一種利用超疏水表面結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)的結(jié)晶方法技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用超疏水表面結(jié)晶蛋白 質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于生物大分子很難在體外保持其特有的完整生物活性，所W，有關(guān)于如何富集 該類分子并獲得基本完整的生物活性的研究一直在進(jìn)行。近年來，越來越多的試驗(yàn)證明，W 晶體結(jié)構(gòu)存在的生物大分子是比較穩(wěn)定的。
[0003] 蛋白質(zhì)的結(jié)晶過程像其他小分子物質(zhì)一樣，是一個(gè)有序化的過程，即在溶液中處 于隨機(jī)狀態(tài)的分子轉(zhuǎn)變成有規(guī)則排列狀態(tài)的固體。蛋白質(zhì)分子的結(jié)晶過程一般分為Ξ個(gè)階 段：（1)成核過程，W溶液的過飽和度為推動(dòng)力使蛋白質(zhì)分子有序排列，形成特定大?。ㄅR 界尺寸）的晶核；（2)晶體生長，分子不斷的結(jié)合到形成的晶核上繼續(xù)生長；（3)生長停止， 固-液相間的擴(kuò)散交換達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，晶體宏觀上表現(xiàn)為停止生長。Ξ個(gè)階段按順序貫穿 整個(gè)結(jié)晶過程，缺一不可，而且各個(gè)階段之間并沒有明顯的界限劃分。但由于蛋白質(zhì)的相 對(duì)分子質(zhì)量很大，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其表面常帶有電荷，并且分子間一般都存在較多的結(jié)合位 點(diǎn)，相對(duì)于一些小分子的結(jié)晶，蛋白質(zhì)大分子結(jié)晶所設(shè)及的情況更為復(fù)雜，一般小分子的結(jié) 晶方法并不適用于大分子的晶體生長，使得生物大分子的晶體培養(yǎng)工作相當(dāng)困難。
[0004] 一般培養(yǎng)蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法有：批量結(jié)晶、蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶、液/液擴(kuò)散結(jié)晶。批量 結(jié)晶是最古老和最簡單的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法，它將所要結(jié)晶的蛋白質(zhì)與結(jié)晶劑按要求的濃度 在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)就混合起來W達(dá)到所要的過飽和度，使蛋白質(zhì)結(jié)晶析出長大。氣相擴(kuò)散法分 為懸滴法和座滴法兩種，其原理是將含有高濃度蛋白質(zhì)的溶液加入適當(dāng)?shù)娜軇?，隨著水分 蒸發(fā)，蛋白質(zhì)的濃度逐漸增大，并達(dá)到最適合結(jié)晶的水平，當(dāng)整個(gè)系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)時(shí)，晶 體形成并在動(dòng)態(tài)平衡中長大。液/液擴(kuò)散結(jié)晶又叫自由界面結(jié)晶，其利用濃度梯度使位于 毛細(xì)管中的結(jié)晶液和外部的緩沖溶液在界面處發(fā)生自由擴(kuò)散，使蛋白質(zhì)溶液過飽和并結(jié)晶 出來。但是，運(yùn)些制備蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法都存在一定的局限性：①在蛋白質(zhì)溶液中有時(shí)需要 加入有毒的沉淀劑，不適于生命過程的研究，如β-酬脂酷-ACP合成酶等晶體的制備，通常 需加入2-甲基-2, 4-戊二醇、苯甲基橫酷氯等劇毒物質(zhì)；②成本較高且制備晶體周期長，如 蒸發(fā)擴(kuò)散結(jié)晶需要購買昂貴的試劑盒來確定最佳結(jié)晶條件。③要求結(jié)晶的蛋白質(zhì)的濃度都 較高且許多蛋白質(zhì)不易結(jié)晶，運(yùn)對(duì)于較難提取，或較為昂貴的蛋白質(zhì)的進(jìn)一步分析研究不 利，如膜蛋白的結(jié)晶。
[0005] 因此，到目前為止，已經(jīng)獲得成功并能得到質(zhì)量優(yōu)異的蛋白質(zhì)晶體數(shù)目仍相對(duì)較 少，總的生物大分子獲得優(yōu)質(zhì)結(jié)晶體的統(tǒng)計(jì)數(shù)目也有待于增加，獲得質(zhì)量完美的蛋白質(zhì)晶 體成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的主要瓶頸，需要探索新的結(jié)晶方法W制備蛋白質(zhì)等生物大分子晶 體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種利用超疏水表面快速結(jié)晶蛋白質(zhì)的方 法。 陽007] 解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：將包含蛋白質(zhì)的緩沖液滴加到具有超疏 水表面的基材上，在密閉容器中加入緩沖液，然后將基材置于盛有緩沖液的密閉容器上方， 4~40 °C放置至晶體析出。
[0008] 上述的蛋白質(zhì)為溶菌酶、β-酬脂酷-ACP合成酶、刀豆蛋白A、牛血清蛋白等中的 任意一種，其中溶菌酶來源物種為人、雞、牛、鼠或駱駝，刀豆蛋白A來源于刀豆，均由西格 瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司提供，β-酬脂酷-ACP合成酶來源于結(jié)核桿菌。
[0009] 上述蛋白質(zhì)為溶菌酶且溶菌酶的質(zhì)量-體積濃度為20~lOOmg/mL時(shí)，不需要加 入沉淀劑，只需將僅含溶菌酶的緩沖液滴加到具有超疏水表面的基材上，在密閉容器中加 入緩沖液，然后將基材置于盛有緩沖液的密閉容器上方，4~25°C放置至晶體析出；其中蛋 白質(zhì)為溶菌酶或β-酬脂酷-ACP合成酶，且蛋白質(zhì)的質(zhì)量-體積濃度為0. 5~20mg/mL 時(shí)，為了節(jié)省結(jié)晶時(shí)間，可加入沉淀劑，即將包含蛋白質(zhì)和沉淀劑的緩沖液滴加到具有超疏 水表面的基材上，在密閉容器中加入緩沖液，然后將基材置于盛有緩沖液的密閉容器上方， 4~25°C放置至晶體析出；其中蛋白質(zhì)為刀豆蛋白A或牛血清蛋白，且蛋白質(zhì)的質(zhì)量-體積 濃度為5~80mg/mL時(shí)，同樣為了節(jié)省結(jié)晶時(shí)間，將包含蛋白質(zhì)和沉淀劑的緩沖液滴加到具 有超疏水表面的基材上，在密閉容器中加入緩沖液，然后將基材置于盛有緩沖液的密閉容 器上方，25~40°C放置至晶體析出。
[0010] 上述具有超疏水表面的基材是表面具有微納尺度溶菌酶相轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的基材或表 面具有微納尺度銅的基材或表面具有微納尺度Si化的基材。
[0011] 上述表面具有微納尺度溶菌酶相轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的基材根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?0150282788. 4、 發(fā)明名稱為"蛋白質(zhì)自組裝構(gòu)筑超疏水表面的方法"的發(fā)明專利申請(qǐng)中的方法制備而成，具 體制備方法為：將含溶菌酶的肥PES緩沖液和含Ξ(2-簇乙基）麟的肥PES緩沖液等體積混 合后用化0H調(diào)節(jié)抑值為6. 0~10. 0,所得混合液中溶菌酶的濃度為2~5mg/mL，Ξ(2-簇 乙基）麟的濃度為20~30mmol/L;將所得混合液滴加到基材表面，在潮濕環(huán)境中室溫培養(yǎng) 1~2小時(shí)，然后將基材表面用超純水清洗干凈，真空干燥，得到負(fù)載微納結(jié)構(gòu)溶菌酶相轉(zhuǎn) 變產(chǎn)物的基材；在負(fù)載微納結(jié)構(gòu)溶菌酶相轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的基材上修飾低表面能物質(zhì)，其中所述 的低表面能物質(zhì)為全氣辛酷氯、全氣十二烷基Ξ氯硅烷、1H，1H，2H，2H-全氣辛基Ξ氯硅烷、 4, 4, 5, 5, 6, 6, 7, 7, 8, 8, 9, 9, 10, 10, 11, 11, 11-十屯氣^--酷氯、十八碳酷氯、十六碳酷氯中 的任意一種，得到表面具有微納尺度溶菌酶相轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的基材。
[0012] 上述表面具有微納尺度銅的基材根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?0150282788. 4、發(fā)明名稱為"蛋 白質(zhì)自組裝構(gòu)筑超疏水表面的方法"的發(fā)明專利申請(qǐng)中的方法制備而成，具體制備方法為： 將 50血含有 50mmol/L邸TA、50mmol/LCuS〇4、0.Imol/L棚酸的水溶液用Imol/L化0H水 溶液調(diào)節(jié)抑值至7. 0后，將負(fù)載微納結(jié)構(gòu)溶菌酶相轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的基材浸入其中，再加入50mL 0.Imol/L二甲胺棚燒（梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司）水溶液，30°C反應(yīng)3小時(shí)， 得到表面具有微納尺度銅的基材。
[0013] 上述表面具有微納尺度Si〇2的基材根據(jù)"Mussel-inspiredSurfaceQiemistry forMultifunctionalCoatings"狂uDeng，DorisVollmer等，2012，Science)中的方法 制備而成，具體制備方法為：將基材放置在蠟燭上方，點(diǎn)燃蠟燭幾分鐘，即得到負(fù)載微納結(jié) 構(gòu)碳黑的基材；將負(fù)載微納結(jié)構(gòu)炭黑的基材置于干燥器中，并在干燥器中放置盛有四乙氧 基硅烷和氨水的體積比為1:1的混合液的小燒杯，24小時(shí)后炭黑表面沉積上一層Si〇2,然 后將該基材置于馬弗爐中600°C般燒2小時(shí)，炭黑被燒掉，得到表面只有微納結(jié)構(gòu)Si化層的 基材，再將該基材置于盛有1H，1H，2H，2H-全氣辛基Ξ氯硅烷的密閉容器上方，室溫真空密 閉放置3小時(shí)，得到表面具有微納尺度Si化的基材。
[0014] 上述基材為娃片、玻璃、化片等中的任意一種；緩沖液是醋酸鋼緩沖液、巧樣酸鋼 緩沖液、Tris-HCl緩沖液、肥陽S緩沖液、憐酸鹽緩沖液等中的任意一種，其抑值為4~7 ; 沉淀劑是氯化鋼、氯化錠、氯化巧、硫酸錠、聚乙二醇2000等中的任意一種。
[0015] 本發(fā)明利用超疏水表面結(jié)晶蛋白質(zhì)，相對(duì)于一般方法，本發(fā)明方法能夠快速有效 的得到蛋白質(zhì)晶體（如溶菌酶可在幾小時(shí)內(nèi)完成結(jié)晶），且極大地降低了蛋白質(zhì)結(jié)晶所需 濃度；另外，本發(fā)明結(jié)晶蛋白質(zhì)的方法不需要加入有毒的沉淀劑（如2-甲基-2, 4-戊二醇、 苯甲基橫酷氯等有毒物質(zhì)），溫和環(huán)保，且具有可控性，可通過滴加不同蛋白質(zhì)溶液的體積 得到不同尺寸的晶體，適用于大規(guī)模蛋白質(zhì)結(jié)晶的生產(chǎn)。本發(fā)明操作簡單，快速，溫和，具有 潛在的生物醫(yī)藥前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1是在實(shí)施例1得到的具有超疏水表面的娃片上形成的溶菌酶結(jié)晶的光學(xué)照 片。
[0017] 圖2是在實(shí)施例1得到的具有超疏水表面的娃片上形成的溶菌酶結(jié)晶的掃描電鏡 照片。
[0018] 圖3是在實(shí)施例1得到的具有超疏水表面的娃片上形成的溶菌酶結(jié)晶的能譜圖 片。
[0019] 圖4是在實(shí)施例1得到的具有超疏水表面的娃片上形成的溶菌酶結(jié)晶的透射電鏡 照片。
[0020] 圖5是在實(shí)施例2得到的具有超疏水表面的娃片上低濃度溶液下得到的溶菌酶結(jié) 晶的掃描電鏡照片。
[0021] 圖6是實(shí)施例3得到的具有超疏水表面的娃片上β-酬脂酷-ACP合成酶結(jié)晶的 掃描電鏡照片。
[0022] 圖7是實(shí)施例5得到的具有超疏水表面的娃片上得到的溶菌酶結(jié)晶的掃描電鏡照 片。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于 運(yùn)些實(shí)施例。 陽〇24] 實(shí)施例1
[0025] 1、制備表面具有微納尺度溶菌酶相轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的娃片
[0026] ①將5.Omg溶菌酶（來源于雞，分子量為14. 4邸a)和14. 3mgΞ(2-簇乙基）麟 分別加入ImL抑值為9. 4的肥陽S緩沖溶液中，然后將兩種溶液混合并用lOmmol/L化0H 水溶液調(diào)節(jié)其抑值為9. 4 ;將所得混合液滴加到2cmX2cm的娃片表面，在潮濕環(huán)境中室溫 培養(yǎng)1. 5小時(shí)，然后將娃片取出浸入超純水中，振蕩清洗干凈，室溫真空干燥1小時(shí)，得到負(fù) 載微納結(jié)構(gòu)的溶菌酶相轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的娃片。
[0027] ②將負(fù)載微納結(jié)構(gòu)的溶菌酶相轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的娃片浸入lOmL二氯甲燒中，在的保護(hù) 下，加入120μLS乙胺、100μL全氣辛酷氯（梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司），室 溫反應(yīng)4小時(shí)，得到表面具有微納尺度溶菌酶相轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的娃片。
[0028] 2、蛋白質(zhì)結(jié)晶
[0029] 將lOOmg溶菌酶溶解于ImL0.Imol/L抑值為