield為明場、Merged為三個通道的融合。(注:Bar = 10 μ m)。
【具體實施方式】
[0033]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0034]實施例1 一種小桐子組培苗原生質(zhì)體的制備及基因瞬時表達的方法
[0035](I)稱取1.82g甘露醇溶于20ml雙蒸水中，配制甘露醇溶液裝在滅菌小燒杯里；
[0036](2)在超凈臺上取小桐子組培苗葉片，用刀片切成0.5?Imm寬的葉條，將切好葉條放入甘露醇溶液中；
[0037](3)將葉條撈出放入預(yù)先配好的裝有15ml酶解液的50ml錐形瓶中，避光，22?25°C靜置酶解6?7h ;當酶解液變綠時搖晃錐形瓶，促使原生質(zhì)體釋放出來；
[0038](4)加入15ml等體積預(yù)冷的W5溶液，用100目的濾網(wǎng)進行過濾，濾液于50ml圓底離心管中置于冰上；
[0039](5)用離心力80g離心2min，去除上清，沿管壁加入5ml預(yù)冷的W5溶液，冰上放置30min，同時取20 μ I溶液用細胞計數(shù)板計數(shù)；
[0040](6)原生質(zhì)體沉淀在離心管底部，去除上清，用MMg溶液將原生質(zhì)體懸浮制成濃度為2 X 15個/mL的原生質(zhì)體懸浮液；
[0041](7)在2ml的滅菌離心管中加入10 μ I的質(zhì)粒DNA溶液；質(zhì)粒DNA溶液中含有10?20 μ g 質(zhì)粒 DNA ；
[0042](8)向步驟(7)所得質(zhì)粒DNA溶液中加入100 μ I步驟(6)所得原生質(zhì)體懸浮液；
[0043](9)再加入110 μ I PEG4000/Ca2+溶液，用剪頭的槍頭吸打混勻；
[0044](10) 22?25