一種阿膠及其衍生產(chǎn)品高純度dna的提取試劑盒及其提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種阿膠及其衍生產(chǎn)品高純度DNA的提 取試劑盒及其提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代藥典將阿膠定義為：W馬科動(dòng)物驢的皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠。其味甘、 平，入肺、肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)血止血、滋陰潤(rùn)燥等功效，藥食兩用。目前阿膠市場(chǎng)價(jià)格大幅上 漲，各地均出現(xiàn)了用其他動(dòng)物皮熬制的代用品，采用骨膠、雜皮等熬制的膠類假藥不僅臨床 效果差，而且還可能出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。就驢皮膠或馬皮膠或牛皮膠等外觀來(lái)看十分相似，難W 辨別。加之造假者多W在驢皮中滲入部分雜皮膠，使得阿膠的鑒別更是難上加難。目前較 前沿的鑒別方法為分子鑒定法，即將阿膠的DNA提取出來(lái)，利用分子生物學(xué)手段（如PCR技 術(shù)）檢測(cè)所提取DNA的動(dòng)物來(lái)源，W確定阿膠的真?zhèn)?。但由于阿膠本身屬于蛋白質(zhì)成分高 且黏性大的物質(zhì)，致使DNA提取較難，而且其在制作過(guò)程中，原料經(jīng)反復(fù)熬煮，致使DNA部分 遭到破壞，更增加了DNA提取的難度。近幾年，阿膠衍生產(chǎn)品如阿膠糕、阿膠液等大量涌現(xiàn)， 其阿膠成分的含量進(jìn)一步降低，致使其DNA提取的難度進(jìn)一步加大。
[000引從成分復(fù)雜的阿膠及其衍生產(chǎn)品中提取的DNA，其中多含有能干擾PCR的抑制物， 容易導(dǎo)致DNA檢測(cè)失?。訇幮裕?。大部分PCR抑制因子（蛋白質(zhì)、多糖、酪類、脈、腐酸和 血紅素等）都與DNA有相似的溶解性，使用經(jīng)典DNA提取方法（CTAB/SDS，蛋白酶和酪-氯 仿-異戊醇處理）不容易完全除去，運(yùn)些物質(zhì)成了DNA最終提取液的污染物。此外，經(jīng)典 DNA提取方法中使用的酪、氯仿等有機(jī)試劑具有較大的毒性和腐蝕性，存在危害檢驗(yàn)人員身 屯、健康的風(fēng)險(xiǎn)。除經(jīng)典DNA提取方法外，發(fā)明專利（【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410317118. 7)還公開(kāi)了 一種從阿膠中快速提取DNA的試劑盒及其提取方法，但該試劑盒中所用試劑種類較多，價(jià) 格昂貴，且個(gè)別試劑稀缺不容易購(gòu)買，從而增加了檢測(cè)和時(shí)間成本。
[0004] 因此，提供一種適用于從成分復(fù)雜的阿膠及其衍生產(chǎn)品中提取DNA的試劑盒是目 前亟待解決的問(wèn)題，對(duì)于阿膠及其衍生產(chǎn)品的分子學(xué)鑒定具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種阿膠及其衍生產(chǎn)品高純度DNA的提 取試劑盒及其提取方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種阿膠及其衍生產(chǎn)品高純度DNA的提取試劑盒，由組分I、組分II、蛋白酶K溶 液和RNA酶溶液組成；
[0008] 所述組分I的組成為：0. 08-0. 12M十二烷基硫酸鋼（SDS)，0. 8-1. 2MTris-HCl, 0. 4-0.SMNazEDTA,PH= 7. 5-8. 5 ;
[0009] 所述組分II的組成為：8. 0-8. 5MCsCl，8-12mMTris-肥 1，PH= 7. 5-8. 5。
[0010] 所述蛋白酶K溶液的濃度為15-25mg血I;優(yōu)選的，所述蛋白酶K溶液的濃度為 2OmgmL1。 陽(yáng)0川所述RNA酶溶液的濃度為80-120mg血1;優(yōu)選的，所述RNA酶溶液的濃度為IOOmgmL1。RNA酶溶液的主要作用是降解殘存的RNA，進(jìn)一步的提高DNA的純度；因此RNA 酶溶液的濃度需要適度，不宜過(guò)高或過(guò)低，過(guò)高會(huì)增加DNA提純的難度，過(guò)低則會(huì)使RNA降 解不徹底。 陽(yáng)〇1引 優(yōu)選的，所述組分I的組成為：0.IMSDS，1.OMTris-肥1,0. 5M胞2邸TA,PH= 8. 0。 陽(yáng)〇1引 優(yōu)選的，所述組分II的組成為：8. 3MCsCl,IOmMTris-HCl,PH= 8. 0。
[0014] 本發(fā)明還提供了采用該提取試劑盒從阿膠及其衍生產(chǎn)品中提取高純度DNA的方 法，步驟為：向待檢的阿膠或其衍生產(chǎn)品中加入提取試劑盒中的組分I、蛋白酶K溶液和RNA 酶溶液，經(jīng)沉淀、分離得到DNA粗提物，阿膠或其衍生產(chǎn)品與組分I、蛋白酶K溶液、RNA酶溶 液加入量的比為（0. 5-1. 2)g: (0. 8-1. 2)血：（4-6)yL: (4-6)yL;
[0015] 向DNA粗提物中加入組分II溶解，250000-260000g離屯、28-3化，使組分II形成 連續(xù)的密度梯度，將溶解在組分II中DNA粗提物的DNA與雜質(zhì)分離，即得到進(jìn)一步提純的 DNA。
[0016] 上述提取高純度DNA的方法，具體步驟如下：
[0017] (1)向待檢的阿膠或其衍生產(chǎn)品中加入組分I、蛋白酶K溶液和RNA酶溶液，混勻， 60-70°C水浴1-化，離屯、，取上清，得溶液A;阿膠或其衍生產(chǎn)品與組分I、蛋白酶K溶液、RNA 酶溶液加入量的比為（0. 5-1. 2)g: (0. 8-1. 2)mL: (4-6)yL: (4-6)yL; 陽(yáng)0化]似向溶液A中加入化08-0. 12)倍體積的乙酸鐘溶液和（1. 5-2.W倍體積的乙 醇溶液，在液氮中放置4-6min，或（-80°C至-20°C)放置0. 5-比，離屯、，棄上清，得沉淀B;
[0019] 做向沉淀B中加入組分II溶解，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶解后的溶液中DNA的 含量，按DNA:雙苯酷亞胺質(zhì)量比=2:1加入雙苯酷亞胺染色，混勻，避光過(guò)夜，調(diào)節(jié)溶液折 射率為1. 3-1. 4,離心UV365nm下吸取DNA條帶，得溶液C;
[0020] (4)向溶液C中加入等體積異丙醇，混勻，分層后棄去上層溶液，重復(fù)此過(guò)程直至 在UV365nm下觀察不到巧光，再加入2-3倍體積80%乙醇，離屯、，棄去上清，洗涂沉淀，驚干 后加入(1地2〇溶解得到阿膠DNA溶液。
[0021] 步驟（2)中，所述乙酸鐘溶液的濃度為3mol/L，PH= 5. 2。 陽(yáng)02引步驟（3)中，所述雙苯酷亞胺的濃度為0. 5mg血1。
[0023] 優(yōu)選的，步驟（1)中，阿膠或其衍生產(chǎn)品與組分I、蛋白酶K溶液、RNA酶溶液加入 量的比為 0). 5-1. :1 血：5yL:5yL。
[0024] 優(yōu)選的，步驟（I)中，水浴溫度為65°C，水浴時(shí)間為I.化；離屯、條件為：12000g離 屯、ISmin。 W巧]優(yōu)選的，步驟似中，放置的條件為：在液氮中放置5min，或-80°C放置0.化， 或-20°C放置比。上述放置操作的目的是使DNA粗提物析出，有利于下一步離屯、分離。
[0026] 優(yōu)選的，步驟似中，離屯、的條件為：12000g離屯、IOmin;離屯、的目的是沉淀、分離 DNA粗提物。
[0027] 優(yōu)選的，步驟（3)中，離屯、的條件為：254800g離屯、30h。該步驟中通過(guò)超高速長(zhǎng)時(shí) 間離屯、可使得組分II形成連續(xù)的密度梯度，溶解在其中的DNA粗提物中的DNA與蛋白質(zhì)、 鹽類小分子等雜質(zhì)，因分子量大小不同會(huì)聚集在組分II中不同位置，有利于下一步高純度 分離DNA。
[0028] 本發(fā)明的有益效果：
[0029] (1)本發(fā)明的提取試劑盒特別適用于從成分復(fù)雜的阿膠及其衍生品中提取阿膠 的基因組DNA，針對(duì)阿膠及其衍生品中的蛋白成分高且黏度大、DNA含量少且高度降解的特 點(diǎn)，本發(fā)明的提取試劑盒首先用SDS將細(xì)胞膜裂解，在蛋白酶K、邸TA的存在下消化消化蛋 白質(zhì)或多膚或小膚分子，核蛋白變性降解，使DNA從核蛋白中游離出來(lái)；在RNA酶存在下降 解殘存的RNA，進(jìn)一步提高DNA純度；在超高速長(zhǎng)時(shí)間離屯、時(shí)，組分II從液面到底部出現(xiàn)一 定的連續(xù)密度梯度，針對(duì)溶解在組分II中的DNA粗提取物的各種成分，比溶劑密度大的物 質(zhì)會(huì)產(chǎn)生大分子沉降，比溶劑密度小的物質(zhì)則會(huì)上浮，最后在重力和浮力平衡的位置聚集 形成大分子帶狀物，因此，利用DNA與蛋白質(zhì)、鹽類小分子等雜質(zhì)的分子量大小不同，DNA單 獨(dú)聚集在特定位置形成一條帶狀物，有利于DNA的高純度分離與純化。
[0030] (2)本發(fā)明的DNA提取試劑盒中的試劑來(lái)源廣泛，成本較低，降低了檢測(cè)的成本。 [00川做本發(fā)明的DNA提取方法未使用毒性和腐蝕性較大的酪、氯仿等有機(jī)試劑，提取 過(guò)程安全性好。
【附圖說(shuō)明】 陽(yáng)03引圖1為實(shí)施例1中DNA在提取試劑盒的組分II中的分布，圖中，A、B、C分別為阿 膠、阿膠糕和阿膠液；
[0033] 圖2為實(shí)施例2中用本發(fā)明提取試劑盒所得阿膠及其衍生產(chǎn)品DNA中驢源性成 分的實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增曲線；每次PCR設(shè)2次平行反應(yīng)；圖中，1 :陽(yáng)性對(duì)照，Ct平均值為 18. 98 ;2、3、4分別為實(shí)施例1中阿膠、阿膠糕和阿膠液的DNA擴(kuò)增曲線，Ct平均值依次為 26. 01、26. 54、27. 18 ;5 :空白對(duì)照，無(wú)明顯擴(kuò)增。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[00對(duì)實(shí)施例1 :采用本發(fā)明的提取試劑盒提取阿膠及其衍生產(chǎn)品中的DNA
[0036] 1.提取試劑盒：
[0037]由組分I、組分II、蛋白酶K溶液和RNA酶溶液組成；
[0038]組分I的組成為：0.IMSDS，1.OMTris-肥1,0.5MNazEDTA,PH= 8.0 ;