專利名稱：一種可溶藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生方法
一種可溶藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于環(huán)境工程微生物領(lǐng)域，具體涉及一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備與再生方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著水體富營(yíng)養(yǎng)化程度的加劇，夏秋季節(jié)藍(lán)藻大面積快速繁殖，藍(lán)藻水華頻繁暴發(fā)，大量的藍(lán)藻覆蓋在水體表面，嚴(yán)重阻礙了水體的流動(dòng)，水體自凈能力降低，復(fù)氧率減小，水體透明度下降，水質(zhì)惡臭，魚(yú)、蝦等浮游生物因生活環(huán)境發(fā)生惡化而死亡。目前控制藍(lán)藻最常用的依然是傳統(tǒng)的機(jī)械打撈，然而人力、物力有限，僅能打撈小部分的藍(lán)藻，大部分的藍(lán)藻在水體內(nèi)因腐爛而消失，而藍(lán)藻危害并沒(méi)有隨著其消失而減弱，腐爛的藍(lán)藻細(xì)胞破碎后就會(huì)向水體釋放各種藻類毒素，其中屬于藍(lán)藻門的微囊藻在世界藍(lán)藻水華水體中占有相當(dāng)大的比例，我國(guó)的太湖流域就以微囊藻為主，它在繁殖的過(guò)程中產(chǎn)生大量的毒性較大的MCs，并儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)，隨著微囊藻的死亡及藻細(xì)胞的破碎，MCs被釋放到水體中，且以溶解性狀態(tài)存在，嚴(yán)重威脅流域附近居民的健康。在現(xiàn)有的物理、化學(xué)及生物等傳統(tǒng)方法達(dá)不到理想控制效果的情況下，利用溶藻細(xì)菌和MCs降解菌聯(lián)合處理藍(lán)藻，構(gòu)建兼具溶藻和MCs降解功能的雙效工程菌即成為一個(gè)新的研究方向。
原生質(zhì)體融合重組可使兩親本菌株的優(yōu)良性狀同時(shí)表達(dá)出來(lái)，也可能使隱性基因因重組而暴露表達(dá)或隨機(jī)產(chǎn)生新的基因表達(dá)出新的性狀，從而成為微生物育種的一種途徑。應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建 高效降解菌株用以處理污水的研究已經(jīng)有報(bào)道。《食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)》2005年第24卷第2期34-37頁(yè)報(bào)道了廖勁松等以單重抗藥性的突變菌株 (S27和K215)為親本菌株，通過(guò)原生質(zhì)體融合獲得高效PVA降解菌F-4?！逗幽峡茖W(xué)》2009 年第27卷第7期809-812頁(yè)報(bào)道了張琪等利用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得兼具兩個(gè)親本優(yōu)良性狀的紅霉素高產(chǎn)菌株，對(duì)提高紅霉素產(chǎn)量及化學(xué)藥價(jià)具有較大的應(yīng)用價(jià)值。
微生物溶藻、降解MCs是一個(gè)很有效的方法，國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者已篩選出多種溶藻菌、MCs降解菌，溶藻菌在溶藻過(guò)程中，破壞藍(lán)藻細(xì)胞，釋放出胞內(nèi)MCs。利用原生質(zhì)體融合技術(shù)可能將兩株分別具有溶藻、MCs降解能力的細(xì)菌構(gòu)建成兼具兩個(gè)親本菌株優(yōu)良性狀的高效降解工程菌。目前，原生質(zhì)體融合技術(shù)在溶藻、MCs降解工程菌構(gòu)建上的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。
通過(guò)分離篩選獲得溶藻細(xì)菌F8，其對(duì)銅綠微囊藻FACHB-905均有較好的溶藻效果?？蓮囊韵聝蓚€(gè)思路出發(fā)一是制備溶藻細(xì)菌、MC降解菌復(fù)合菌劑；二是構(gòu)建兼具溶藻和 MC降解功能的轉(zhuǎn)基因工程菌。本方法以原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建工程菌為基礎(chǔ)，主要研究實(shí)驗(yàn)室已分離的溶藻細(xì)菌fusiformis)的原生質(zhì)體制備,該菌是本實(shí)驗(yàn)室從太湖流域野生白鰱魚(yú)腸道中篩選出的I株溶解銅綠微囊藻的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌，已申請(qǐng)發(fā)明專利，保藏號(hào)為CGMCC NO. 6106。鑒于親本菌株的抗性標(biāo)記工作量大，天然抗性難以確定，抗性突變亦可能使優(yōu)良性狀發(fā)生不定向改變，為確保親本菌株保持其各自的優(yōu)良生物學(xué)特性，本研究選用滅活原生質(zhì)體融合法，既減少了工作量，又保證了后續(xù)研究中融合子的質(zhì)量。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生的方法，使得其制備率與再生率都達(dá)到較高范圍。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，按照下述步驟進(jìn)(1)菌種活化培養(yǎng)將保藏的菌株F8重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，約為IO8-1O9個(gè) /mL ；(2)原生質(zhì)體的破壁酶解取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min，收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次，用 3. 2-3. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入O. 1-1 mg/mL的溶菌酶O. 2-0. 8mL,在水浴溫度30°C條件下酶解O. 17-1 h;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4 mL O. 55 mol/L NaCl溶液懸浮即可制備得到原生質(zhì)體；(3)原生質(zhì)體的再生 取上述步驟的原生質(zhì)體懸浮液，用高滲NaCl溶液稀釋到合適的三個(gè)梯度，分別吸取 200 μ I涂布于高滲固體培養(yǎng)基,每個(gè)梯度做三個(gè)平行，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,使得原生質(zhì)體再生。
本發(fā)明所述的溶藻細(xì)菌iLysinibacillus fusiformis),保藏號(hào)為CGMCC NO. 6106。其建議的分類命名為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌fusiformis、。已于2012年5月11日保藏于位于中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 6106。
本發(fā)明中步驟(I)中菌種活化培養(yǎng)用細(xì)菌培養(yǎng)基組成如下牛肉膏3 g;蛋白胨10 g ;NaCl 5 g ;蒸餾水1000 mL ；pH 7. 0-7. 2 ;固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉2. 4% ;上述培養(yǎng)基根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
本發(fā)明中步驟(3)中原生質(zhì)體的再生用的高滲液體培養(yǎng)基組成如下蛋白胨10 g，酵母浸出汁5 g,牛肉膏5 g,鹿糖170 g (0.5 mol/L),蒸懼水定容至1000 mL, pH 7. 2 ;高滲固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20-24 g。上述培養(yǎng)基根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
本發(fā)明所述的溶液配制如下(I)高滲NaCl溶液=NaCl O. 55 mol/L。(2)SMM緩沖液蔗糖 O. 55 mol/L，順丁希二酸 20 mmol/L, MgCl2 · 6H20 20 mmol/L, pH 6.8。(3) EDTA 溶液EDTA 0. 8 g/L，SMM緩沖液配制。(4)溶菌酶0. 01-0.1 mg/mL, SMM緩沖液配制。上述溶液根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
上述原生質(zhì)體制備與再生方法優(yōu)選加入溶菌酶使得體系中酶濃度為0. 005 mg/mL，在溫度為30°C時(shí)酶解O. 5h，該賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備率與再生率最佳，有利于后續(xù)融合子的制備與再生。
本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明的原生質(zhì)體制備與再生方法，工藝簡(jiǎn)單，便于操作，可重復(fù)性強(qiáng)；所獲得的原生質(zhì)體制備率最高可達(dá)86. 25%，且再生率最高可達(dá)在76. 81%，原生質(zhì)體體制備率高且原生質(zhì)體活性保持較好，有利于后續(xù)兼具溶藻與降解MC-LR功能的融合子的制備與再生。
具體實(shí)施方式
一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生的方法提供了適合該菌原生質(zhì)體制備及高效再生的方法。
以下提供本發(fā)明利用上述方法的5個(gè)實(shí)施例實(shí)施例1將保藏的菌株F8重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，約為IO8-1O9個(gè) /mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次，用 3. 2mL的SMM緩沖液重懸；加入O. 01 mg/mL的溶菌酶O. 8mL,在水浴溫度30°C條件下酶解 O. 5 h ;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次， 洗去酶解液后用4 mL O. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用，該過(guò)程所獲得的原生質(zhì)體制備率為 65. 75%,再生率為 79. 85%。
其中原生質(zhì)體制備率測(cè)定方法如下將溶菌酶處理前的細(xì)胞和酶解后的原生質(zhì)體懸液均用無(wú)菌蒸餾水稀釋，放置約10 min，使原生質(zhì)體吸水 脹破，分別吸取100 μ I涂布在細(xì)菌固體平板培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度做三個(gè)平行，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，分別計(jì)菌落數(shù)A和B，根據(jù)下述公式計(jì)算原生質(zhì)體制備率，以檢驗(yàn)制備效果。'康生質(zhì)體制備率< %> = XlOO %A
其中A為總菌落數(shù)，即未經(jīng)溶菌酶處理的菌液涂布于細(xì)菌平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)；B 為未原生質(zhì)體化的細(xì)菌菌落數(shù)，即原生質(zhì)體懸液經(jīng)無(wú)菌蒸餾水稀釋后涂布于細(xì)菌平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)。
其中所述的原生質(zhì)體的再生方法如下取原生質(zhì)體懸浮液，用高滲NaCl溶液稀釋到合適的三個(gè)梯度，分別吸取200 μ I涂布于高滲固體培養(yǎng)基，每個(gè)梯度做三個(gè)平行，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計(jì)再生菌落數(shù) C，根據(jù)下述公式計(jì)算原生質(zhì)體再生率，以檢驗(yàn)再生效果。原生質(zhì)體再生率(％) = Xioo%A-B
其中A為總菌落數(shù)，即未經(jīng)溶菌酶處理的菌液涂布于細(xì)菌平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)；B 為未原生質(zhì)體化的細(xì)菌菌落數(shù)，即原生質(zhì)體懸液經(jīng)無(wú)菌蒸餾水稀釋后涂布于細(xì)菌平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)；C為再生菌落數(shù)，即原生質(zhì)體懸液，經(jīng)高滲NaCl溶液稀釋后在高滲平板上長(zhǎng)出來(lái)的菌落數(shù)。
實(shí)施例2將保藏的菌株F8重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，約為IO8-1O9 個(gè)/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次， 用3. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入O.1 mg/mL的溶菌酶O. 2mL,在水浴溫度30°C條件下酶解 O. 5 h ;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次， 洗去酶解液后用4 mL O. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用，該過(guò)程所獲得的原生質(zhì)體制備率為86.25%，再生率為 76. 81%。
實(shí)施例3將保藏的菌株F8重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，約為IO8-1O9 個(gè)/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次， 用3. 6mL的SMM緩沖液重懸；加入O.1 mg/mL的溶菌酶O. 4mL,在水浴溫度30°C條件下酶解O.5 h ;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次， 洗去酶解液后用4 mL O. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用，該過(guò)程所獲得的原生質(zhì)體制備率為87.5%,再生率為 42. 86%ο
實(shí)施例4將保藏的菌株F8重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，約為IO8-1O9 個(gè)/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次， 用3. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入O.1 mg/mL的溶菌酶O. 2mL,在水浴溫度30°C條件下酶解O.17 h;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次， 洗去酶解液后用4 mL 0. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用，該過(guò)程所獲得的原生質(zhì)體制備率為 78. 95%,再生率 34. 44%ο
實(shí)施例5將保藏的菌株F8重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，約為IO8-1O9 個(gè)/mL。取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min,收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次， 用3. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入0.1 mg/mL的溶菌酶0. 2mL,在水浴溫度30°C條件下酶解I h;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次， 洗去酶解液后用4 mL 0. 55 mol/L NaCl溶液懸浮備用，該過(guò)程所獲得的原生質(zhì)體制備率為 85. 09%,再生率 50. 52%。
權(quán)利要求
1.一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行 (1)菌種活化培養(yǎng) 將保藏的菌株F8重新轉(zhuǎn)接至平板劃線分離3次，挑取單菌落接種至新鮮的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，為IO8-1O9個(gè)/mL ； (2)原生質(zhì)體的破壁酶解 取4 mL活化的菌液，4500 r/min離心10 min，收集菌體，經(jīng)SMM緩沖液洗滌3次，用3.2-3. 8mL的SMM緩沖液重懸；加入O. 1-1 mg/mL的溶菌酶O. 2-0. 8mL,在水浴溫度30°C條件下酶解O. 17-1 h;酶解結(jié)束后，3000 r/min離心收集原生質(zhì)體，用O. 55 mol/L的NaCl溶液洗滌3次，洗去酶解液后用4 mL O. 55 mol/L NaCl溶液懸浮即可制備得到原生質(zhì)體； (3)原生質(zhì)體的再生 取上述步驟的原生質(zhì)體懸浮液，用高滲NaCl溶液稀釋到合適的三個(gè)梯度，分別吸取200 μ I涂布于高滲固體培養(yǎng)基,每個(gè)梯度做三個(gè)平行，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,使得原生質(zhì)體再生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于所述的溶藻細(xì)菌iLysinibadIlus fusiformis),保藏號(hào)為CGMCCNO. 6106。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于步驟(I)中菌種活化培養(yǎng)用細(xì)菌培養(yǎng)基組成如下牛肉膏3 g ;蛋白胨10 g ；NaCl 5 g ;蒸餾水1000 mL ；pH 7. 0-7. 2 ;若為固體培養(yǎng)基則添加瓊脂粉2. 4% ;上述培養(yǎng)基根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于步驟(3)中原生質(zhì)體的再生用的高滲液體培養(yǎng)基組成如下蛋白胨10 g，酵母浸出汁5 g，牛肉膏5 g，蔗糖170 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH 7. 2 ;若為高滲固體培養(yǎng)基則加入瓊脂粉20-24 g ;上述培養(yǎng)基根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種溶解銅綠微囊藻的賴氨酸芽孢桿菌的原生質(zhì)體制備與再生方法，其特征在于所述的溶液配制如下(I)高滲NaCl溶液NaCl O. 55 mol/L； (2)SMM 緩沖液蔗糖 O. 55 mol/L，順丁希二酸 20 mmol/L, MgCl2 · 6H20 20 mmol/L, pH 6. 8 ；(3)溶菌酶0. 1-1 mg/mL，SMM緩沖液配制；上述溶液根據(jù)要求在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌20 min。
全文摘要
本發(fā)明一種可溶藻的賴氨酸芽孢桿菌原生質(zhì)體制備與再生方法，屬于環(huán)境工程微生物領(lǐng)域。本發(fā)明采用原生質(zhì)體制備與再生方法，工藝簡(jiǎn)單，便于操作，可重復(fù)性強(qiáng)；所獲得的原生質(zhì)體制備率最高可達(dá)86.25%，且再生率最高可達(dá)在76.81%，原生質(zhì)體體制備率高且原生質(zhì)體活性保持較好，有利于后續(xù)兼具溶藻與降解MC-LR功能的融合子的制備與再生。
文檔編號(hào)C12R1/01GK103013849SQ20121034222
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月17日
發(fā)明者張文藝, 陳雪珍, 李仁霞, 李秋艷 申請(qǐng)人:常州大學(xué)