一種剛地弓形蟲卵囊的制備、純化及保存方法
【專利說明】一種剛地弓形蟲卵囊的制備、純化及保存方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于剛地弓形蟲疫苗研究領(lǐng)域新技術(shù)，尤其涉及一種弓形蟲卵囊制備、純化及保存方法。
【背景技術(shù)】
[0003]弓形蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲，能寄生在除紅細胞外的所有有核細胞內(nèi)，隨血液和淋巴液擴散至全身各部位。中間宿主廣泛且無特異性，終末宿主僅限于貓或貓科動物。弓形蟲病是一種危害巨大的人畜共患疾病，在中國屬二類動物疫病。
[0004]弓形蟲作為重要的機會性致病原蟲，正常人和動物感染弓形蟲后多呈隱性感染，一般不引起明顯癥狀，但可在體內(nèi)長期潛伏，但如果發(fā)生在胎兒、機體免疫功能受損或缺陷的患者(如器官移植、艾滋病及惡性腫瘤患者)，潛伏感染可以被激活，從而引起嚴重的甚至危及生命的疾病，對人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成嚴重威脅。弓形蟲病是人畜先天性疾病和流產(chǎn)的原因之一，還可引起腦炎和視網(wǎng)膜炎。
[0005]剛地弓形蟲是寄生于貓的一種腸道球蟲，貓科動物可以排泄剛地弓形蟲卵囊，為終末宿主，恒溫動物均為中間宿主。弓形蟲的有性生殖和無性生殖階段均可發(fā)生于貓，除貓以外的宿主只有無性生殖階段。未孢子化的卵囊隨貓科動物糞便排出，卵囊在溫暖的環(huán)境和適宜的濕度中，孢子化形成兩個子包囊。在每個子包囊內(nèi)有四個子孢子。環(huán)境中的子孢子可在卵囊內(nèi)存活數(shù)月。人或動物攝食孢子化的卵囊后，子孢子進入腸道內(nèi)形成裂殖體。裂殖子在裂殖體內(nèi)的數(shù)量從兩個到幾百個不等。侵染的宿主細胞破裂時，裂殖子從裂殖體內(nèi)釋放出來繼續(xù)侵染其他細胞。
[0006]目前，對于弓形蟲病的預防和治療尚無有效方法，因此關(guān)于此方面也在進行積極的研究。弓形蟲卵囊可在外界環(huán)境中長期保存，保存期較長，是良好的疫苗研究和制備素材，因此如何制備剛地弓形蟲卵囊，如何純化及保存剛地弓形蟲卵囊也是目前科研人員一個重要的研究課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了提供弓形蟲疾苗的制備素材，本發(fā)明的目的是提供一種工藝簡單、操作方便制作成本低的弓形蟲卵囊制備、純化及保存方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是以下述方式實現(xiàn)的:
1、一種剛地弓形蟲卵囊的制備、純化及保存方法，包括以下步驟:
A、弓形蟲包囊的獲得；用不同種類的鮮肉作為樣品并進行標號，將每種類樣品制作若干張壓片，10倍顯微鏡下“S”形檢查壓片、發(fā)現(xiàn)組織弓形蟲包囊、記錄樣品標號、并標記為弓形蟲包囊陽性樣品，弓形蟲包囊特征為圓形，包囊壁1 μπι，包囊內(nèi)含有致密的呈香蕉狀的緩殖子； B、弓形蟲陰性貓的獲得；對2月齡健康貓進行微量采集足部血液，血液吸于濾紙上，用ELISA方法檢測血清內(nèi)抗弓形蟲抗體，選出弓形蟲抗體陰性貓；
C、弓形蟲包囊飼喂貓；對弓形蟲抗體陰性貓飼喂貓糧，待精神穩(wěn)定后，飼喂弓形蟲包囊陽性樣品；
D、收集1-21天糞便:弓形蟲抗體陰性貓食入弓形蟲包囊陽性樣品后，每日收取貓糞便，標記糞便日期，存放于4度冰箱；
E、從糞便分離弓形蟲卵囊:
(1)將收集的糞便加適量清水濕潤；
(2)繼續(xù)加清水搗碎糞便結(jié)塊直至均勻。
[0009](3)用雙層紗布將加水形成均勻液體的糞便過濾、并用清水沖洗；
(4)濾液倒入離心管中，離心；
(5)棄去上清液；
(6)在沉淀物中加入濃度為530g/L蔗糖溶液混勻；沉淀物與蔗糖溶液的體積比是:沉淀物:蔗糖溶液=1:10-40 ；
(7)將(6)中的混勻的液體混合物離心；
(8)用一次性移液管從(7)的離心管的上部取少量樣品進行顯微鏡檢查；
(9)如鏡檢發(fā)現(xiàn)卵囊，則用大口吸管輕吸離心管上部液體5ml，加清水至50ml，離心；
(10)去除上清，加2%硫酸按體積比，沉淀液:比硫酸溶液=1: 10，放置搖床7天，等待卵囊孢子化，孢子化的弓形蟲特征是每個包囊內(nèi)有2個子孢子；
F、弓形蟲卵囊的保存；將(10)中的孢子化的卵囊置于有螺旋口離心管內(nèi)。
[0010]在上述剛地弓形蟲卵囊的制備、純化及保存方法中優(yōu)選條件
D、收集1-10天糞便:弓形蟲抗體陰性貓食入弓形蟲包囊陽性樣品后，每日收取貓糞便，標記糞便日期，存放于4度冰箱；
E、從糞便分離弓形蟲卵囊:
(7)將(6)中的混勻的液體混合物離心，離心速度為2000轉(zhuǎn)/分，時間為10分鐘；
(9)如鏡檢發(fā)現(xiàn)卵囊，則用大口吸管輕吸離心管上部液體5ml，加清水至50ml，離心速度為2000轉(zhuǎn)/分，時間為10分鐘；
F、弓形蟲卵囊的保存；將(10)中的孢子化的卵囊置于有螺旋口離心管內(nèi)，離心管內(nèi)含少量空氣冰箱。
[0011]上述剛地弓形蟲卵囊的制備、純化及保存方法，還包括以下步驟:
G、卵囊污染材料的安全化處理。
[0012]—次性用品燒毀，其余物品用100度熱水，浸泡5分鐘或高壓滅菌，壓力為121Pa，時間為15min后再丟棄。
[0013]本發(fā)明的積極效果是:
1、弓形蟲卵囊活性好，可長期保存于4度冰箱，保存期大于5年，能提供良好的弓形蟲疫苗研究和制備素材。
[0014]2、該方法人工操作簡便易行，所采用的材料易于得到。
[0015]3、制備及純化弓形蟲卵囊過程易于控制，范圍較小，并對接觸過的材料、器皿進行無害化處理，避免了對環(huán)境污染。
[0016]【附圖說明】:
圖1為本發(fā)明采用Olympus光學顯微鏡CX21，物鏡10倍的弓形蟲包囊圖；
圖2為本發(fā)明采用Olympus光學顯微鏡CX21，物鏡40倍的弓形蟲包囊圖；
【具體實施方式】:
下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步說明實施例一:
A、弓形蟲包囊的獲得:
購買新鮮豬肉500克、雞肉500克、新鮮豬腦500克、雞頭全部，對樣品進行標號，制作組織壓片，每個樣品制作10張壓片，10倍顯微鏡下“S”形檢查壓片，發(fā)現(xiàn)組織弓形蟲包囊，記錄樣品標號，并標記為弓形蟲包囊陽性樣品。弓形蟲包囊特征為圓形，包囊壁1 ym，包囊內(nèi)含有致密的呈香蕉狀的緩殖子。
[0017]