專利名稱：蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶或結(jié)晶條件篩選的裝置和方法，以及用于使蛋白質(zhì)結(jié)晶從含蛋白質(zhì)的樣品析出的蛋白質(zhì)結(jié)晶劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，正在進(jìn)行稱之為結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的研究，該研究試圖通過(guò)闡明蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的功能的關(guān)系，說(shuō)明編碼該蛋白質(zhì)的基因的功能。
蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)的解析通常首先要對(duì)要解析的蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件進(jìn)行篩選。然后，在最適的結(jié)晶條件實(shí)施結(jié)晶。通過(guò)將得到的結(jié)晶進(jìn)行X射線結(jié)構(gòu)解析，進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的解析。其中在對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件進(jìn)行篩選的過(guò)程中，直至決定得到用于進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)解析的充分良好的結(jié)晶條件之前，要花費(fèi)很多時(shí)間和很多蛋白質(zhì)樣品。由于這個(gè)原因，決定結(jié)晶條件成為空間結(jié)構(gòu)解析中的瓶頸。另外，也想出以蒸氣擴(kuò)散法為首的各種各樣的結(jié)晶方法。然而，實(shí)驗(yàn)操作煩雜等問(wèn)題依然很多。所以進(jìn)行了取代這些已有方法的新的結(jié)晶方法和裝置的開(kāi)發(fā)、蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選、或?yàn)榱耸菇Y(jié)晶更迅速、而且用更微量的樣品進(jìn)行，提出了各種蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置、結(jié)晶方法、結(jié)晶條件篩選方法的方案。例如在特開(kāi)平6-321700號(hào)公報(bào)中提出了使凝膠中含有沉淀劑和蛋白質(zhì)，通過(guò)將它們層疊來(lái)抑制溶液中看到的對(duì)流，使結(jié)晶在凝膠中生長(zhǎng)的方法。除此之外，為了使結(jié)晶方法簡(jiǎn)化，進(jìn)行了利用凝膠狀物的嘗試。另外，在進(jìn)行結(jié)晶條件的探索時(shí)，提出了各種各樣的沉淀劑。
然而，在利用凝膠狀物時(shí)，由于凝膠狀物和沉淀劑的組合，存在著凝膠白濁，或不能進(jìn)行凝膠化反應(yīng)的問(wèn)題。凝膠如果白濁，存在著不能通過(guò)顯微鏡觀察有無(wú)結(jié)晶狀態(tài)的問(wèn)題。
另外，本發(fā)明者中的一部分人以迅速、用微量樣品經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選為目的，提出了在微陣列的芯片上進(jìn)行結(jié)晶實(shí)驗(yàn)?zāi)菢拥慕Y(jié)晶裝置(例如，WO03/053998號(hào)小冊(cè)子)。
在WO03/053998號(hào)小冊(cè)子所述的發(fā)明中使用了微陣列。該微陣列在通過(guò)貫通孔形成的各區(qū)內(nèi)保持有凝膠狀物。并且在各個(gè)凝膠狀物中含有很多種類和濃度的蛋白質(zhì)結(jié)晶劑。通過(guò)使該微陣列與含蛋白質(zhì)的樣品接觸，可以一次對(duì)多個(gè)結(jié)晶條件進(jìn)行篩選。進(jìn)而可以用微量的蛋白質(zhì)樣品實(shí)施，效率非常高。
但是，在上述的蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置中，在微陣列的區(qū)之間會(huì)發(fā)生含蛋白質(zhì)的樣品和/或結(jié)晶劑的移動(dòng)、混合(污染)。因此，存在結(jié)晶析出的條件與預(yù)先區(qū)內(nèi)的凝膠狀物中含有的結(jié)晶劑的濃度和種類不一致的可能性。
另外，使用這樣的裝置需要通過(guò)手工作業(yè)向結(jié)晶劑保持部供給含蛋白質(zhì)的樣品，操作變得煩雜。而自動(dòng)供給含蛋白質(zhì)的樣品的自動(dòng)裝置價(jià)高。
本發(fā)明正是為了解決上述課題而作出的發(fā)明。本發(fā)明的目的在于提供不發(fā)生凝膠白濁化地使凝膠化反應(yīng)進(jìn)行的蛋白質(zhì)結(jié)晶劑及其制備方法，以及能夠迅速而且經(jīng)濟(jì)地高可靠性地實(shí)施蛋白質(zhì)的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)或結(jié)晶條件篩選的蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供以下內(nèi)容。
·一種蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置，其特征是具有蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列，其具有2個(gè)或其以上保持蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的結(jié)晶劑保持部；和與上述蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列層疊的板，上述板具有對(duì)應(yīng)于上述結(jié)晶劑保持部的可填充含蛋白質(zhì)樣品的結(jié)晶區(qū)，和設(shè)置在該結(jié)晶區(qū)之間的凹部。
·一種蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠，其在凝膠狀物中保持有氯化鈉，所述凝膠狀物包含選自丙烯酰胺、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯?；谆被一谆然稃}中的至少一種單體。
·一種蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠，其在凝膠狀物中保持有MPD，所述凝膠狀物包含二甲基丙烯酰胺。
·一種蛋白質(zhì)結(jié)晶劑，其在凝膠狀物中保持有磷酸Na/K，所述凝膠狀物包含2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸。
·一種蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠，其在凝膠狀物中保持有硫酸銨，所述凝膠狀物包含甲基丙烯?；谆被一谆然稃}。
·一種蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠，其在凝膠狀物中保持有丙二酸鈉，所述凝膠狀物包含丙烯酰胺。
·一種蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠，其在凝膠狀物中保持有PEG6k，所述凝膠狀物包含聚氧乙烯單丙烯酸酯。


圖1是表示本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置的使用狀態(tài)的模式圖。
圖2表示本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)結(jié)晶用的微陣列的例子。
圖3是表示本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置的一個(gè)例子的模式圖。
圖4是本發(fā)明中使用的板的一部分的剖面圖。
圖5是本發(fā)明中使用的板的平面圖。
圖6是表示本發(fā)明中的板和樣品填充輔助工具的使用狀態(tài)的平面圖。
圖7是本發(fā)明中使用的支持體的平面圖。
圖8是表示本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置的使用狀態(tài)的平面圖。
符號(hào)說(shuō)明12中空纖維；16結(jié)晶劑保持部；18蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列；20支持體；24板；32結(jié)晶區(qū)；34凹部具體實(shí)施方式
以下參照附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。
圖1是表示本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置的一個(gè)例子的模式圖。
該例蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置就像圖1所表示的那樣，備有支持體20、硅橡膠制的襯墊22、蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18、板24。
襯墊22具有與蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18同樣形狀和面積的中空部23。在支持體20中設(shè)置有與該襯墊22的外周同樣形狀和大小的微陣列支持部26。在微陣列支持部26中做了一個(gè)與襯墊22同一形狀的標(biāo)記28。
襯墊22，與標(biāo)記28位置對(duì)準(zhǔn)地設(shè)置在微陣列支持部26上。并且蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18在微陣列支持部26上被容納設(shè)置在襯墊22的中空部23中。這里，為了使設(shè)置在板24的結(jié)晶區(qū)32與蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18上的結(jié)晶劑保持部16正確接觸，優(yōu)選使蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的上面與支持體20的上面成為同樣的高度。
圖3是板24的中央部被放大的剖面圖。在圖4中給出了支持體20、蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18、板24被組裝的狀態(tài)的一部分剖面圖。
板24就像圖3、4所示那樣，具有與蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的各個(gè)結(jié)晶劑保持部16對(duì)應(yīng)排列的結(jié)晶區(qū)32和設(shè)置在該結(jié)晶區(qū)32之間的凹部34。另外，各個(gè)結(jié)晶區(qū)32分別被結(jié)晶區(qū)支持部31的前端支持，所述結(jié)晶區(qū)支持部是在板24中相對(duì)于凹部34為凸的部位。
該板24被層疊在由支持體20支持的蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的上面。即，如圖4所示那樣，結(jié)晶區(qū)32被結(jié)晶劑保持部16密封。進(jìn)而，各個(gè)凹部34處于由結(jié)晶區(qū)支持部31支持的結(jié)晶區(qū)32與同樣由結(jié)晶區(qū)支持部31支持的結(jié)晶區(qū)32之間的位置。
以下，將支持體20中支持蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的面稱為微陣列支持面100，將在板24中與蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18接觸的面稱為反應(yīng)面102，而將與此面相反的面稱為外側(cè)面104。
另外，在板24中，排列結(jié)晶區(qū)32的區(qū)域的外邊緣成凹部。因此在板24中形成了成凹狀的一定面積的區(qū)域。以下，將在板24的反應(yīng)面中排列結(jié)晶區(qū)32的凹部的區(qū)域稱為密封部30。
在該例中，蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18被設(shè)置在支持體20的微陣列支持部26上。而蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18只要被設(shè)置為結(jié)晶劑保持部16對(duì)應(yīng)結(jié)晶區(qū)32，將該結(jié)晶區(qū)32密封那樣即可。即蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18可以粘接在支持體20上，也可以使微陣列支持部26形成凹狀，不粘接在該微陣列支持部的底部而層疊在該底部上。
支持體20的材料和形狀只要是可固定蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的材料和形狀，就沒(méi)有特別限定。作為支持體20的材料，通過(guò)使用透光性材料，結(jié)晶裝置本身就能夠迅速而且簡(jiǎn)便地用顯微鏡確認(rèn)生成的結(jié)晶、隨時(shí)觀察結(jié)晶的生長(zhǎng)過(guò)程，因此優(yōu)選。作為透光性材料，可列舉例如，丙烯酸樹(shù)脂、聚碳酸酯樹(shù)脂、聚苯乙烯樹(shù)脂、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃等。
對(duì)于支持體20實(shí)施用于決定蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的固定位置的標(biāo)記。標(biāo)記方法只要是能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)結(jié)晶用微陣列18正確固定的方法，則沒(méi)有特別限定?？闪信e例如，具有與蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18同樣的形狀和面積的印痕，在支持體20上對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的所定位置的位置噴涂點(diǎn)等。
在這個(gè)例子中，就像圖7所示那樣，在支持體20上進(jìn)一步設(shè)置有板定位孔44，該孔使板24與支持體20進(jìn)行層疊時(shí)使結(jié)晶區(qū)32與結(jié)晶劑保持部16對(duì)應(yīng)。
蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18具有2個(gè)或其以上保持蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的結(jié)晶劑保持部16。
作為結(jié)晶劑保持部16，可以使用在凝膠等能夠保持蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的多孔質(zhì)體(以下稱為保持相)中保持了蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的保持部。保持相就像圖4所示那樣，只要是當(dāng)填充到結(jié)晶區(qū)32的含蛋白質(zhì)的樣品與結(jié)晶劑保持部16接觸時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)晶劑可以由該保持相向結(jié)晶區(qū)32移動(dòng)的就可以。
作為上述保持相，優(yōu)選使用凝膠。通過(guò)使用凝膠，蛋白質(zhì)結(jié)晶劑由結(jié)晶劑保持部16向填充到結(jié)晶區(qū)32的含蛋白質(zhì)的樣品的移動(dòng)可以被控制在適度緩慢的速度。因此可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的結(jié)晶化。
凝膠的材料沒(méi)有特別限制，但可以使用例如丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、N-丙烯酰氨基乙氧基乙醇、N-丙烯酰氨基丙醇、N-羥甲基丙烯酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸羥乙基酯、(甲基)丙烯酸、烯丙基糊精等單體的1種或2種或其以上與甲叉雙(甲基)丙烯酰胺、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯等多官能性單體在例如水性介質(zhì)中共聚合得到的凝膠。此外作為凝膠也可以使用瓊脂糖、海藻酸、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙二醇等的凝膠、或?qū)⑺鼈兘宦?lián)獲得的凝膠。
為了使上述那樣的凝膠保持在蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18中，例如可以將含有作為凝膠構(gòu)成成分的丙烯酰胺等單體、多官能性單體和引發(fā)劑的溶液注入該容器，使它們聚合、凝膠化即可。作為使其凝膠化的方法，除了在多官能性單體存在下使它們共聚合的方法之外，也可以是在沒(méi)有多官能性單體存在下使它們共聚合后使用交聯(lián)劑的方法。另外，作為凝膠材料使用瓊脂糖時(shí)，可以通過(guò)降低溫度進(jìn)行凝膠化。
當(dāng)使蛋白質(zhì)結(jié)晶劑保持在凝膠中時(shí)，對(duì)該方法沒(méi)有特別的限制。例如，可以預(yù)先將蛋白質(zhì)結(jié)晶劑與上述的聚合性單體混合后先導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，然后進(jìn)行聚合反應(yīng)使其形成凝膠。由此可以使蛋白質(zhì)結(jié)晶劑保持在凝膠中。這里，可以使蛋白質(zhì)結(jié)晶劑含浸在多孔性粒子等中，使該粒子包括在凝膠中。
作為蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的材料、形狀等，只要是反應(yīng)用物質(zhì)多數(shù)整列配置，不妨礙觀察結(jié)晶析出，就沒(méi)有特別的限定。
作為蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的材料，可列舉例如玻璃、樹(shù)脂、金屬等。另外也可以使用將這些材料組合后制作的復(fù)合體。但是為了容易確認(rèn)蛋白質(zhì)結(jié)晶有無(wú)析出，優(yōu)選使用透光性高的材料。
作為蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的形狀，可列舉例如圓形、正方形、長(zhǎng)方形等形狀。另外，其厚度考慮到結(jié)晶效率的提高、以及結(jié)晶析出觀察的容易化和迅速化可以任意選擇。例如可以做成0.1～5mm、優(yōu)選0.2～2mm。
圖2作為在本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置中使用的蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列的適合的例子，展示了多個(gè)中空管狀體排列構(gòu)成的微陣列。就像圖2所表示的那樣，作為中空管狀體，至少2根的中空纖維12被按區(qū)排列固定在基板10上。這些中空纖維12具有中空部14。在這些中空部14中填充保持有蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的凝膠，構(gòu)成結(jié)晶劑保持部16。即，在基板10上至少2個(gè)結(jié)晶劑保持部16按區(qū)排列構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18。
中空纖維12，可列舉例如由甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯等甲基丙烯酸酯系單體、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯等丙烯酸酯系單體的均聚物或它們的共聚物、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、降冰片烯/乙烯共聚物、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、玻璃等形成的中空纖維。
中空纖維12的內(nèi)壁表面可以在無(wú)處理的狀態(tài)下使用。也可以根據(jù)需要，實(shí)施等離子體處理或γ射線、電子射線等放射線處理。進(jìn)而，中空纖維12，根據(jù)需要也可以導(dǎo)入反應(yīng)性官能團(tuán)。
中空纖維12的外徑，為了能夠?qū)⒚繂挝幻娣e的結(jié)晶劑保持部16的數(shù)目做多，優(yōu)選在2mm或其以下。更優(yōu)選0.7mm或其以下。而中空纖維的內(nèi)徑可在上述外徑的范圍內(nèi)適當(dāng)選擇。
作為在基板10上對(duì)2個(gè)或其以上的中空纖維12進(jìn)行按區(qū)排列、固定的方法，可以使用以下的方法。即，首先使中空纖維按照規(guī)定的間隔平行排列。將這些中空纖維12收束后粘接，可以形成纖維排列體(三維排列體)。使用超薄切片機(jī)等制作切片的裝置將得到的三維排列體按照與纖維軸交差的方向，優(yōu)選相對(duì)于纖維軸垂直的方向切斷。由此，可以得到由具有中空纖維排列體斷面的薄片(圖2)構(gòu)成的微陣列。薄片的厚度通?？梢宰龀?00～5000μm使用。優(yōu)選200～2000μm。
此時(shí)，通過(guò)將中空纖維有規(guī)則排列，用樹(shù)脂粘接劑等粘接，可以得到例如在縱橫方向中空纖維12整然有規(guī)則排列的中空纖維排列體。中空纖維排列體的形狀沒(méi)有特別限定。通常通過(guò)將纖維有規(guī)則排列，可形成正方形、長(zhǎng)方形、圓形等。
所謂「有規(guī)則」指的是能夠使一定大小的框架中含有的纖維的根數(shù)一定那樣有序排列。例如在使直徑1mm的纖維成束后排列為斷面成縱為10mm、橫為10mm的正方形那樣時(shí)，在該正方形的框內(nèi)(1cm2)的1邊含有的纖維數(shù)為10根。然后將該10根纖維捆成1列，做成1層片。然后將該片成10層那樣重疊。結(jié)果可以排列成縱10根、橫10根，合計(jì)100根的纖維。但是，使纖維有規(guī)則排列的手法并不限定于上述那樣將片層疊的方法。
作為蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18，通過(guò)使用象上述那樣將多個(gè)中空管狀體排列構(gòu)成的微陣列，可以制造能很好控制蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的厚度、結(jié)晶劑保持部16的體積、被保持的蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的種類以及濃度等，而且可高效率地制造蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置。
另外，蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18優(yōu)選是通過(guò)用可防止與外面空氣接觸的密閉性好的容器或通過(guò)密封等密閉保存。作為密閉性好的容器，可列舉例如氣體或水透過(guò)率小的高分子材料或玻璃、金屬等。而這樣的微陣列優(yōu)選在低溫下保存，特別在長(zhǎng)期保存時(shí)也可以冷凍保存。
另外，各個(gè)結(jié)晶劑保持部16優(yōu)選由被制造為不同的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的凝膠構(gòu)成。這樣一來(lái)，當(dāng)進(jìn)行結(jié)晶條件的篩選時(shí)，在一枚微陣列上可迅速進(jìn)行篩選。
這里的所謂蛋白質(zhì)結(jié)晶條件指的是蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的種類和濃度、使蛋白質(zhì)結(jié)晶劑保持的保持相、例如使蛋白質(zhì)結(jié)晶劑保持、固化后的凝膠的pH、凝膠的組成、交聯(lián)度、結(jié)晶劑保持部16和結(jié)晶區(qū)32的溫度、時(shí)間、冷卻分布圖等。
作為蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的種類，可列舉例如沉淀劑、pH緩沖劑、它們的任意組合等。
作為沉淀劑，可列舉例如氯化鈉、聚乙二醇、2-甲基-2，4-戊二醇、硫酸銨等。作為pH緩沖劑，可列舉例如醋酸鈉三水合物、磷酸鉀、咪唑、檸檬酸鈉、二甲胂酸鈉等。這些試劑可以單獨(dú)使用，也可以使用2種或其以上的組合。另外，作為蛋白質(zhì)結(jié)晶劑，可以使用市售品EmeraldBioStructures公司生產(chǎn)的「WIZARD II」、HamptonResearch公司生產(chǎn)的「Crystal screen」、「Grid Screen」等。
作為蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的濃度，因使用的蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的種類不同而不同，例如，在包含聚乙二醇的沉淀劑的情況下為5～50體積％、優(yōu)選10～35體積％。另一方面，在pH緩沖劑的情況下為0.05～0.5mol/L、優(yōu)選0.1～0.2mol/L。
象上述那樣，通過(guò)將各個(gè)結(jié)晶劑保持部16制備成各個(gè)不同的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件，可以迅速進(jìn)行對(duì)象蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件的篩選。這里，優(yōu)選例如將蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的濃度設(shè)定為多階段。具體來(lái)說(shuō)，在使用包含氯化鈉的沉淀劑時(shí)，在0.5～4.0mol/L的范圍內(nèi)，做成5階段、10階段、20階段那樣的稀釋系列。然后可以將各個(gè)濃度的蛋白質(zhì)結(jié)晶劑填充到結(jié)晶劑保持部16中。
為了在更多的結(jié)晶條件下一塊進(jìn)行結(jié)晶，優(yōu)選蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18具有10～1000個(gè)結(jié)晶劑保持部16。例如，在通常的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選中，需要對(duì)800左右的結(jié)晶條件進(jìn)行研究。因此，結(jié)晶劑保持部的數(shù)目?jī)?yōu)選在10個(gè)或其以上。另一方面，如果蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18如果具有超過(guò)1000的結(jié)晶劑保持部16，則結(jié)晶劑保持部16之間的間隔變得非常窄，處理的效率差。
蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18為了容易進(jìn)行蛋白質(zhì)析出的確認(rèn)，優(yōu)選是由透光性高的材料構(gòu)成。
在這個(gè)例子中，襯墊22為硅橡膠制品。襯墊的材料只要是適合與蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置中的其它構(gòu)成要素(例如，蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18、板24、支持體20)組合使用的材料就可以。
板24具有對(duì)應(yīng)于結(jié)晶劑保持部16的可填充含蛋白質(zhì)的樣品的結(jié)晶區(qū)32、和設(shè)置在這些結(jié)晶區(qū)32之間的凹部34。即，在板24上設(shè)置有與結(jié)晶劑保持部16同樣數(shù)目的結(jié)晶區(qū)32。
在板24中，作為與后述的樣品填充輔助工具位置吻合的定位部，優(yōu)選例如，形成樣品填充輔助工具定位孔50。
在該例中，在支持體20上進(jìn)一步設(shè)置有板定位構(gòu)件44，該板定位構(gòu)件44在對(duì)板24和支持體20進(jìn)行層疊時(shí)使得結(jié)晶區(qū)32與結(jié)晶劑保持部16對(duì)應(yīng)。在板24上形成有與設(shè)置在支持體20上的板定位構(gòu)件44相對(duì)應(yīng)的板定位孔46。
在該例中，就像圖1、5所示那樣，進(jìn)一步穿設(shè)有從板24的外側(cè)面104貫通到反應(yīng)面102的密封劑注入口48。就像圖5所示那樣，在該例中，兩個(gè)密封劑注入口48借助于密封部30貫穿兩個(gè)相對(duì)的兩側(cè)。由此，當(dāng)從一方的密封劑注入口48向密封部30注入密封劑時(shí)，由于開(kāi)始存在于密封部30內(nèi)的空氣由另一方的密封劑注入口48排出，所以在密封部30中位于凹部34之間的結(jié)晶區(qū)32被更確實(shí)地密封。
板24的材料和形狀只要是可以與蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18疊合的，就沒(méi)有特別的限定，考慮蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的形狀，可以使用任意的材料和形狀。作為板的材料，例如列舉玻璃、樹(shù)脂、金屬等?？梢詮倪@些材料中選擇任意的材料、單獨(dú)一種，或?qū)煞N組合后使用。另外為了觀察結(jié)晶區(qū)32中的蛋白質(zhì)的結(jié)晶狀態(tài)，優(yōu)選與蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18疊合時(shí)，與各個(gè)結(jié)晶劑保持部16對(duì)應(yīng)重疊的部分具有透光性。因此，作為板24的材料，優(yōu)選透光性材料，例如透明的樹(shù)脂、玻璃等。
板24優(yōu)選進(jìn)一步具有回收結(jié)晶區(qū)32中析出的結(jié)晶的結(jié)晶回收機(jī)構(gòu)。使用這樣的結(jié)晶回收機(jī)構(gòu)，可以回收結(jié)晶區(qū)32析出的結(jié)晶，用作種晶。然后通過(guò)繼續(xù)進(jìn)行結(jié)晶生長(zhǎng)過(guò)程，可以迅速得到經(jīng)得住X射線結(jié)構(gòu)解析的結(jié)晶。當(dāng)然，如果析出的結(jié)晶本身為經(jīng)得住X射線結(jié)構(gòu)解析的結(jié)晶，則將其回收后在解析中使用。
作為這樣的結(jié)晶回收機(jī)構(gòu)，可列舉例如如下的機(jī)構(gòu)等，其中密封部30由與板24獨(dú)立的構(gòu)件構(gòu)成，與板24通過(guò)鉸鏈連接，根據(jù)需要可以將密封部30向外側(cè)面104打開(kāi)。
結(jié)晶區(qū)32的形狀只要是能夠填充含蛋白質(zhì)的樣品，與結(jié)晶劑保持部16接觸時(shí)被密封的形狀，就沒(méi)有特別的限定。
結(jié)晶區(qū)32的容量，當(dāng)以對(duì)于對(duì)象蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶條件的篩選為目的時(shí)，為了將結(jié)晶條件篩選所需要的蛋白質(zhì)量減少，優(yōu)選不足0.5μl。另一方面，如果以將這里析出的結(jié)晶繼續(xù)供X射線結(jié)構(gòu)解析，或用于制作供結(jié)構(gòu)解析的結(jié)晶的種晶為目的時(shí)，結(jié)晶區(qū)32的容量?jī)?yōu)選是在0.5μl或其以上。此時(shí)，作為為了得到能夠進(jìn)行X射線結(jié)構(gòu)解析的0.1mm或其以上的大的結(jié)晶，結(jié)晶劑保持部16和結(jié)晶區(qū)32的面積的關(guān)系只要滿足如下條件即可，即結(jié)晶劑保持部16和結(jié)晶區(qū)32進(jìn)行接觸的面的面積可以使得保持在結(jié)晶劑保持部16的結(jié)晶劑向結(jié)晶區(qū)32移動(dòng)，并能夠與填充在該結(jié)晶區(qū)32的含蛋白質(zhì)的樣品反應(yīng)。與結(jié)晶劑保持部16相比，結(jié)晶區(qū)32可以更大。但結(jié)晶區(qū)32優(yōu)選不與構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的基板12接觸。
在該例中，如圖4所示那樣，在設(shè)置在結(jié)晶區(qū)32之間的所有凹部34都填充有密封劑35。
作為密封劑35，只要是與含蛋白質(zhì)的樣品不互相溶解，不侵蝕板24、襯墊22、構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的基板12等構(gòu)件的都可以。例如可以使用石蠟油、硅油等。
即使不使用密封劑35，由于具有凹部34，也可以防止含蛋白質(zhì)的樣品向鄰接的區(qū)侵入。然而如果使用密封劑35，在可更確實(shí)地防止含蛋白質(zhì)的樣品之間的混合和向鄰接的結(jié)晶區(qū)32侵入的同時(shí)，還可以防止含蛋白質(zhì)的樣品的蒸發(fā)。
在該例中，還顯示了對(duì)支持體20支持的蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18與板24進(jìn)行壓接的機(jī)構(gòu)。具體如圖1所示那樣，設(shè)置有貫通支持體20的第一螺紋孔40以及對(duì)應(yīng)于第一螺紋孔貫通板24的第二螺紋孔42。就像圖1所示的那樣，將螺絲41擰入第一螺紋孔40、第二螺紋孔42。通過(guò)使用這樣的機(jī)構(gòu)，可以使結(jié)晶區(qū)32更穩(wěn)定地保持在密閉狀態(tài)。
在該例蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置中，還可以設(shè)置監(jiān)測(cè)結(jié)晶區(qū)32中的蛋白質(zhì)的結(jié)晶化的檢測(cè)機(jī)構(gòu)。
作為上述檢測(cè)機(jī)構(gòu)，可列舉例如，包括設(shè)置在板24的外側(cè)面104的顯微鏡和搭載在顯微鏡上的CCD照相機(jī)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)。在這樣的檢測(cè)機(jī)構(gòu)中，通過(guò)搭載在顯微鏡上的CCD照相機(jī)可以對(duì)結(jié)晶析出的舉動(dòng)進(jìn)行攝影紀(jì)錄，通過(guò)對(duì)紀(jì)錄的圖像資料進(jìn)行處理，可以迅速判斷結(jié)晶是否成功。因此可以迅速?zèng)Q定蛋白質(zhì)結(jié)晶條件。
這里，列舉該例蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置的合適的使用方法。
在該例中，使用樣品填充輔助工具，可以向結(jié)晶區(qū)32中填充含蛋白質(zhì)的樣品。
(結(jié)晶區(qū))當(dāng)使用本發(fā)明以蛋白質(zhì)的結(jié)晶為目的時(shí)，優(yōu)選將結(jié)晶區(qū)32的容量做成0.5μl或其以上。當(dāng)以更迅速地篩選蛋白質(zhì)結(jié)晶條件為目的時(shí)，優(yōu)選將結(jié)晶區(qū)32的容量做成不足0.5μl。
(含蛋白質(zhì)的樣品)在本發(fā)明中，所謂的含蛋白質(zhì)的樣品是含有要進(jìn)行結(jié)晶的，或含有要對(duì)結(jié)晶條件特定的蛋白質(zhì)(以下稱為對(duì)象蛋白質(zhì))的樣品。作為蛋白質(zhì)，可列舉天然或合成的肽、多肽、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物。這些物質(zhì)優(yōu)選是從天然或合成材料提取、分離、或通過(guò)基因工程手法或化學(xué)合成手法等生成后，通過(guò)組合運(yùn)用通常的純化法，例如溶劑提取、柱層析、液相層析等，對(duì)對(duì)象蛋白質(zhì)預(yù)先進(jìn)行純化得到的物質(zhì)。
含蛋白質(zhì)的樣品中的蛋白質(zhì)濃度和純度也是蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的一個(gè)要因。因此，可以制備多個(gè)階段的濃度和純度的含蛋白質(zhì)的樣品，使其與蛋白質(zhì)結(jié)晶劑反應(yīng)。例如，優(yōu)選蛋白質(zhì)濃度在1～50mg/ml范圍內(nèi)變更多個(gè)階段。另外，與蛋白質(zhì)結(jié)晶劑反應(yīng)的含蛋白質(zhì)的樣品的量，可以根據(jù)使用的結(jié)晶區(qū)32的容量和數(shù)目等適當(dāng)變更。另外，含蛋白質(zhì)的樣品的粘度，只要是將保持有含該蛋白質(zhì)的樣品的結(jié)晶區(qū)32朝下而保持板24時(shí)，含蛋白質(zhì)的樣品不從結(jié)晶區(qū)32漏出，就沒(méi)有特別的限定。
含蛋白質(zhì)的樣品，除了對(duì)象蛋白質(zhì)之外，也可以含有有助于蛋白質(zhì)溶解的蛋白可溶化劑、還原劑等穩(wěn)定化劑等。作為蛋白質(zhì)可溶化劑，可列舉例如，可使膜蛋白溶解的表面活性劑等。如果使用表面活性劑，在含蛋白質(zhì)的樣品中，例如可以使膜蛋白等水溶性低的蛋白質(zhì)很好地分散。因此，運(yùn)用該例蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置，可以更有效地進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)晶化。
首先，如圖1所示那樣，將板24象圖5所示那樣使反應(yīng)面102朝上靜置。在穿過(guò)板24的樣品填充輔助工具定位孔50和板定位孔46中，各插入一根與該樣品填充輔助工具定位孔50以及板定位孔46同一直徑的圓柱形的定位銷52。
接下來(lái)，在該反應(yīng)面102的上面，如圖6所示那樣，設(shè)置薄板狀樣品填充輔助工具54。該輔助工具具有對(duì)應(yīng)于板24上的結(jié)晶區(qū)32排列的穿孔56，以及作為使該穿孔56對(duì)應(yīng)于板24上結(jié)晶區(qū)32的位置配合機(jī)構(gòu)的2個(gè)位置配合孔58。此時(shí)，使穿過(guò)樣品填充輔助工具54的位置配合孔58對(duì)準(zhǔn)后插入分別固定于板24的樣品填充輔助工具定位孔50和板定位孔46的定位銷52。然后，將樣品填充輔助工具54設(shè)置在板24上。通過(guò)這樣操作，可使板24的結(jié)晶區(qū)32和樣品填充輔助工具54的穿孔56對(duì)應(yīng)地設(shè)置樣品填充輔助工具54。
然后，在設(shè)置在板24上的樣品填充輔助工具54的上面，裝載含蛋白質(zhì)的樣品，其分量為可遍及樣品填充輔助工具54中配置了穿孔56的整個(gè)區(qū)域。
進(jìn)而，使用刮板等擦過(guò)樣品填充輔助工具54的表面，向?qū)?yīng)于穿孔56的結(jié)晶區(qū)32中填充含蛋白質(zhì)的樣品。
然后，將定位銷從板24的反應(yīng)面102側(cè)向外側(cè)面104押出，將樣品填充輔助工具從板24上卸下。這樣一來(lái)，在整個(gè)結(jié)晶區(qū)32都填充了含蛋白質(zhì)的樣品。
就像以上說(shuō)明的那樣，通過(guò)將樣品填充輔助工具54設(shè)置在板24的反應(yīng)面102上，從其上面添加含蛋白質(zhì)的樣品，可以將含蛋白質(zhì)的樣品正確地填充到結(jié)晶區(qū)32中。
另外，樣品填充輔助工具54，從成形的容易程度、強(qiáng)度、耐鹽性等觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選用不銹鋼制造的。另外，優(yōu)選在樣品填充輔助工具54上設(shè)置通過(guò)鑷子進(jìn)行操作的部位以便將含蛋白質(zhì)的樣品填充到結(jié)晶區(qū)32后容易將樣品填充輔助工具54卸下。例如，優(yōu)選一端設(shè)計(jì)成向上側(cè)折彎的折彎部59。
此處，將定位銷52分別固定在樣品填充輔助工具定位孔50和板定位孔46。但在板24中，樣品填充輔助工具54定位孔50也可以獨(dú)立于與板定位孔46形成多個(gè)。
作為將含蛋白質(zhì)的樣品填充到結(jié)晶區(qū)32的方法，只要是可以按照同一分量將含蛋白質(zhì)的樣品填充到所有的結(jié)晶區(qū)32中，防止向結(jié)晶區(qū)32以外的構(gòu)成要件附著的方法都可以。例如，可以不使用樣品填充輔助工具54，使用吸液管等向各個(gè)結(jié)晶區(qū)32中填充含蛋白質(zhì)的樣品。另外也可以使用樣品添加用自動(dòng)儀器。
但是，為了迅速而且經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行含蛋白質(zhì)的樣品的填充，優(yōu)選使用上述的樣品填充輔助工具54。
另外，當(dāng)在含蛋白質(zhì)樣品的填充中使用吸液管時(shí)，優(yōu)選不使用使吸引到吸液管并保持的含蛋白質(zhì)的樣品吐出的機(jī)構(gòu)，而是使附著在吸液管的前端的微量液滴接觸結(jié)晶區(qū)32附近。
就像圖1所示那樣，與支持體20上的標(biāo)記28配合設(shè)置襯墊22。然后將蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18按照被收藏在該襯墊22的中空部23那樣設(shè)置在支持體20上。
將在結(jié)晶區(qū)32中填充了含蛋白質(zhì)的樣品的板24反應(yīng)面102朝下保持而且層疊在被支持體20支持的蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的上面。
此時(shí)，使設(shè)置在支持體20上的板定位構(gòu)件44設(shè)置為貫通穿過(guò)板24的板定位孔46。
另外，在該例中，板24反應(yīng)面102朝下層疊在被支持體20支持的蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的上面。但是也可以將在結(jié)晶區(qū)32填充了含蛋白質(zhì)的樣品的板24反應(yīng)面102朝上靜置，使支持了蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的支持體20按照微陣列支持面朝下而層疊在該板24的上面。如果將板24的外側(cè)面104朝上設(shè)置，由于容易進(jìn)行自密封劑注入口48的密封劑的注入、或觀察在結(jié)晶區(qū)32析出的結(jié)晶，因而優(yōu)選。
將板24壓在支持體20上并保持、將螺絲41擰入保持著原來(lái)狀態(tài)的第一螺紋孔40、第二螺紋孔42，將板24和支持在支持體20的蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18進(jìn)行壓接。
然后使用顯微鏡確認(rèn)含蛋白質(zhì)的樣品的填充狀態(tài)。
當(dāng)確認(rèn)含蛋白質(zhì)的樣品被填充到各個(gè)結(jié)晶區(qū)32后，就像圖5、8所示那樣，用吸液管從穿過(guò)板24的密封劑注入口48將密封劑填充到密封部30和凹部34。這樣一來(lái)，漏出到蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18中結(jié)晶劑保持部16以外的位置的含蛋白質(zhì)的樣品可以被密封劑置換。而且可以進(jìn)一步確實(shí)防止由于含蛋白質(zhì)的樣品在鄰接的結(jié)晶區(qū)32之間移動(dòng)引起的污染和條件變化。還可以防止含蛋白質(zhì)的樣品蒸發(fā)。另外，密封劑的注入量?jī)?yōu)選為密封劑遍及密封部30的整個(gè)區(qū)域的凹部34，而且就像圖5、8所示那樣，從一方的密封劑注入口48注入密封劑時(shí)，從另一方不漏出密封劑的最大量。
使用組裝的蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置，進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選，可以獲得目的蛋白質(zhì)中的最適結(jié)晶條件。另外使用析出的結(jié)晶也可以制作適于結(jié)構(gòu)解析的晶體。
在蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置中，使蛋白質(zhì)結(jié)晶劑與含蛋白質(zhì)的樣品反應(yīng)后，將蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置在蛋白質(zhì)析出所需要的充分時(shí)間內(nèi)、某一溫度條件下靜置于密閉狀態(tài)或大氣中。
所謂蛋白質(zhì)析出需要的充分時(shí)間，因特定蛋白質(zhì)、濃度、結(jié)晶條件等不同而不同，約1小時(shí)～10天，在大約經(jīng)過(guò)30天或其以上結(jié)晶沒(méi)有析出的情況，可看作該結(jié)晶條件不合適。另外，由于溫度條件是蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的一個(gè)要因，因此也可以變更溫度條件進(jìn)行結(jié)晶。溫度條件優(yōu)選按照例如4℃、15℃、18℃、22℃等那樣設(shè)定多個(gè)階段。
在蛋白質(zhì)析出經(jīng)過(guò)充分時(shí)間后，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)晶析出狀況進(jìn)行觀察。此時(shí)優(yōu)選從板24的外側(cè)面104，例如通過(guò)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。
經(jīng)這樣操作可以決定對(duì)象蛋白質(zhì)的最適結(jié)晶條件。
以蛋白質(zhì)的結(jié)晶作為目的，將結(jié)晶區(qū)32的容量做成0.5μl或其以上時(shí)，在所有的結(jié)晶區(qū)32的析出了結(jié)晶的結(jié)晶區(qū)32中繼續(xù)使結(jié)晶生長(zhǎng)、或從結(jié)晶區(qū)32回收析出的結(jié)晶用作種晶，通過(guò)眾所周知的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法，在與回收種晶的結(jié)晶區(qū)32同樣的結(jié)晶條件下，可以制作結(jié)構(gòu)解析用的結(jié)晶。作為眾所周知的蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法，可列舉例如懸滴法、坐滴法、透析法、批量法等。
當(dāng)以更迅速篩選蛋白質(zhì)結(jié)晶條件為目的，將結(jié)晶區(qū)32的容量做成不足0.5μl時(shí)，在要求的最適結(jié)晶條件下進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的結(jié)晶化，可以得到結(jié)構(gòu)解析用的結(jié)晶。此時(shí)，作為獲得結(jié)構(gòu)解析用的結(jié)晶的方法，可以使用眾所周知的方法，例如蒸氣擴(kuò)散法、懸滴法等。
通過(guò)對(duì)得到的結(jié)構(gòu)解析用的結(jié)晶進(jìn)行回收，用眾所周知的方法將回收的結(jié)晶進(jìn)行X射線結(jié)構(gòu)解析，可以決定對(duì)象蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。
在該例蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置中，將含蛋白質(zhì)的樣品填充到結(jié)晶區(qū)32中后，通過(guò)將板24和蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18進(jìn)行層疊，結(jié)晶劑保持部16和填充了含蛋白質(zhì)的樣品的結(jié)晶區(qū)32對(duì)應(yīng)重合。這樣一來(lái)，保持在結(jié)晶劑保持部16的結(jié)晶劑向結(jié)晶區(qū)32內(nèi)移動(dòng)，與蛋白質(zhì)反應(yīng)。當(dāng)各個(gè)結(jié)晶劑保持部16被設(shè)定為不同的結(jié)晶條件時(shí)，在為了對(duì)對(duì)象蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶設(shè)定為適當(dāng)結(jié)晶條件的結(jié)晶區(qū)32內(nèi)結(jié)晶析出。
就像以上說(shuō)明的那樣，在該例蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置中，含蛋白質(zhì)的樣品被保持在結(jié)晶區(qū)32內(nèi)，被結(jié)晶劑保持部16密閉。另外各個(gè)結(jié)晶區(qū)32被凹部34隔離。因此，可以防止含蛋白質(zhì)的樣品在結(jié)晶區(qū)32之間的移動(dòng)和/或蛋白質(zhì)結(jié)晶劑在結(jié)晶劑保持部16之間的混合。進(jìn)而，可以防止來(lái)自含蛋白質(zhì)的樣品的溶液的蒸發(fā)，也可以穩(wěn)定保持nl水平的微量的含蛋白質(zhì)的樣品。因此，可以高可靠性地進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)晶。另外可以可靠性更高地判定結(jié)晶條件合適與否。
另外，如果將密封劑填充到凹部34，可以更有效地防止含蛋白質(zhì)樣品之間的混合以及向鄰接的結(jié)晶區(qū)32的侵入。另外也可以防止含蛋白質(zhì)樣品的蒸發(fā)。因此，含蛋白質(zhì)樣品即使微量，也可以很好控制結(jié)晶條件。
另外，如果將支持蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的支持體20和板24進(jìn)行壓接，可以穩(wěn)定并密閉結(jié)晶區(qū)32。因此可以更高可靠性地進(jìn)行結(jié)晶。
通過(guò)適當(dāng)選擇結(jié)晶區(qū)32的容量，可以更迅速而且正確地進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選和制作結(jié)構(gòu)解析用的結(jié)晶。
進(jìn)而，如果再使用樣品填充輔助工具，可以簡(jiǎn)便而且迅速地進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置很適合在例如醫(yī)藥領(lǐng)域等中的研究、開(kāi)發(fā)中的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析用結(jié)晶的制作中使用。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠的特征是，通過(guò)對(duì)含有蛋白質(zhì)結(jié)晶劑、不飽和單體的溶液進(jìn)行凝膠化，使該蛋白質(zhì)結(jié)晶劑被均一分散、溶解在凝膠中。
作為蛋白質(zhì)結(jié)晶劑，只要是使蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)溶解度下降的試劑，就沒(méi)有特別的限定。例如，作為鹽類可列舉硫酸銨、氯化鈉、磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鋰、丙二酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸鎂、硫酸鋰、硝酸鈉、硫酸鎘、硫酸鈉等。作為有機(jī)溶劑可列舉2-甲基-2，4-戊二醇(以下稱為MPD)、乙醇、異丙醇、二烷、甲醇、叔丁醇、正丙醇等。作為水溶性高分子化合物，可列舉聚乙二醇(以下稱為PEG)、聚乙二醇單烷基醚、聚乙烯亞胺等。
這些沉淀劑可以單獨(dú)或組合兩種或其以上使用。其中硫酸銨、氯化鈉、磷酸鉀/鈉、氯化鋰、丙二酸鈉、MPD、PEG特別合適。
作為市售品，可以使用Emerald BioStructures公司生產(chǎn)的「WIZARDII」、Hampton Research公司生產(chǎn)的「Crystal screen」、「Grid Screen」等。沉淀劑使用的濃度，如果是鹽類，優(yōu)選0.1～5.0mol/L、如果是有機(jī)溶劑，優(yōu)選1～80體積％、如果是水溶性高分子化合物，優(yōu)選1～50重量％。
蛋白質(zhì)的結(jié)晶最好是在特定的pH范圍進(jìn)行，為了維持pH可以使用緩沖液。對(duì)使用的緩沖液沒(méi)有特別限定，可列舉例如含有檸檬酸、2-(N-嗎啉代)乙磺酸、N-2-羥乙基哌嗪-N-乙磺酸、三(羥甲基)氨基甲烷、N，N-二(羥乙基)甘氨酸等緩沖液，可將單獨(dú)或兩種或其以上的混合物根據(jù)需要用酸或堿等進(jìn)行中和，調(diào)整到規(guī)定的pH。pH優(yōu)選3.0～10.0的范圍，更優(yōu)選4.0～9.0的范圍。
在本發(fā)明中，作為凝膠化劑可以使用不飽和單體。不飽和單體只要是通過(guò)在水性介質(zhì)中進(jìn)行聚合可形成凝膠的，就沒(méi)有特別的限定，優(yōu)選(甲基)丙烯酰胺系單體、(甲基)丙烯酸系單體。
作為(甲基)丙烯酰胺系單體，適合使用(甲基)丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺等N，N-二烷基氨基(甲基)丙烯酰胺；(甲基)丙烯酰胺甲磺酸、(甲基)丙烯酰胺乙磺酸、2-(甲基)丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸等(甲基)丙烯酰胺烷基磺酸；二甲基氨基丙基(甲基)丙烯酰胺、二乙基氨基丙基(甲基)丙烯酰胺、二甲基氨基乙基(甲基)丙烯酰胺等二烷基氨基烷基(甲基)丙烯酰胺；二甲基氨基丙基(甲基)丙烯酰胺甲基氯化物鹽、二乙基氨基丙基(甲基)丙烯酰氨基甲基乙基氯化物鹽、二甲基氨基乙基(甲基)丙烯酰胺甲基氯化物鹽等二烷基氨基(甲基)丙烯酰胺季銨鹽。
另外，作為(甲基)丙烯酸系單體，適合使用(甲基)丙烯酸2-羥乙基酯、(甲基)丙烯酸4-羥丁基酯、(甲基)丙烯酸4-羥己基酯、二甘醇單(甲基)丙烯酸酯、三甘醇單(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇單(甲基)丙烯酸酯等含有羥基的(甲基)丙烯酸酯；(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙基酯、(甲基)丙烯酸二乙基氨基乙基酯等(甲基)丙烯酸二烷基氨基烷基酯、(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙基酯甲基氯化物鹽、(甲基)丙烯酸二乙基氨基乙基酯的乙基氯化物鹽等(甲基)丙烯酸二烷基氨基烷基酯的季銨鹽。
單體濃度相對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)晶劑溶液100質(zhì)量％，優(yōu)選1～50質(zhì)量％，更優(yōu)選1～10質(zhì)量％。
另外，在本發(fā)明中作為根據(jù)需要使用的可與上述單體共聚合的交聯(lián)性單體，如果是具有2個(gè)官能團(tuán)或其以上的自由基聚合性的單體，就沒(méi)有特別的限定，可列舉例如N，N’-甲叉雙(甲基)丙烯酰胺、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二甘醇二(甲基)丙烯酸酯、三甘醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷環(huán)氧乙烷改性三(甲基)丙烯酸酯等，但是N，N’-甲叉雙(甲基)丙烯酰胺、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯特別合適。交聯(lián)性單體的添加量對(duì)于(A)組或(B)組的單體為0.01～10質(zhì)量份，優(yōu)選為0.1～5質(zhì)量份。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶劑，通過(guò)將特定的沉淀劑與特定的不飽和單體組合，可以得到透明凝膠。如果凝膠透明，觀察生成的蛋白質(zhì)結(jié)晶變得很容易。因此利用光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的自動(dòng)化也變得容易。
作為可得到透明凝膠的不飽和單體與蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的組合，有(1)從丙烯酰胺、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯酰二甲基氨基乙基甲基氯化物鹽中選出來(lái)的至少1種單體與氯化鈉、(2)二甲基丙烯酰胺與MPD、(3)2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸與磷酸Na/K、(4)甲基丙烯酰二甲基氨基乙基甲基氯化物鹽與硫酸銨、(5)丙烯酰胺與丙二酸鈉、(6)聚環(huán)氧乙烷單丙烯酸酯與PEG6k。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶劑使至少含有沉淀劑、緩沖液、不飽和單體構(gòu)成的水溶液熱聚合進(jìn)行制備。或者可以通過(guò)在熱和/或光自由基聚合引發(fā)劑存在下使其聚合、凝膠化，使沉淀劑均一地保持在凝膠中而制備。在自由基聚合引發(fā)劑存在下進(jìn)行聚合是合適的。作為在水溶液中適合使用的自由基聚合引發(fā)劑，可列舉例如叔丁基過(guò)氧化氫、過(guò)氧化氫、過(guò)硫酸銨、過(guò)硫酸鉀等過(guò)氧化物；2，2-偶氮雙(2-脒基丙烷)2鹽酸鹽、2，2-偶氮雙(2-脒基丁烷)2鹽酸鹽、2，2-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]2鹽酸鹽等偶氮系聚合引發(fā)劑。這些自由基聚合引發(fā)劑可以單獨(dú)或作為兩種或其以上的混合物使用。另外也可以使用在上述過(guò)氧化物中組合了三級(jí)胺、亞硫酸鹽、亞鐵鹽等還原劑的氧化還原系聚合引發(fā)劑，進(jìn)而，也可使用將氧化還原系聚合引發(fā)劑和偶氮系聚合引發(fā)劑組合并用的聚合引發(fā)劑。
另外在給出特定波長(zhǎng)的光源下，使用光自由基聚合引發(fā)劑，也可以進(jìn)行聚合。此時(shí)，只要是所使用的光自由基聚合引發(fā)劑通過(guò)特定波長(zhǎng)范圍的光照射進(jìn)行分解，產(chǎn)生自由基的引發(fā)劑，就沒(méi)有特別的限定。作為適合利用的引發(fā)劑，可列舉例如?；⒀趸铩⒈脚家?、苯偶姻烷基醚、苯偶酰、二苯甲酮、蒽醌等通常光聚合中使用的引發(fā)劑，其它如2，2’-偶氮雙(2-甲基丙脒)鹽酸鹽、4，4’-偶氮雙(氰基吉草酸)鈉鹽、2，2-偶氮雙[2-甲基-N-(2-羥乙基)丙酰胺]等偶氮系聚合引發(fā)劑?？梢愿鶕?jù)利用的波長(zhǎng)從這些引發(fā)劑中選擇一種或其以上任意的引發(fā)劑使用。另外，上述的所謂特定波長(zhǎng)，如果考慮反應(yīng)液中含有的單體本身引起的光吸收、自由基生成中利用的光量子能量這兩點(diǎn)，希望使用波長(zhǎng)200～650nm區(qū)域的光。作為可用于波長(zhǎng)200～650nm區(qū)域的光照射的光源的代表例，可列舉高壓水銀燈、低壓水銀燈、金屬鹵化物燈、熒光化學(xué)燈、熒光藍(lán)色燈等。
實(shí)施例(中空纖維排列體的制作)作為支持結(jié)晶劑保持部的構(gòu)成要件，制作中空纖維排列體。
將2塊多孔板重疊，所述多孔板排列了具有直徑為0.32mm的孔，孔的中心距離為0.42mm，縱橫各10列合計(jì)100個(gè)孔，厚度為0.1mm。將聚乙烯制中空纖維(三菱麗陽(yáng)公司生產(chǎn)的、外徑約500μm，內(nèi)徑約300μm，長(zhǎng)約100μm)100根通過(guò)這些多孔板的各個(gè)孔。然后在使中空纖維在拉緊的狀態(tài)在從中空纖維一方的端部開(kāi)始的10cm的位置和40cm的位置兩個(gè)地方進(jìn)行固定，將2塊多孔板的間隔做成30mm。
然后，將2塊多孔板間的空間的3方向用硅制的板狀物圍起來(lái)。從開(kāi)放的一方，作為樹(shù)脂原料，將由聚氨酯樹(shù)脂粘合劑構(gòu)成的樹(shù)脂和相對(duì)于樹(shù)脂原料的總質(zhì)量為2.5質(zhì)量％的炭黑的混合物流入到2塊多孔板之間。接下來(lái)于室溫下靜置1周，使樹(shù)脂硬化。然后除去設(shè)置在多孔板和多孔板之間的板狀物，得到中空纖維排列體。
(高分子凝膠向中空纖維排列體的導(dǎo)入固定化)制備由以下組成構(gòu)成的混合溶液。
丙烯酰胺3.7質(zhì)量份甲叉雙丙烯酰胺0.3質(zhì)量份2，2’-偶氮雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽0.1質(zhì)量份將上述混合溶液和上述得到的中空纖維排列體放入干燥器中，在將各個(gè)中空纖維的自由端部中長(zhǎng)的一方的端部浸漬到該混合液中的狀態(tài)下，通過(guò)將干燥器做成減壓狀態(tài)，向中空纖維的中空部中導(dǎo)入上述混合液。然后將該中空纖維排列體移到內(nèi)部被水蒸氣飽和的密閉玻璃容器中，于80℃下進(jìn)行4小時(shí)聚合反應(yīng)。由此得到丙烯酰胺凝膠被固定在中空纖維的中空部的中空纖維排列體。
(填充凝膠中空纖維排列體薄片的制作)將上述得到的含有丙烯酰胺凝膠的中空纖維排列體在與中空纖維縱向垂直的方向用薄片切片機(jī)切成約2mm的厚度，得到中空纖維的中空部填充有凝膠的縱橫各10個(gè)、共計(jì)100個(gè)的中空纖維有規(guī)則排列為正方的排列體薄片。圖2表示通過(guò)上述工序得到的含凝膠的中空纖維排列體薄片。就像圖2所示那樣，在中空纖維12的中空部14中填充有上述制作的丙烯酰胺凝膠。
(蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列的制作)在上述制作的含凝膠的中空纖維排列體薄片中，在填充到中空纖維12的中空部14的丙烯酰胺凝膠中，通過(guò)將由下述的A、B、C、D、E、F、G、H、I、J的水溶液構(gòu)成的蛋白質(zhì)結(jié)晶劑1μl分別添加到保持在中空部的凝膠中，使蛋白質(zhì)結(jié)晶劑保持在丙烯酰胺凝膠中，制作蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18。
A2.0mol/L氯化鈉水溶液B0.5mol/L氯化鈉水溶液C10體積％聚乙二醇(分子量400)水溶液D20體積％聚乙二醇(分子量400)水溶液E10體積％聚乙二醇(分子量6000)水溶液F20體積％聚乙二醇(分子量6000)水溶液G20體積％2-甲基-2，4-戊二醇水溶液H20％2-甲基-2，4-戊二醇水溶液I0.5mol/L硫酸銨水溶液J1.5mol/L硫酸銨水溶液以下，將保持了上述A～J的蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的結(jié)晶劑保持部16分別稱之為點(diǎn)A～J。
蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選使用圖1所示的蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置，進(jìn)行溶菌酶(Sigma Aldrich公司生產(chǎn))的結(jié)晶條件的篩選。作為蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列使用上述制作的蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18，作為支持體20、板24的材料使用丙烯酸樹(shù)脂。
(含蛋白質(zhì)的樣品的添加)使用圖6所示的樣品填充輔助工具54，向結(jié)晶區(qū)32填充含蛋白質(zhì)的樣品。樣品填充輔助工具54使用具有對(duì)應(yīng)于上述得到的蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的結(jié)晶劑保持部16排列的穿孔56的輔助工具。
結(jié)晶區(qū)32是直徑0.7mm、高0.15mm的一端閉合的圓筒狀，結(jié)晶區(qū)32的容量為105nl。
作為含蛋白質(zhì)的樣品，使用含溶菌酶的水溶液(80mg/ml)。
首先將樣品填充輔助工具54按照?qǐng)D6所那樣設(shè)置在板24上，在它的上面用20μl自動(dòng)吸液管將含蛋白質(zhì)的樣品1.5～2μl按照樣品遍及穿孔56的整個(gè)上面那樣添加。然后由樣品填充輔助工具54的上面用刮板通過(guò)將含蛋白質(zhì)的樣品按在板24上，將含蛋白質(zhì)的樣品填充到板24上所有的結(jié)晶區(qū)32中。
(蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置的組裝、蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選)然后將結(jié)晶區(qū)32填充了含蛋白質(zhì)的樣品的板24反應(yīng)面102朝下保持，層疊在被支持體20支持的蛋白質(zhì)結(jié)晶用微陣列18的上面。確認(rèn)在結(jié)晶區(qū)32中填充了含蛋白質(zhì)的樣品后，向穿過(guò)板24的一方的密封劑注入口48中從板24的外側(cè)面104，用吸液管注入作為密封劑的石蠟油(以下稱為油)。油的注入量使用油遍及密封部30的整個(gè)區(qū)域，而從另一方的密封劑注入口48油剛好要溢出的量。
然后，將蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置于20℃下靜置3小時(shí)。接下來(lái)通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)晶區(qū)32內(nèi)，結(jié)果在使作為蛋白質(zhì)結(jié)晶劑保持了聚乙二醇水溶液的點(diǎn)B沒(méi)有看到溶菌酶的結(jié)晶，而在保持了2.0mol/L氯化鈉水溶液的點(diǎn)A看到最適于X射線結(jié)構(gòu)解析的柱狀結(jié)晶。
(結(jié)構(gòu)解析用結(jié)晶的制作)進(jìn)而，根據(jù)上述的結(jié)果，使用2.0mol/L氯化鈉水溶液作為蛋白質(zhì)結(jié)晶劑，從含溶菌酶的樣品溶液通過(guò)懸滴法制作溶菌酶結(jié)晶。此時(shí)，得到的溶菌酶結(jié)晶的大小為0.3×0.3×0.5mm。
由以上結(jié)果對(duì)溶菌酶結(jié)晶條件中蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的種類和濃度進(jìn)行研究，結(jié)果表明2.0mol/L氯化鈉水溶液是最適的結(jié)晶條件，而且使用篩選出的最適結(jié)晶條件可以得到適于X射線結(jié)構(gòu)解析的結(jié)晶。
即，可以通過(guò)微量的含蛋白質(zhì)的樣品迅速而且經(jīng)濟(jì)、高可靠性地實(shí)施蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠中的緩沖液使用以下的緩沖液，通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。
0.1M-檸檬酸緩沖液(pH4.0)、0.1M-檸檬酸緩沖液(pH5.0)、0.1M-MES(pH6.0)、0.1M-HEPES(pH7.0)、0.1M-Tris(pH8.0)、0.1M-Bicine(pH9.0)。
<實(shí)施例1>秤量作為沉淀劑的氯化鈉0.48g放到10ml容量瓶中，用0.1M-檸檬酸緩沖液(pH4.0)定容，制備1.2M-NaCl水溶液(將該溶液定為a液)。另外，向50％丙烯酰胺水溶液(三菱麗陽(yáng)公司生產(chǎn))90g中加N，N’-甲叉雙丙烯酰胺(以下縮寫為MBAAm)5g，去離子水5g，進(jìn)行溶解，制備50％單體溶液(將該溶液定為b液)。進(jìn)而，制備作為水溶性聚合引發(fā)劑的2，2’-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(和光純藥工業(yè)制造、VA-044)的10％水溶液(將該溶液定為c液)。向2ml的樣品管中注入a液840μl、b液160μl后進(jìn)行混合，制備蛋白質(zhì)結(jié)晶劑水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、單體濃度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃溫浴下進(jìn)行3小時(shí)聚合，得到透明的水凝膠。
向按照上述步驟形成的水凝膠的樣品管中加40mg/ml的溶菌酶水溶液1ml，于20℃下溫育24小時(shí)，在溶菌酶水溶液中析出溶菌酶結(jié)晶。而且結(jié)晶生成通過(guò)肉眼和實(shí)體顯微鏡都可確認(rèn)。
<實(shí)施例2>除了將實(shí)施例1中a液的濃度變更為2.4M以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液(2.0M-NaCl、pH4.0、單體濃度8％)，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例3>除了將實(shí)施例1中a液的濃度變更為3.6M以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液(3.0M-NaCl、pH4.0、單體濃度8％)，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例4>除了將實(shí)施例1中a液的濃度變更為4.8M以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液(4.0M-NaCl、pH4.0、單體濃度8％)，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例5～8>除了將實(shí)施例1～4中緩沖液變更為0.1M-檸檬酸緩沖液(pH5.0)以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例9～12>除了將實(shí)施例1～4中緩沖液變更為0.1M-MES緩沖液(pH6.0)以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例13～16>除了將實(shí)施例1～4中緩沖液變更為0.1M-HEPES緩沖液(pH7.0)以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例17～20>除了將實(shí)施例1～4中緩沖液變更為0.1M-Tris緩沖液(pH8.0)以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例21～24>除了將實(shí)施例1～4中緩沖液變更為0.1M-Bicine緩沖液(pH9.0)以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例25>秤量作為沉淀劑的聚乙二醇(和光純藥工業(yè)制造、PEG6000、重均分子量6000)0.55g放到10ml容量瓶中，用0.1M-檸檬酸緩沖液(pH4.0)定容，制備5.5％-PEG水溶液(將該溶液定為d液)。另外，制備在聚乙二醇單丙烯酸酯(日本油脂制ブレンマ一AE90)95g中溶解了聚乙二醇二丙烯酸酯(新中村化學(xué)制NKESTERA-200)的單體溶液(將該溶液定為e液)。進(jìn)而，制備作為水溶性聚合引發(fā)劑的2，2’-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(和光純藥工業(yè)制造、VA-044)的10％水溶液(將該溶液定為c液)。向2ml的樣品管中注入a液920μl、b液80μl后進(jìn)行混合，制備蛋白質(zhì)結(jié)晶劑水溶液(5％-PEG、pH4.0、單體濃度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃溫浴下進(jìn)行3小時(shí)聚合，得到透明的水凝膠。以下用與實(shí)施例1同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例26>除了將實(shí)施例25中d液的濃度變更為11％以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液(10％-PEG、pH4.0、單體濃度8％)，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例27>除了將在實(shí)施例25中d液的濃度變更為22％以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液(20％-PEG、pH4.0、單體濃度8％)，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例28>除了將實(shí)施例25中d液的濃度變更為33％以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液(30％-PEG、pH4.0、單體濃度8％)，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例29～32>除了將實(shí)施例25～28中緩沖液變更為0.1M-檸檬酸緩沖液(pH5.0)以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例33～36>除了將實(shí)施例25～28中緩沖液變更為0.1M-MES緩沖液(pH6.0)以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例37～40>除了將實(shí)施例25～28中緩沖液變更為0.1M-HEPES緩沖液(pH7.0)以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例41～44>除了將實(shí)施例25～28中緩沖液變更為0.1M-Tris緩沖液(pH8.0)以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
<實(shí)施例45～48>除了將實(shí)施例25～28中緩沖液變更為0.1M-Bicine緩沖液(pH9.0)以外，其它都按照同樣步驟制備結(jié)晶劑水溶液，再按照同樣步驟獲得透明的水凝膠。另外用同樣的方法確認(rèn)溶菌酶結(jié)晶的生成。結(jié)果如表-1所示。
表-1

<實(shí)施例49>秤量作為沉淀劑的氯化鈉0.48g放到10ml容量瓶中，用0.1M-檸檬酸緩沖液(pH4.0)定容，制備1.2M-NaCl水溶液(將該溶液定為a液)。
另外，向2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸47.5g中加N，N’-甲叉雙丙烯酰胺(以下縮寫為MBAAm)2.5g，去離子水50g，進(jìn)行溶解，制備50％單體溶液(將該溶液定為b液)。進(jìn)而，制備作為水溶性聚合引發(fā)劑的2，2’-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(和光純藥工業(yè)制造、VA-044)的10％水溶液(將該溶液定為c液)。向2ml的樣品管中注入a液840μl、b液160μl后進(jìn)行混合，制備蛋白質(zhì)結(jié)晶劑水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、單體濃度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃溫浴下進(jìn)行3小時(shí)聚合，得到透明的水凝膠。
<實(shí)施例50>秤量作為沉淀劑的氯化鈉0.48g放到10ml容量瓶中，用0.1M-檸檬酸緩沖液(pH4.0)定容，制備1.2M-NaCl水溶液(將該溶液定為a液)。
另外，向80％甲基丙烯酰二甲基氨基乙基甲基氯化物鹽水溶液62.5g中加N，N’-甲叉雙丙烯酰胺(以下縮寫為MBAAm)2.5g，去離子水35g，進(jìn)行溶解，制備50％單體溶液(將該溶液定為b液)。另外，制備作為水溶性聚合引發(fā)劑的2，2’-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(和光純藥工業(yè)制造、VA-044)的10％水溶液(將該溶液定為c液)。向2ml的樣品管中注入a液840μl、b液160μl后進(jìn)行混合，制備蛋白質(zhì)結(jié)晶劑水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、單體濃度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃溫浴下進(jìn)行3小時(shí)聚合，得到透明的水凝膠。
<實(shí)施例51>秤量作為沉淀劑的2-甲基-2，4-戊二醇2g放到10ml容量瓶中，用0.1M-檸檬酸緩沖液(pH4.0)定容，制備20％2-甲基-2，4-戊二醇水溶液(將該溶液定為a液)。
另外，向二甲基丙烯酰胺47.5g中加N，N’-甲叉雙丙烯酰胺(以下縮寫為MBAAm)2.5g，去離子水50g，進(jìn)行溶解，制備50％單體溶液(將該溶液定為b液)。另外，制備作為水溶性聚合引發(fā)劑的2，2’-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(和光純藥工業(yè)制造、VA-044)的10％水溶液(將該溶液定為c液)。向2ml的樣品管中注入a液840μl、b液160μl后進(jìn)行混合，制備蛋白質(zhì)結(jié)晶劑水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、單體濃度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃溫浴下進(jìn)行3小時(shí)聚合，得到透明的水凝膠。
<實(shí)施例52>秤量作為沉淀劑的磷酸鈉鹽1.176g、磷酸鉀鹽0.035g放到10ml容量瓶中，用0.1M-檸檬酸緩沖液(pH4.0)定容，制備1.0M-磷酸鈉/鉀水溶液(將該溶液定為a液)。
另外，向2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸47.5g中加N，N’-甲叉雙丙烯酰胺(以下縮寫為MBAAm)2.5g，去離子水50g，進(jìn)行溶解，制備50％單體溶液(將該溶液定為b液)。再制備作為水溶性聚合引發(fā)劑的2，2’-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(和光純藥工業(yè)制造、VA-044)的10％水溶液(將該溶液定為c液)。向2ml的樣品管中注入a液840μl、b液160μl后進(jìn)行混合，制備蛋白質(zhì)結(jié)晶劑水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、單體濃度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃溫浴下進(jìn)行3小時(shí)聚合，得到透明的水凝膠。
<實(shí)施例53>秤量作為沉淀劑的硫酸銨3.17g放到10ml容量瓶中，用0.1M-檸檬酸緩沖液(pH4.0)定容，制備2.4M-硫酸銨水溶液(將該溶液定為a液)。
另外，向80％甲基丙烯酰二甲基氨基乙基甲基氯化物鹽水溶液62.5g中加N，N’-甲叉雙丙烯酰胺(以下縮寫為MBAAm)2.5g，去離子水35g，進(jìn)行溶解，制備50％單體溶液(將該溶液定為b液)。另外，制備作為水溶性聚合引發(fā)劑的2，2’-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(和光純藥工業(yè)制造、VA-044)的10％水溶液(將該溶液定為c液)。向2ml的樣品管中注入a液840μl、b液160μl后進(jìn)行混合，制備蛋白質(zhì)結(jié)晶劑水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、單體濃度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃溫浴下進(jìn)行3小時(shí)聚合，得到透明的水凝膠。
<實(shí)施例54>秤量作為沉淀劑的丙二酸1.04g放到10ml容量瓶中，加20％-氫氧化鈉水溶液4g進(jìn)行中和后，用0.1M-檸檬酸緩沖液(pH4.0)定容，制備1.0M-丙二酸鈉水溶液(將該溶液定為a液)。
另外，向50％丙烯酰胺水溶液(三菱麗陽(yáng)公司制)90g中加N，N’-甲叉雙丙烯酰胺(以下縮寫為MBAAm)5g，去離子水5g，進(jìn)行溶解，制備50％單體溶液(將該溶液定為b液)。另外，制備作為水溶性聚合引發(fā)劑的2，2’-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(和光純藥工業(yè)制造、VA-044)的10％水溶液(將該溶液定為c液)。向2ml的樣品管中注入a液840μl、b液160μl后進(jìn)行混合，制備蛋白質(zhì)結(jié)晶劑水溶液(1.0M-NaCl、pH4.0、單體濃度8％)，再添加c液10μl后充分混合，然后于55℃溫浴下進(jìn)行3小時(shí)聚合，得到透明的水凝膠。
產(chǎn)業(yè)上的利用性通過(guò)本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶裝置，可以迅速而且經(jīng)濟(jì)、高可靠性地實(shí)施蛋白質(zhì)的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)或結(jié)晶條件的篩選。另外通過(guò)本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠在蛋白質(zhì)結(jié)晶中可以完成凝膠反應(yīng)、以及形成不產(chǎn)生白濁的凝膠狀物，可以提供保持了蛋白質(zhì)結(jié)晶劑的透明的凝膠狀物。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠，在含有選自丙烯酰胺、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯酰二甲基氨基乙基甲基氯化物鹽中的至少一種單體的凝膠狀物中保持有氯化鈉。
2.一種蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠，在含有二甲基丙烯酰胺的凝膠狀物中保持有2-甲基-2，4-戊二醇。
3.一種蛋白質(zhì)結(jié)晶劑，在含有2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸的凝膠狀物中保持有磷酸鈉/鉀鹽。
4.一種蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠，在含有甲基丙烯酰二甲基氨基乙基甲基氯化物鹽的凝膠狀物中保持有硫酸銨。
5.一種蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠，在含有丙烯酰胺的凝膠狀物中保持有丙二酸鈉。
6.一種蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠，在含有聚氧乙烯單丙烯酸酯的凝膠狀物中保持有聚乙二醇6000。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)結(jié)晶用凝膠，其在含有選自丙烯酰胺、2－丙烯酰胺－2－甲基丙磺酸、甲基丙烯酰二甲基氨基乙基甲基氯化物鹽中的至少一種單體的凝膠狀物中保持有氯化鈉。
文檔編號(hào)C30B29/58GK101029078SQ20071009229
公開(kāi)日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2004年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月11日
發(fā)明者田中熏, 渡邊信久, 竹內(nèi)浩史, 井關(guān)隆幸, 澀谷望, 西島千晴 申請(qǐng)人:三菱麗陽(yáng)株式會(huì)社