一種快速高效的曼陀羅原生質(zhì)體制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速高效的曼陀羅原生質(zhì)體制備方法，屬于植物細(xì)胞工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 曼陀羅（Datura stramonium L )是前科曼陀羅屬植物，廣泛分布于世界各 大洲，我國各省份都有分布。據(jù)《全國中草藥匯編》記載，其花做中藥洋金花入藥。曼 陀羅全株有毒，其毒性成分，亦是其主要藥效物質(zhì)成分，是莨菪堿和東莨菪堿類化合 物，主要起鎮(zhèn)痙、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和麻醉作用。東莨菪堿的解痙麻醉作用強于莨菪堿，而在 曼陀羅植物體內(nèi)，莨菪堿占主導(dǎo)地位，僅含有少量東莨菪堿（Elisabetta Miraldia，et al.Distribution of hyoscyamine and scopolamine in Datura stramonium. Fitoterapia，2001，72:644-648.) 〇
[0003] 原生質(zhì)體是指去除細(xì)胞壁后的裸露細(xì)胞，具有該細(xì)胞的所有生命特征，是進(jìn)行基 礎(chǔ)研究的理想材料，被廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)化、蛋白表達(dá)等研究。通過原生質(zhì)體進(jìn)行葉綠體基 因轉(zhuǎn)化，達(dá)到葉綠體生物反應(yīng)器的目的，是目前的研究熱點之一。通過葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)， 將曼陀羅植物體內(nèi)的莨菪堿轉(zhuǎn)化成活性更高的東莨菪，是藥學(xué)工作者的興趣之一。在以曼 陀羅為材料的研究中，至今尚未有以曼陀羅原生質(zhì)體為介質(zhì)進(jìn)行葉綠體基因轉(zhuǎn)化的報道。 而在曼陀羅原生質(zhì)體制備的研究中，往往通過誘導(dǎo)愈傷組織，從愈傷組織中分離純化得到 原生質(zhì)體（黃靜，等.曼陀羅莖段愈傷組織誘導(dǎo)和再生植株的研究.生物技術(shù)通報，2007， 5:179~183;蔡起貴，等.曼陀羅愈傷組織的原生質(zhì)體再生植株.中國植物學(xué)會五十周年 年會學(xué)術(shù)報告及論文摘要匯編，1983 :554.)，操作復(fù)雜，耗時較長，急需一種快速高效的曼 陀羅原生質(zhì)體制備方法，以滿足后續(xù)研究需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種快速、高效且適合曼陀羅葉綠體基因轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體制 備方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供了一種曼陀羅原生質(zhì)體制備方法，利用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)獲得了無菌 的曼陀羅組培苗，以曼陀羅組培苗的幼葉為起始材料，采用纖維素酶（Cellulase)RlO和離 析酶（Macerozyme) R10,對曼陀羅幼葉組織進(jìn)行酶解消化，并利用鹿糖密度梯度離心方法分 離獲得曼陀羅原生質(zhì)體。
[0007] 所述的莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)，為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，可參見文獻(xiàn)：羅士葦，植物組織培 養(yǎng)，植物生理學(xué)通報，1957, 5 :16~25 ;
[0008] 所述的纖維素酶RlO溶液，優(yōu)選終濃度為0. 25% (g/mL);
[0009] 所述的離析酶RlO溶液，優(yōu)選終濃度為0. 25% (g/mL);
[0010] 所述的蔗糖密度梯度離心方法，是指用于曼陀羅原生質(zhì)體酶解的溶液中蔗糖含量 高于用于曼陀羅原生質(zhì)體分離的溶液中蔗糖含量。即根據(jù)溶液A與溶液B中蔗糖含量不同， 造成溶液A密度大于溶液B，而酶解后的曼陀羅原生質(zhì)體的密度，剛好處于溶液A與溶液B 之間。通過離心，能使完整的原生質(zhì)體處于溶液A和溶液B的界面之間，破碎的細(xì)胞沉到溶 液A底部，其他一些低密度物質(zhì)懸浮于溶液B中，其中溶液A和溶液B的配方見表1。
[0011] 本發(fā)明所述的一種曼陀羅原生質(zhì)體制備方法，具體的步驟如下：
[0012] (a)曼陀羅莖尖培養(yǎng)：剪取曼陀羅栽培苗的莖尖帶幼芽部位，消毒后轉(zhuǎn)移至MS培 養(yǎng)基中。
[0013] (b)曼陀羅組培苗培養(yǎng)：將步驟（a)的消毒莖尖在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)3~5周，直 至其長出展開的葉片。培養(yǎng)條件：22~28°C，光照14~18h，優(yōu)選25°C，光照16h。
[0014] (c)原生質(zhì)體酶解：在一 9cm直徑的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入20mL溶液A ;剪取5~7 片步驟（b)組培苗展開的幼葉，快速用剪刀剪成Imm的條狀，置于溶液A中，于25°C暗中靜 置培養(yǎng)2~3h后，用移液器棄溶液A，置換20mL新的溶液A，分別加入10% (g/mL)濃度的 纖維素酶RlO溶液和10% (g/mL)濃度的離析酶RlO溶液各500 μ L，置于水平搖床中，于 22~28°C (優(yōu)選25°C )黑暗條件下，以55~60rpm的轉(zhuǎn)速過夜（約12~16h)。
[0015] (d)原生質(zhì)體分離：用70 μ m細(xì)胞篩網(wǎng)過濾步驟（c)的酶解液至無菌的50mL離心 管中，并用20mL溶液A沖洗篩網(wǎng)上的葉片殘渣，然后用移液器在濾液上層緩慢滴加 IOmL溶 液B，避免與溶液A混溶。25°C下用100g離心力（RCF)離心15min，用無菌吸管吸取溶液A 和溶液B之間的原生質(zhì)體，即得到所需的原生質(zhì)體。
[0016] (e)原生質(zhì)體懸浮：將步驟（d)分離的原生質(zhì)體懸浮在溶液B中。
[0017] (f)原生質(zhì)體計數(shù)：將步驟（e)中的原生質(zhì)體顛倒混勻，用移液器吸取20 μ L滴于 血球計數(shù)板上，于倒置顯微鏡下計數(shù)，根據(jù)參與酶解的葉片多少計算出每克葉片得到的原 生質(zhì)體產(chǎn)量，計算結(jié)果用每克葉片原生質(zhì)體數(shù)表示（個/g)。
[0018] 其中步驟（a)中所述的消毒方法如下：莖尖組織用體積百分比為75%的乙醇浸泡 lOmin，滅菌蒸餾水沖洗5次，再用體積百分比為10%的次氯酸鈉溶液浸泡lOmin，滅菌蒸餾 水沖洗5次。
[0019] 其中步驟（a)和（b)中所述的MS培養(yǎng)基配制如下：將4. 43g MS培養(yǎng)基粉末與30g 蔗糖溶解于IL蒸餾水中，用IM KOH溶液調(diào)整pH值至5. 8后，加入7. 5g瓊脂，加熱溶解，趁 熱分裝45~55mL至300mL組培罐中，121°C濕熱滅菌25min。
[0020] 所述的10 % (g/mL)纖維素酶RlO溶液的配制方法如下：稱取Ig纖維素酶RlO 粉末和1.37g蔗糖溶于IOmL蒸餾水中，用0.22μπι微孔濾膜過濾除菌，250 yL分裝保存 于-20。。。
[0021] 所述的10% (g/mL)離析酶RlO溶液的配制方法如下：稱取Ig離析酶RlO粉末和 I. 37g蔗糖溶于IOmL蒸餾水中，用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，250 μ L分裝保存于-20°C。
[0022] 所述的溶液A和溶液B的組成成分如表1所示，且溶液A和溶液B均需用IM KOH 溶液調(diào)整pH值至5. 8,并用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌。
[0023] 表1溶液A和溶液B的試劑組成
[0024]
[0025] 所述的6-BA溶液的配制方法如下：稱取1.0 mg 6-BA粉末，先用50 μ L IM KOH溶 液溶解，再用950 μ L蒸餾水稀釋成lmg/mL濃度。
[0026] 所述的NAA溶液的配制方法如下：稱取1.0 mg NAA粉末，先用25 μ L IM KOH溶液 溶解，再用975 μ L蒸餾水稀釋成lmg/mL濃度。
[0027] 所述的微量無機鹽溶液100 X的配制方法如下：稱取0. 0025g CuSO4 · 5H20， 0. 0025g CoCl2,0.025g Na2MoO4 ·2Η20,0. 083g ΚΙ,Ο. 620g H3BO3,0.860g ZnSO4 ·7Η20, 2. 23g MnSO4 · H2O和4g NaEDTA，用蒸餾水溶解并定容至1L，4°C保存。
[0028] 所述的IM琥珀酸銨溶液的配制方法如下：稱取23. 6g琥珀酸（丁二酸）和10. 6g NH4C1，加入IOOmL蒸餾水，快速小心加入22. 4g KOH固體并不斷攪拌，待固體物質(zhì)溶解后， 用蒸餾水定容至200mL，4°C保存。
[0029] 所述的維生素鹽溶液100X的配制方法如下：稱取0. 002g d(+)-生物素，0. 100g 鹽酸硫胺素（維生素 BI)，0. 200g鹽酸吡哆醇（維生素 B6)，0. 200g煙酸，0. 200g泛酸鈣， 15. 098g CaCljP 20g肌醇，用蒸餾水溶解并定容至1L，4°C保存。
[0030] 本發(fā)明利用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)獲得了無菌的曼陀羅組培苗，為原生質(zhì)體的分離制 備提供了最佳外植體。通過酶解方法直接從曼陀羅植物葉片中分離得到原生質(zhì)體，避免了 以往需通過植物葉片或莖段誘導(dǎo)愈傷組織，再從愈傷組織中分離純化原生質(zhì)體的過程，減 少了愈傷組織誘導(dǎo)及愈傷組織生長所需的時間，使實驗進(jìn)程從幾周縮短到了一天。另外，本 發(fā)明通過蔗糖密度梯度離心方法，利用密度差，使酶解后的原生質(zhì)體與破碎的植物細(xì)胞直 接分離，減少了后續(xù)的純化步驟，且分離出的原生質(zhì)體細(xì)胞膜完整，多呈球形（通常認(rèn)為球 形或圓形的原生質(zhì)體活力較高），葉綠體含量豐富，產(chǎn)量在IO 6個/g以上（10 6個原生質(zhì)體 能滿足一次葉綠體轉(zhuǎn)基因操作），能滿足葉綠體基因轉(zhuǎn)化及其他各種后續(xù)研究需要，為實現(xiàn) 曼陀羅植物體內(nèi)莨菪堿轉(zhuǎn)化為東莨菪堿提供了媒介。
【附圖說明】
[0031] 圖1為用于曼陀羅原生質(zhì)體制備的外植體。
[0032] 圖2為剪成條狀的曼陀羅葉片。
[0033] 圖3為曼陀羅經(jīng)過夜酶解后（約14h)未分離的原生質(zhì)體（10X20)。
[0034] 圖4為分離后的曼陀羅原生質(zhì)體（10X40)。
【具體實施方式】
[0035] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0036] 實施例1
[0037] -種快速高效的曼陀羅原生質(zhì)體制備方法，包括以下步驟：曼陀羅莖尖培養(yǎng)、曼陀 羅組培苗培養(yǎng)、原生質(zhì)體酶解、原生質(zhì)體分離、原生質(zhì)體懸浮和原生質(zhì)體計數(shù)。
[0038] (1)曼陀羅莖尖培養(yǎng)：剪取曼陀羅栽培苗的莖尖帶幼芽部位，用體積百分比為 75%的乙醇浸泡lOmin，在超凈工作臺中用滅菌蒸餾水沖洗5次，再用體積百分比為10%的 次氯酸鈉溶液浸泡lOmin，滅菌蒸餾水沖洗5次，轉(zhuǎn)移至濕熱滅菌的MS培養(yǎng)基中。
[0039] (2)曼陀羅組培苗培養(yǎng)：將步驟（1)的消毒莖尖在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)3~5周，直 至其長根并長出展開的葉片。培養(yǎng)條件為25°C恒溫下，每天光照16h(見圖1)。
[0040] (3)原生質(zhì)體酶解：在超凈工作臺中，取一個直徑9cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入20mL溶 液A ;剪取5~7片步驟（2)組培苗展開的幼葉，用剪刀快速剪成Imm寬的條狀（見圖2)， 置于溶液A中，用封口膜封口后，于25°C黑暗環(huán)境中靜置。2~3h后，用移液器吸取溶液A 并棄去，盡量吸凈，置換20mL新的溶液A，并加入10 % (g/mL)纖維素酶RlO溶液和10 % (g/ mL)離析酶RlO溶液各500 μ L，用封口膜封口，將培養(yǎng)皿置于水平搖床中，于25°C黑暗條件 下，以60rpm的轉(zhuǎn)速過夜（約14h)。
[0041] (4)原生質(zhì)體分離：在超凈工作臺中，用70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾步驟（3)的酶解液至 無菌的50mL離心管中，并用20mL溶液A沖洗篩網(wǎng)上的葉片殘渣，然后用移液器在濾液上層 緩慢滴加 IOmL溶液B，避免與溶液A混溶。25°C溫度下以100g離心力離心15min，用無菌 吸管吸取溶液A和溶液B之間的原生質(zhì)體至一無菌的50mL離心管中。該原生質(zhì)體即所需 的原生質(zhì)體。
[0042] (5)原生質(zhì)體懸浮：在步驟⑷分離的原生質(zhì)體中加入適量溶液B (10~20mL)。
[0043] (6)原生質(zhì)體計數(shù)：將步驟（5)中的原生質(zhì)體顛倒混勻，用移液器吸取20 μ L滴于 血球計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，置于倒置顯微鏡下計數(shù)，連續(xù)計數(shù)5次，取平均值。