一種高純度萊菔素的制備方法
【專利說明】
一、技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生產(chǎn)萊菔素的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高純度萊菔素的制備方法。
二、技術(shù)背景
[0002]硫代葡萄糖苷(簡稱硫苷)是十字花科植物重要的次生代謝物質(zhì)，硫苷及其降解產(chǎn)物對植物的抗病蟲害、特殊風味組成以及人類的健康具有重要作用。蘿卜中同樣含有硫苷，但蘿卜中硫苷的種類與其他十字花科植物存在不同，蘿卜中主要為4-甲基亞磺?；?3-丁稀基硫苷(俗稱蘿卜苷，glucoraphenin)。蘿卜苷在蘿卜籽中的含量最高，經(jīng)黑芥子酶催化降解可生成4-甲基亞磺酰基-3-丁烯基異硫氰酸酯(俗稱萊菔素，sulforaphene)。研究表明，萊菔素在抑制細胞突變及抗氧化等方面表現(xiàn)出極高的生物活性，具有極大的開發(fā)應用價值。蘿卜籽柏是生產(chǎn)蘿卜籽油的副產(chǎn)物，主要用作動物飼料，經(jīng)濟價值低。蘿卜籽柏中含有的大量硫苷未得到有效開發(fā)利用，造成資源的極大浪費。
[0003]現(xiàn)有生產(chǎn)萊菔素的方法，如2014年10月8日公開的公開號為CN 104086467A“一種利用溶劑萃取法和分子蒸餾法聯(lián)合制備萊菔素的方法”的發(fā)明專利，該專利公開的方法是:先將蘿卜籽水解后，再用有機溶劑將萊菔素萃取并減壓蒸餾得到萊菔素粗提物，最后利用分子蒸餾分離純化技術(shù)得到高純度的萊菔素產(chǎn)品。該方法存在的主要缺點有:①使用氯仿、二氯甲烷等有機試劑進行萃取，不但萃取選擇性較低，而且使用過程中存在危險因素并污染環(huán)境。②分子蒸餾分離純化技術(shù)所要求溫度較高，需長時間受熱，極易造成萊菔素降解，影響產(chǎn)品純度。③所用設(shè)備昂貴，技術(shù)要求較高，生產(chǎn)能力有限，不便于工業(yè)化生產(chǎn)。④采用的原料綜合利用率低，造成了蘿卜籽中蘿卜籽油、蛋白質(zhì)等的極大浪費。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有生產(chǎn)萊菔素方法的不足之處，提供一種高純度萊菔素的制備方法，該方法具有生產(chǎn)工藝連續(xù)、簡單、穩(wěn)定、提取純化效率高、收率高、資源綜合利用率高、無有害物質(zhì)排放等特點。采用本發(fā)明方法制備出的萊菔素具有產(chǎn)品純度高、性能穩(wěn)定等特點。
[0005]本發(fā)明的機理是:利用乙醇對蘿卜籽柏中的硫苷進行提取，可得到硫苷提取物。硫苷在黑芥子酶的催化下可發(fā)生降解，其中，蘿卜苷在黑芥子酶的催化下可生成萊菔素和葡萄糖，生成的葡萄糖會抑制蘿卜苷的降解，而加入葡萄糖氧化酶，可以使葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，降低葡萄糖對反應的抑制作用；酶膜反應器是膜和生物化學反應相結(jié)合的系統(tǒng)，依靠酶的專一性、催化性及膜特有的功能，可在生物反應過程中實現(xiàn)反應與分離的耦合，產(chǎn)物的原位分離、濃縮和酶的回收利用于一體，可以使酶重復使用以使反應體系維持較高的酶濃度，又可以把產(chǎn)物不斷地從反應體系中分離出來以減少產(chǎn)物對反應體系的抑制作用，從而提高萊菔素的降解產(chǎn)率。制備色譜是一種簡單而有效的制備數(shù)量較多的高純品的方法，具有柱效高、分離速度快、產(chǎn)品純度高、操作自動化等特點，是制備純化天然產(chǎn)物和化學合成產(chǎn)物的極好手段。當溶于流動相中的各組分經(jīng)過固定相時，與固定相發(fā)生吸附或分配作用，由于萊菔素與其它組分存在結(jié)構(gòu)差異，這種作用的大小、強弱不同，各組分在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出，使萊菔素得以分離。由于萊菔素在水中不穩(wěn)定，極易降解。將制備色譜與吸附樹脂層析柱耦聯(lián)，基于固相萃取原理，使低濃度萊菔素從制備色譜流出后迅速吸附于樹脂上，然后用少量無水乙醇將其洗脫下來，不僅提高其穩(wěn)定性，而且達到快速濃縮的目的。
[0006]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:一種高純度萊菔素的制備方法，以蘿卜籽柏為原料，經(jīng)過乙醇提取、酶膜反應、制備色譜、真空薄膜蒸發(fā)等生產(chǎn)得到高純度萊菔素。其具體的方法步驟如下:
[0007](I)制備蘿卜苷濃縮液
[0008]以蘿卜籽柏為原料，按照蘿卜籽柏的質(zhì)量(kg):體積分數(shù)為50?80%乙醇溶液的體積(L)之比為1: 6?9的比例，先在室溫下攪拌反應4?7h，再用質(zhì)量分數(shù)為2?6%的檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至2?3，然后再栗入澄清型管式離心機中，在轉(zhuǎn)速為15000?20000r/min的條件下，進行離心，分別收集離心清液和沉渣。對于收集的沉渣，因含有豐富的蛋白質(zhì)，經(jīng)干燥處理后可用作動物飼料添加劑。對于收集的離心清液，栗入反滲透濃縮器中，在0.15?0.25MPa下，進行第一次反滲透濃縮，直到第一次反滲透截留液的體積減少至原體積的10?15%為止，分別收集第一次反滲透透過液和第一次反滲透截留液。在收集的第一次反滲透截留液中，加入去離子水，補充至原體積，在同等條件下，再進行第二次反滲透濃縮，直到第二次反滲透截留液的體積減少至原體積的5?10%為止，分別收集第二次反滲透透過液和第二次反滲透截留液。對于收集第二次反滲透截留液，即為蘿卜苷濃縮液，用作下一步處理。對于收集的第二次反滲透透過液，與收集的第一次反滲透透過液合并，經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇，經(jīng)調(diào)配后得到體積分數(shù)為50?80%乙醇溶液，可繼續(xù)使用。
[0009](2)制備低純度萊菔素濃縮液
[0010]第⑴步完成后，將第⑴步收集的第二次反滲透截留液，按照第二次反滲透截留液:緩沖溶液的體積比為1: 8?12的比例，混合均勻得到原料液，備用。再按照第二次反滲透截留液的體積(L):黑芥子酶的質(zhì)量(g):葡萄糖氧化酶的質(zhì)量(g)為1: 1.5?3.0: 0.8?1.4的比例，先將黑芥子酶、葡萄糖氧化酶加入酶膜反應器的反應罐中，再將備用的原料液連續(xù)栗入反應罐中且不超過反應罐容積的2/3，在酶膜反應器的反應罐的溫度25?30°C、攪拌速度30?60r/min，酶膜反應器中膜組件的截留分子量為200Da或300Da、壓力為0.15?0.20MPa的條件下，進行連續(xù)水解反應和膜過濾，膜過濾過程中的截留液不斷返回到反應罐中。連續(xù)反應和膜過濾結(jié)束后，分別收集透過液和反應剩余液。對于收集的反應剩余液，經(jīng)干燥處理后可用作動物飼料添加劑。其中，緩沖溶液為PH 7.1的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液或PH 7.4的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖溶液。
[0011]對于收集的透過液，將透過液栗入到真空薄膜蒸發(fā)器中，在真空度為0.09?
0.095MPa、溫度為20?30°C條件下，進行真空薄膜蒸發(fā)，直到溶液中萊菔素含量達55?65%時為止。收集濃縮液，即為低純度萊菔素濃縮液，用作下一步處理。對于膜組件，經(jīng)再生后可反復使用。
[0012](3)制備高純度萊菔素
[0013]第⑵步完成后，首先將市售已活化的吸附樹脂(ADS-5樹脂或H103樹脂或HDP100樹脂)分散于去離子水中，并裝配成吸附樹脂層析柱，備用。將市售制備色譜填料(Pro C1810ym色譜填料或ODS-A C18 10 μ m色譜填料或ODS-AQ C18 1(^111色譜填料)，分散于無水乙醇中，并裝配成制備色譜柱，備用。
[0014]再按照制備色譜柱:第⑵步收集的濃縮液的體積比為1: 0.3?0.5的比例，將低純度萊菔素濃縮液以流速為制備色譜柱體積的2?3倍/小時的速度，栗入制備色譜柱中，進行吸附上樣。上樣結(jié)束后，在檢測波長為254nm，體積分數(shù)為25?35%的乙醇溶液為流動相，流動相流速為制備色譜柱體積的2?4倍/小時的條件下，將流動相栗入制備色譜柱中，進行洗脫制備。洗脫過程中，待流動相栗入15?16min時，將制備色譜流出端與吸附樹脂層析柱連接，制備色譜流出液流入層析柱中，使制備色譜流出液中的萊菔素吸附于樹脂上，待流動相栗入22?24min時，再將制備色譜流出端與吸附了萊菔素的吸附樹脂層析柱斷開，洗脫制備完成后，分別收集吸附了萊菔素的吸附樹脂層析柱、吸附樹脂層析柱流出液、制備色譜流出液和制備色譜柱。
[0015]對于收集的吸附了萊菔素的吸附樹脂層析柱，用與吸附了萊菔素的吸附樹脂層析柱體積相等的無水乙醇進行洗脫，洗脫完成后，收集洗脫液。對于收集的洗脫液，栗入到真空薄膜蒸發(fā)器中，在真空度為0.09?0.095MPa、溫度為20?30°C條件下，進行真空薄膜蒸發(fā)，以快速除去乙醇，最后得到高純度萊菔素。產(chǎn)品純度達98.7?99.5%，總收率為89.3?92.6%。對于洗脫后的吸附了萊菔素的吸附樹脂層析柱和收集的制備色譜柱，可再生后重復使用。對于收集的吸附樹脂層析柱流出液和制備色譜流出液混合后，經(jīng)反滲透濃縮回收乙醇，其中截留液經(jīng)凍干后可用作食品抗氧化劑等。
[0016]本發(fā)明采用上述技術(shù)方案后，主