專利名稱：：經(jīng)疏水性改性的蛋白組合物及方法
背景技術(shù)：
：眾所周知，某些蛋白在連接于其他部分上時，或通過形成其中蛋白有機會聯(lián)合發(fā)揮作用的多聚復(fù)合物，或通過蛋白之物理-化學(xué)性質(zhì)如蛋白的吸收、生物分布和半衰期的其他變化，可具有更高的生物活性。因此，目前生物技術(shù)研究中的一個主要領(lǐng)域涉及研制改性蛋白之物理-化學(xué)性質(zhì)的方法，以使它們可以更小的量、更少的副作用、新的途徑以及更低的成本進行給藥。例如，任何單個蛋白的結(jié)合親和性(如配體對其關(guān)連受體的親和性)有可能較低。但是，細胞正常表達成百上千的具體表面受體的復(fù)制體，而且許多受體-配體相互作用同時發(fā)生。當(dāng)許多表面分子參與結(jié)合時，總的有效親和性高于單獨分子之結(jié)合親和性的總和。相反地，如果從細胞表面上除去配體蛋白并通過重組DNA技術(shù)純制或分離以用于例如治療中，它們僅作為單體發(fā)生作用，失去了與許多其他緊密締合在細胞表面上的相同蛋白的復(fù)制體協(xié)同作用的優(yōu)勢。如此分離后，蛋白對其受體的低親和性對其作為治療劑的有效性而言就有可能變成一個嚴重的缺陷，阻斷了具體的結(jié)合通路，這是因為它必須與高親和力的細胞-細胞相互作用進行競爭。有效的治療有可能需要恒定的給藥和／或高劑量。但是，如果能夠發(fā)現(xiàn)形成分離蛋白的多聚體形式的方法，此等缺陷就有可能避免。類似地，改性生物活性蛋白的其他物理-化學(xué)性質(zhì)也是有用的，以便例如誘導(dǎo)蛋白與膜締合，由此使其局限在給藥部位處，并增強其與具體目標(biāo)結(jié)合或不然就相互作用的能力。此等改變也可影響蛋白的藥物分布。已研制出幾種產(chǎn)生偶聯(lián)蛋白的方法。許多這些方法不是高度特異性的，也就是說，它們不針對偶聯(lián)至蛋白上的任何具體位點。其結(jié)果是，常規(guī)的偶聯(lián)劑可攻擊功能位點或者立體阻斷活性位點，使偶聯(lián)蛋白失活。另外，偶聯(lián)產(chǎn)物被定向，使得活性位點不能協(xié)同作用，由此使產(chǎn)物比單體蛋白單獨的效力還要低。作為發(fā)現(xiàn)蛋白改性的新方法的其他動機，帶有N-端胱氨酸殘基的蛋白對氧化或其他化學(xué)改性敏感，有可能損壞活性或半衰期。另外，蛋白純制中常用的某些緩沖液含有可改性N-端胱氨酸的成分或雜質(zhì)。即使避免這些緩沖液時，N-端胱氨酸也會隨時間發(fā)生變化，這有可能是因為儲存容器或者空氣中的化學(xué)物質(zhì)。其后果是，制劑緩沖液必須包含保護劑，如二硫蘇糖醇，以防止胱氨酸改性和／或氧化。但是，保護劑其本身也具有顯著的生物活性，而且它們因此有可能使實驗復(fù)雜化，并對制劑的治療應(yīng)用產(chǎn)生負面影響。因此，本領(lǐng)域中仍需要研制更有效地得到衍生化產(chǎn)物或其多聚體形式的方法，以改變蛋白的性質(zhì)，影響其穩(wěn)定性、效力、藥代動力學(xué)、以及藥物動力學(xué)。發(fā)明簡述在本發(fā)明的一個方面中，我們已解決了方便地制造生物活性蛋白的改性形式的方法。本發(fā)明的方法可用于衍生蛋白的多聚體形式和／或可用于改變它們的物理-化學(xué)性質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)，改性蛋白(例如在已有的氨基酸上添加或懸掛疏水性基團或者用疏水性基團取代氨基酸)以在蛋白上引入疏水性基團可增加蛋白的生物活性和／或其穩(wěn)定性。例如，N-端胱氨酸可用作連接疏水性基團(如脂質(zhì))的方便“目標(biāo)”，并由此改性生物活性蛋白?；蛘撸稍谏锘钚缘鞍椎腃-端殘基上連接疏水性基團，例如hedgehog蛋白，以改性蛋白的活性。也可在內(nèi)部氨基酸殘基上懸掛疏水性基團，以增強蛋白的活性，但條件是所述改性不影響蛋白的活性，例如蛋白結(jié)合受體或共同受體的能力，或者不影響蛋白的立體結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的是，疏水性基團懸掛在當(dāng)?shù)鞍诪樘烊恍问綍r處于蛋白表面上的內(nèi)部氨基酸殘基上。本發(fā)明的疏水性改性對于產(chǎn)生與未經(jīng)改性的形式相比具有變化的物理-化學(xué)性質(zhì)的蛋白提供了一個通用的方法。本發(fā)明起源于以下發(fā)現(xiàn)我們在昆蟲和哺乳動物細胞中表達了全長的Sonichedgehog蛋白，除在其C-端具有膽固醇外，該蛋白的成熟形式(在成熟序列中的殘基1-174)也在其N-端衍生被脂肪酸衍生化。明顯的是，該形式的hedgehog與可溶性的、未經(jīng)改性的hedgehog相比，在體外實驗中的效力增加30倍。因此，本發(fā)明的一個方面是分離蛋白，其包括N-端氨基酸和C-端氨基酸，其中該蛋白選自于以下組中帶有N-端胱氨酸而且該胱氨酸上懸掛有至少一個疏水性基團的蛋白；帶有N-端氨基酸的蛋白，該氨基酸不是懸掛有疏水性基團的胱氨酸；以及疏水性基團取代N-端氨基酸的蛋白。疏水性基團可以是疏水性肽或脂質(zhì)或者任何疏水性的其他化學(xué)基團。可在其N-端氨基酸處改性蛋白，而且N-端氨基酸優(yōu)選是胱氨酸或其官能衍生物。蛋白可在其C-端氨基酸處或者在N-端氨基酸和C-端氨基酸兩處、或者在N-端和C-端氨基酸之內(nèi)(即在它們中間)的至少一個氨基酸處、或者上述變化的組合處進行蛋白的改性。蛋白可以是細胞外信號蛋白，而且在優(yōu)選實施方案中，蛋白是由脊椎動物、更優(yōu)選由人得到的hedgehog蛋白，包括Sonic、Indian和Deserthedgehog。另一個實施方案是A-Cys-[Sp]-B-X形式的分離蛋白，其中A是疏水性基團，Cys是胱氨酸或其官能等價物，[Sp]是任選的間隔肽序列，B是包括多個氨基酸、包括至少一個任選的間隔肽序列的蛋白；以及X是連接在蛋白上的任選的其他疏水性基團。分離蛋白可以是細胞外信號蛋白，優(yōu)選是hedgehog蛋白。該蛋白可至少在一個其他氨基酸處用至少一個疏水性基團進行改性。在另一個實施方案中，蛋白與小泡相接觸，該小泡選自于細胞膜、微團和脂質(zhì)體。本發(fā)明的另一個方面是具有C-端氨基酸和N-端硫脯氨酸基團的分離蛋白，該硫脯氨酸基團是通過醛與蛋白的N-端胱氨酸的反應(yīng)而形成的。本發(fā)明的再一個方面是具有C-端氨基酸和N-端酰胺基團的分離蛋白，該酰胺基團是通過脂肪酸硫酯與蛋白的N-端胱氨酸的反應(yīng)而形成的。本發(fā)明的又一個方面是具有C-端氨基酸和N-端馬來酰亞胺基團的分離蛋白，該N-端馬來酰亞胺基團是通過馬來酰亞胺基團與蛋白的N-端胱氨酸的反應(yīng)而形成的。本發(fā)明的再一個方面是具有C-端氨基酸和N-端乙酰胺基團的分離蛋白。本發(fā)明的又一個方面是具有C-端氨基酸和N-端硫代嗎啉基團的分離蛋白。在這些實施方案中，蛋白的C-端氨基酸可用疏水性基團進行改性。分離蛋白可以是細胞外信號蛋白，最優(yōu)選是hedgehog蛋白。本發(fā)明的方法包括產(chǎn)生多價蛋白復(fù)合物的方法，其包括以下步驟在小泡存在下使疏水性基團連接在蛋白的N-端胱氨酸上、或者N-端胱氨酸的官能等價物上。該連接步驟可包括連接脂質(zhì)部分，該脂質(zhì)選自于具有2-24個碳原子的飽和及不飽和脂肪酸。蛋白可以是細胞外信號蛋白，優(yōu)選是選自于Sonic、Indian和Deserthedgehog中的hedgehog蛋白。本發(fā)明的另一個方法是改性蛋白的物理-化學(xué)性質(zhì)的方法，其包括以下步驟在蛋白的N-端胱氨酸或N-端胱氨酸的官能等價物上引入至少一個疏水性基團。疏水性基團可以是脂質(zhì)部分，其選自于具有2-24個碳原子的飽和及不飽和脂肪酸。其也可以是疏水性蛋白。使用該方法改性的蛋白可以是細胞外信號蛋白，優(yōu)選是選自于Sonic、Indian和Deserthedgehog中的hedgehog蛋白。由這些方法制得的蛋白復(fù)合物也包括在本發(fā)明中。除hedgehog外的其他細胞外信號蛋白包括凝溶膠蛋白、干擾素、白介素、腫瘤壞死因子、單細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、紅細胞生成素、血小板衍生的生長因子、生長激素和胰島素。另一個方法是改性具有N-端胱氨酸的蛋白(如細胞外信號蛋白)的方法。該方法包括使N-端胱氨酸與脂肪酸硫酯反應(yīng)以形成酰胺，其中此等改性可增強蛋白的生物活性。再一個方法是改性具有N-端胱氨酸的蛋白(如細胞外信號蛋白)的方法，其包括使N-端胱氨酸與馬來酰亞胺基團反應(yīng)，其中此等改性可增強蛋白的生物活性。該方法的其他實施方案涉及使N-端胱氨酸與醛、乙酰胺或硫代嗎啉基團反應(yīng)。又一個方法是改性蛋白(如細胞外信號蛋白)的方法，其包括在蛋白上懸掛疏水性肽。疏水性基團可懸掛在蛋白的氨基酸上，該氨基酸選自于以下組中N-端氨基酸、C-端氨基酸、在N-端氨基酸和C-端氨基酸之間的中間氨基酸、以及上述氨基酸的組合。在一個實施方案中，本發(fā)明提供用親脂性基團改性的hedgehog多肽。在某些實施方案中，本發(fā)明的hedgehog蛋白可用親脂性基團在成熟的經(jīng)處理的細胞外區(qū)域的一個或多個內(nèi)部位點處進行改性，而且也可以或者不可以在成熟多肽的N或C-端殘基處用親脂性基團進行衍生化。在其他實施方案中，在C-端殘基處用除膽固醇以外的疏水性基團改性多肽。在另一個實施方案中，在N-端殘基處用環(huán)(優(yōu)選多環(huán))狀親脂性基團改性多肽。也可進行上述實施方案的各種組合。本發(fā)明的治療方法是治療患者的神經(jīng)疾病的方法，其包括向患者給藥本發(fā)明之經(jīng)疏水性改性的蛋白。附圖簡述圖1是表征棕櫚酰化形式的Shh。人Shh的結(jié)合形式是由HighFiveTM昆蟲細胞經(jīng)免疫親和純制的，并用SDS-PAGE分析。蛋白用考馬斯藍(泳道a，LifeTechno1ogies，Inc預(yù)染色的高分子量標(biāo)記物；泳道b，可溶的Shh(0．6μg)；泳道c，結(jié)合的Shh(0．6μg)；泳道d，可溶的以及結(jié)合的Shh(0．6μg)的混合物)。Shh和Ihh(見泳道h)用棕櫚酸改性的能力是用實施例2中所述的無細胞系統(tǒng)來分析的?？扇苄问降膆edgehog蛋白(3μg／樣品)與鼠肝微粒體、ATP、輔酶A、和3H-棕櫚酸一起溫育1小時，然后用SDS-PAGE分析棕櫚?；饔?。泳道e-i中所示的樣品用熒光顯影進行肉眼觀察(泳道e，Shh；泳道f，des1-10Shh；泳道g，Cys-1至SerShh；泳道h，Ihh；泳道i，His標(biāo)記的Shh)，而泳道j-k中的樣品用考馬斯染色觀察(泳道j，Shh；泳道kdes1-10Shh)。圖2是用ESI-MS分析經(jīng)純制的Shh。在MicromassQuattroⅡ三聯(lián)四極質(zhì)譜儀上通過ESI-MS分析可溶的人Shh(A)和結(jié)合的人Shh(B)，該質(zhì)譜儀上裝有電子噴射離子源。獲得所有的電子噴射質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并以文件模式儲存，然后用MicromassMassLynx數(shù)據(jù)系統(tǒng)進行處理。見分子質(zhì)譜(由數(shù)據(jù)系統(tǒng)產(chǎn)生質(zhì)量分布)。圖3是用反相HPLC分析結(jié)合的Shh。可溶的人Shh(A)、由HighFiveTM昆蟲細胞得到的結(jié)合的人Shh(B)、由EBNA-293細胞得到的結(jié)合的人Shh(C)、和細胞伴隨的鼠Shh(D)在窄孔VydacC4柱(2．1mm內(nèi)徑×250mm)上進行反相HPLC分析。該柱在30分鐘的時間內(nèi)用在0．1％三氟乙酸中的0-80％乙腈進行梯度洗脫，流速為0．25ml／min，并使用發(fā)光二極管陣列檢測器在200-300nm(數(shù)據(jù)為214nm處)處監(jiān)測洗脫液。收集峰值流份，然后進一步用SDS-PAGE和MS表征(數(shù)據(jù)總結(jié)于表3、4和5中)。圖4是用LC-MS表征Shh。如(27)所述用4-乙烯基吡啶(1μl／100μl樣品，在6M鹽酸胍、1mMEDTA、100mMTrisHClpH8．0中)使結(jié)合的人Shh(A)和可溶的人Shh(B)烷基化，乙醇沉淀，然后用內(nèi)切蛋白酶Lys-C在50mMTrisHClpH7．2、2M脲中以1∶5的酶∶蛋白比進行消化。消化物在線用電子噴射MicromassQuattroⅡ三聯(lián)四極質(zhì)譜儀進行分析。在整個范圍內(nèi)進行掃描，然后用MicromassMassLynx數(shù)據(jù)系統(tǒng)處理(示出了整個范圍的總離子層析譜)。星號表示用MALDIPSD或N-端Edman測序證實的N-端肽的位置。圖5是用MALDIPSD測量對N-端Shh肽測序。結(jié)合的人Shh中的N-端內(nèi)切蛋白酶Lys-C肽在飛行質(zhì)譜儀的Voyager-DETMSTR時間上進行MALDIPSD測量。在圖的上端示出了檢測片段離子的預(yù)測斷裂模式和命名(PA，棕櫚酸；4vp，4-吡啶基乙基)。圖的其余部分顯示了由該實驗產(chǎn)生的分子質(zhì)譜。用示意性的命名表示相關(guān)的離子。b1-b8的計算質(zhì)量(Da)分別是447．3、504．3、601．4、658．4、814．5、871．5、1018．6和1075．6。對于y1-y8，質(zhì)量(Da)分別是147．1、204．1、351．2、408．2、564．3、621．3、718．4、和775．4。z8的計算質(zhì)量是758．4Da。b8的觀察質(zhì)量由于所添加的水包含另外18Da。圖6是在C3H10T1／2實驗中結(jié)合的Shh的活性增加。在C3H10T1／2細胞上通過測量堿性磷酸酯酶誘導(dǎo)作用來評估可溶的和結(jié)合的人Shh單獨(A)或者在有抗hedgehog中和Mab5E1存在時(B)的相對效力。所示數(shù)字反映兩個重復(fù)測量的平均值。可溶的(6)和結(jié)合的(8)Shh的(A)系列2倍稀釋物與細胞溫育5天，使用堿性磷酸酯酶產(chǎn)色底物對硝基苯基磷酸酯在405nm處測量堿性磷酸酯酶活性達到的水平。Mab5E1的(B)系列稀釋物與可溶的Shh(5μg／ml，黑棒)或結(jié)合的Shh(0．25μg／ml，灰色棒)或不添加Shh的載體對照(白色棒)溫育30分鐘，然后在C3HT101／2實驗中進行分析。圖7是在受體結(jié)合實驗中分析Shh。在Patched轉(zhuǎn)染的EBNA-293細胞上通過FACS分析評估可溶的(6)和結(jié)合的(8)Shh對結(jié)合patched的相對效力。測試樣品的系列稀釋物與EBNA-293細胞溫育，洗滌，然后通過樣品與Shh-Ig競爭結(jié)合細胞的能力測量百分結(jié)合。用FITC標(biāo)記的抗Ig抗體探針通過平均熒光作為示出讀數(shù)對結(jié)合的Shh-Ig進行定量。用非線性回歸將數(shù)據(jù)擬合為曲線。圖8是人hedgehog蛋白的N-端片段的序列對比。20kDa人hedgehog蛋白(Sonic“Shh”、Desert“Dhh”和Indian“Ihh”)相對于它們的N-端胱氨酸(在成熟序列中Cys-1)進行序列對比。該胱氨酸在全長度的Shh前體蛋白中由于天然信號序列的存在通常是Cys-24，而該信號序列在分泌期間被除去。胱氨酸的實際位置由于種類差異略有變化。圖9是人hedgehog蛋白的N-端片段的共有序列。圖10是脂質(zhì)鏈長對人Sonichedgehog活性的作用。根據(jù)本發(fā)明合成一系列經(jīng)脂肪酸改性的hedgehog蛋白，并使用在此所述的C3H10T1／2堿性磷酸酯酶誘導(dǎo)作用實驗測試脂肪酸鏈長對hedgehog活性的影響。結(jié)果用方塊圖表示。圖11是棕櫚酰化、肉豆蔻酰化、月桂?；?、癸?；托刘；娜薙onichedgehog的C3H10T1／2實驗。在C3H10T1／2細胞上通過測量堿性磷酸酯酶誘導(dǎo)作用分析配制在5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl、10％辛基糖苷、0．5mMDTT中的棕櫚?；?、月桂酰化、癸?；托刘；娜薙onichedgehog，以及配制在150mMNaCl、0．5mMDTT中的肉豆蔻酰化的人Sonichedgehog。棕櫚酰化(○)、肉豆蔻酰化(●)、月桂酰化(□)、癸?；?■)、辛酰化(△)以及未改性(▲和×)的人Sonichedgehog與細胞溫育5天，使用堿性磷酸酯酶產(chǎn)色底物對硝基苯基磷酸酯在405nm處測量堿性磷酸酯酶活性達到的水平。在一個實驗中用以(▲)表示的未經(jīng)改性的蛋白分析棕櫚酰化、肉豆蔻酰化、月桂酰化和癸?；牡鞍祝刘；牡鞍自诹硪粋€實驗中用以(×)表示的未經(jīng)改性的蛋白進行分析。y-軸上的箭頭表示在沒有添加hedgehog蛋白時的堿性磷酸酯酶的背景水平。圖12是各種經(jīng)疏水性改性的hedgehog的遺傳結(jié)構(gòu)。(A)脂肪酸衍生物，其中R=脂肪酸的烴鏈；(B)噻唑烷衍生物，其中R=烴基；(C)氨基酸取代，其中R=疏水性氨基酸側(cè)鏈；(D)馬來酰亞胺衍生物，其中R=烴基；(E)SH=在野生型hedgehog的N-端胱氨酸上的游離硫醇；(F)碘代乙酰胺衍生物，其中R1=烴基，而R2=H或烴基；以及(G)硫代嗎啉基衍生物，其中R=烴基。對于所有結(jié)構(gòu)，HH=hedgehog。圖13是各種經(jīng)疏水性改性的hedgehog在C3H10T1／2實驗中的相對效力。未經(jīng)改性的野生型人Sonichedgehog的EC50(2μg／ml)用1×表示。其他蛋白的效力用野生型蛋白的EC50除以改性蛋白的EC50的比值表示。除非另有說明，改性是在蛋白的N-端。圖14是未改性的、肉豆蔻?；?、和CⅢ突變的人Sonichedgehog在丙二酸誘導(dǎo)的鼠紋狀體損傷實驗中的相對效力。數(shù)字表示向鼠紋狀體給藥未經(jīng)改性的、肉豆蔻?；?、和CⅢ突變的人Sonichedgehog導(dǎo)致的丙二酸誘導(dǎo)的損傷體積的減少。圖15表示馬來酰亞胺改性的和未經(jīng)改性的hedgehog多肽的特異性活性。發(fā)明的詳細描述本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)在昆蟲或哺乳動物細胞中以全長結(jié)構(gòu)表達的人Sonichedgehog具有懸掛在N-端胱氨酸之α-胺上的疏水性棕櫚?；?。這是本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的第一個例子，其也是以此方式改性的細胞外信號蛋白，而且與硫醇連接的棕櫚酸改性相反，該改性的連接非常容易逆轉(zhuǎn)，而該新型的N-連接的棕櫚酰基與肉豆蔻酸改性類似非常穩(wěn)定。該首次發(fā)現(xiàn)的直接結(jié)果是，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)增加信號蛋白的疏水性可增加蛋白的生物活性。具體而言，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在信號蛋白如hedgehog蛋白上懸掛疏水性基團可增強蛋白的活性。本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，生物活性蛋白的N-端胱氨酸不僅提供用于懸掛疏水性基團的方便位點，由此改變蛋白的物理-化學(xué)性質(zhì)，而且N-端胱氨酸的改性還可增加蛋白的穩(wěn)定性。另外，在蛋白結(jié)構(gòu)的表面上的內(nèi)部氨基酸上添加疏水性基團可增強蛋白的活性。我們使用疏水性改性(如脂質(zhì)和疏水性氨基酸)的hedgehog蛋白作為一個實施例。本發(fā)明的一個方面涉及如下發(fā)現(xiàn)除那些通過在蛋白的細胞外片段的C-端添加膽固醇可見到的作用外，hedgehog基因產(chǎn)物的至少某些生物活性通過用親脂性基團在蛋白的其他位點處和／或用膽固醇以外的基團改性蛋白而得到增強。本發(fā)明的某些方面涉及制備hedgehog多肽，其在除天然處理的蛋白的N-端或C-端殘基以外的位點處被改性，和／或在此等端殘基處用除C-端的膽固醇或N-端的脂肪酸外的親脂性基團改性。如PCT公開WO95／18856和WO96／17924(這些文獻在此并入作為參考)所述，hedgehog多肽通常用于體外和體內(nèi)修補和／或調(diào)節(jié)許多細胞、組織和器官的功能性能，而且具有以下治療作用神經(jīng)保護、神經(jīng)再生、神經(jīng)功能的增強、骨調(diào)節(jié)以及軟骨形成和修補、調(diào)節(jié)精子產(chǎn)生、由原始內(nèi)臟產(chǎn)生的肺、肝和其他器官的調(diào)節(jié)、造血功能的調(diào)節(jié)等。因此，本發(fā)明的方法和組合物包括衍生化的hedgehog多肽在hedgehog蛋白所具有的應(yīng)用方面的用途。另外，所述方法可在培養(yǎng)基中(體外)的細胞上或者在整個動物的細胞上(體內(nèi))進行。在一個方面中，本發(fā)明提供包括用一種或多種在此所述的親脂性基團衍生的hedgehog多肽作為活性成分的藥物制劑。宿主的hedgehog治療對人和動物都是有效的?？墒褂迷诒景l(fā)明中的動物宿主包括作為寵物或用于商業(yè)目的飼養(yǎng)的家養(yǎng)動物和牲畜。其例子包括狗、貓、牛、馬、綿羊、豬和山羊。hedgehog蛋白是一類細胞外信號蛋白，其在脊椎動物和無脊椎動物(見1、2)中都可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的各種方面。最有特征的hedgehog蛋白是Sonichedgehog(Shh)，其參與前后成形、頂外胚層嵴的形成、后腸中胚層、脊柱、遠側(cè)肢、肋骨發(fā)育以及肺的發(fā)育，并在脊髓、后腦和前腦中誘導(dǎo)前側(cè)細胞類型(3-8)。雖然hedgehog蛋白的作用機理尚未完全了解，但最新的生化和遺傳學(xué)數(shù)據(jù)表明，Shh的受體是腫瘤抑制劑基因、patched(9、10)和其他蛋白的產(chǎn)物；在hedgehog信號通路中涉及smoothened(10、11)、Cubitusinterruptus(12、13)和fused(14)。人Shh是經(jīng)合成的45kDa前體蛋白，其自身催化斷裂產(chǎn)生(Ⅰ)20kDa的N-端片段，其對應(yīng)于所有已知的hedgehog信號活性(SEQIDNOS．1-4)；以及(Ⅱ)25kDa的C-端片段，其包含自身處理活性(15-17)。N-端片段由全長前體序列的氨基酸殘基24-197組成。N-端片段在其C-端添加膽固醇時仍保持與膜締合(18、19)。該膽固醇對于限制hedgehog信號的組織局部化是關(guān)鍵性的。添加膽固醇是在處理步驟期間由C-端區(qū)域催化的。除非另有說明，在此引用的文獻都并入作為參考。Ⅰ、定義現(xiàn)參考包括以下定義的詳細描述來進一步說明本發(fā)明?！鞍被帷?肽、多肽或蛋白的單體單元。在天然肽、多肽和蛋白中發(fā)現(xiàn)有20種氨基酸，所有這些氨基酸都是L-異構(gòu)體的。該術(shù)語也包括氨基酸的類似物和蛋白氨基酸及其類似物的D-異構(gòu)體。“蛋白”-基本上由20種氨基酸的任意種類組成的聚合物。雖然“多肽”通常用于指相對較大的多肽，而“肽”通常用于指小的多肽，但在本領(lǐng)域中這些術(shù)語的使用相互交叉，而且是可變化的。在此所用術(shù)語“蛋白”是指肽、蛋白和多肽，除非另有說明?！癗-端”-是指成熟蛋白的第一個氨基酸(氨基酸1)?！癗-端胱氨酸”-是指在SEQIDNOS1-4中所示的氨基酸殘基(1)。其還指任何其他蛋白的1位的任何胱氨酸或該胱氨酸的官能等價物(見部分Ⅳ)?！伴g隔”序列是指可以與單個氨基酸一樣大小的短序列，其可插入在待疏水性改性的氨基酸(例如N-端胱氨酸或其官能等價物)和蛋白的其余部分之間。間隔基是用于分開疏水性改性(如改性的N-端胱氨酸)和蛋白的其余部分，以防止所述改性干擾蛋白的功能和／或使其更易于改性(例如N-端胱氨酸)連接上脂質(zhì)、小泡或其他疏水性基團。因此，如果蛋白在其N-端胱氨酸和其他位點的氨基酸處改性，則可能有兩個或更多個間隔序列。“結(jié)合的”蛋白-是指根據(jù)本發(fā)明經(jīng)疏水性改性的蛋白?！岸鄡r蛋白復(fù)合物”-是指多個蛋白(如一個或多個)。脂質(zhì)或其他疏水性基團連接在上述多個蛋白中的至少一個上。脂質(zhì)或其他疏水性基團可任選地與小泡相接觸。如果蛋白缺乏脂質(zhì)或其他疏水性基團，則該蛋白有可能交聯(lián)或結(jié)合在具有脂質(zhì)或其他疏水性基團的蛋白上。各蛋白可相同或不同，而且各脂質(zhì)或其他疏水性基團也可相同或不同?！靶∨荨?是指任何親脂性分子的聚集體。小泡可由生物性物質(zhì)(如脂質(zhì)雙層如細胞膜或者膽酸衍生的洗滌劑制劑)或非生物性物質(zhì)(部分Ⅳ中所述的非生物洗滌劑小泡)得到。小泡的形狀、類型以及構(gòu)型都不是用于限制本發(fā)明的范圍。氨基酸殘基(如N-端胱氨酸)的“官能等價物”-是指(i)具有與被官能等價物置換的氨基酸殘基類似的反應(yīng)性質(zhì)的氨基酸；(ⅱ)本發(fā)明多肽的配體的氨基酸，該氨基酸具有與被官能等價物置換的氨基酸殘基類似的疏水性(如脂質(zhì))基團結(jié)合性質(zhì)；(ⅲ)具有與被官能等價物置換的氨基酸殘基類似的疏水性(如脂質(zhì))基團結(jié)合性質(zhì)的非氨基酸分子?！盎蛉诤稀?是指兩個或更多個蛋白或其片段經(jīng)由它們單獨的肽骨架通過編碼這些蛋白的多核苷酸分子的基因表達而形成的共線性共價鍵?！扒逗系鞍住被颉叭诤系鞍住笔侵妇幋ahedgehog多肽的第一個氨基酸序列與限定外源或基本上與hh蛋白的任何域不同源的域的第二個氨基酸融合。嵌合蛋白可代表存在于也表達第一個蛋白的生物中(但可在不同的蛋白中)的外源域，或者是不同種類的生物表達的蛋白結(jié)構(gòu)的“種間”、“基因間”等融合。通常情況下，融合蛋白可以用通式(X)n-(hh)m-(Y)n(其中hh代表所有或部分的hedgehog蛋白，X和Y分別獨立地代表不是天然存在的氨基酸序列如與hedghog序列鄰接的多肽鏈，m是大于或等于1的整數(shù)，而各n獨立地是0或者大于或等于1的整數(shù)，n和m優(yōu)選不大于5或10)。“突變體”-在生物遺傳物質(zhì)中的任何變化，特別是在野生型多核苷酸序列中的任何變化(如缺失、取代、添加或改變)或者在野生型蛋白中的任何變化。“野生型”-蛋白或其一部分、或者蛋白序列或其一部分的外顯子的天然多核苷酸序列，如其在體內(nèi)正常存在的一樣?！皹?biāo)準(zhǔn)的雜交條件”-在雜交和洗滌時基本上等于0．5XSSC-約5XSSC和65℃的鹽和溫度條件。在此所用術(shù)語“標(biāo)準(zhǔn)雜交條件”是指操作時的限制，并包括一個雜交條件范圍。也可參見“CurrentProtocolsinMolecularBiology”，JohnWiley&amp;Sons，Inc．NewYork，Sections6．3．1-6．3．6(1989)。“表達控制序列”-當(dāng)操作性地與基因連接時可控制和調(diào)節(jié)這些基因的表達的多核苷酸序列。“操作性連接”-當(dāng)表達控制序列控制和調(diào)節(jié)多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯時多核苷酸序列(DNA、RNA)操作性地連接在表達控制序列上。在此所用術(shù)語“操作性連接”包括在待表達的多核苷酸序列之前具有一個合適的起始信號(如ATG)，并在控制表達控制序列的情況下保持正確的閱讀框以表達多核苷酸序列，以及產(chǎn)生由多核苷酸序列編碼的所希望的多肽?！氨磉_載體”-在將表達載體引入宿主細胞中時可允許至少一個基因之表達的多核苷酸，如DNA質(zhì)?；蚴删w(還包括其他例子)。載體能或不能在細胞中復(fù)制?！胺蛛x的”(與“基本上純的”可交換使用)-當(dāng)用于核酸時，如編碼多肽的多核苷酸序列，代表RNA或DNA多核苷酸、部分基因組多核苷酸、cDNA或合成的多核苷酸，它們由于起源或操作條件(ⅰ)不與所有天然與其結(jié)合的多核苷酸締合(如作為表達載體或其一部分存在于宿主細胞中)；或者(ⅱ)連接在核酸或其他除其天然連接的化學(xué)基團上；或者(ⅲ)不是天然存在的。“分離的”進一步代表以下多核苷酸序列(ⅰ)體外由例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增的；(ⅱ)化學(xué)合成的；(ⅲ)通過克隆重組產(chǎn)生的；或者(ⅳ)通過裂解和凝膠分離純制的。因此，“基本上純的核酸”是不立即與編碼序列之一或其兩者鄰接的核酸，而在正常情況下核酸在其衍生的生物的天然基因組中是與這些編碼序列鄰接的?；旧霞兊腄NA也包括重組的DNA，其是編碼其他hedgehog序列的雜種基因的一部分。“分離的”(與“基本上純的”可交換使用)-當(dāng)用于多核苷酸時，代表多核苷酸或其一部分，它們由于起源或操作條件(ⅰ)存在于宿主細胞中作為表達載體的一部分的表達產(chǎn)物；或者(ⅱ)連接在蛋白或其他除其天然連接的化學(xué)基團上；或者(ⅲ)不是天然存在的，例如通過在蛋白上懸掛或添加至少一個疏水性基團來化學(xué)改性的蛋白，使該蛋白不是天然形式的?！胺蛛x的”進一步代表以下多核苷酸序列(ⅰ)化學(xué)合成的；或者(ⅱ)在宿主細胞中表達、并由締合且污染的蛋白中純制的。該術(shù)語通常代表由其他蛋白以及其天然帶有的核酸中分離出的多核苷酸。優(yōu)選的是，多核苷酸還可從如抗體或用于純制核苷酸的凝膠基質(zhì)(聚丙烯酰胺)中分離出來。“異源啟動子“-在此是指天然不與基因或純制核酸締合的啟動子。“同源的”-在此與“相同的”是同意詞，并指兩個多肽、分子、或者兩個核酸之間的序列類似性。當(dāng)兩個對比的序列中的一個位置被相同的堿或氨基酸單體亞單位(例如兩個DNA分子的一個位置被腺嘌呤占據(jù)，或者兩個多核苷酸的一個位置被賴氨酸占據(jù))，則相應(yīng)的分子在該位置處是同源的。兩個序列之間的部分同源性是兩個序列相匹配或同源的位置除以相比較的位置數(shù)×100的函數(shù)。例如，在兩個序列中10個位置有6個是相匹配的或者是同源的，則兩個序列是60％同源的。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT具有50％的同源性(總共6個位置中有3個是相匹配的)。通常情況下，將兩個序列并列放置進行比較，以給出最大同源性。此等序列對比可例如使用Needleman等人的方法(J．MolBio1．48443-453(1970))來進行，通常是用計算機程序如Align程序(DNAstar，Inc．)來實施。同源序列具有相同或類似的氨基酸殘基，其中類似的殘基是對比參考序列中相應(yīng)氨基酸殘基的保守性替換或者“允許的點突變”。在此方面，參考序列中殘基的“保守性取代”是物理上或者功能上類似于相應(yīng)參考殘基的那些替換，例如具有類似的大小、形狀、電荷、化學(xué)性質(zhì)，包括形成共價鍵或氫鍵的能力，等等。特別優(yōu)選的保守性替換是滿足Dayhoff等人(5蛋白序列和結(jié)構(gòu)的圖譜(AtlasofProteinSequenceandStructure)，5Suppl．3，第22章354-352，Nat．Biomed．Res．Foundation，Washington，D．C．(1978))對“可接受的點突變”所限定的標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明中的“hedgehog蛋白”或“hedgehog多肽”是可相互交換使用的術(shù)語，其具有至少由共有氨基酸序列SEQIDNO4所組成的一部分。該術(shù)語還代表具有生物活性的hedgehog多肽、或者hedgehog多肽的功能變體、或者hedgehog多肽的同源物、或者功能變體。具體而言，該術(shù)語包括hedgehog蛋白及其肽片段的制劑，為激動劑和拮抗劑的形式，因為具體的上下文將使其更為清楚。在此所用術(shù)語“hedgehog蛋白的生物活性片段”是指全長hedgehog多肽的片段，其中該片段特異性激動或拮抗由野生型hedgehog蛋白介導(dǎo)的可誘導(dǎo)事件。hedgehog生物活性片段優(yōu)選是hedgehog蛋白的可溶性細胞外部分，而溶解度是參考生理相容性溶液。示例性的生物活性片段描述在PCT公開WO95／18856和WO96／17924中。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的hedgehog多肽結(jié)合patched蛋白。術(shù)語“相應(yīng)于”，在指具體的多肽或核酸序列時，代表所關(guān)注的序列與所述相應(yīng)的參考序列是相同或同源的。術(shù)語“肽”、“蛋白”和“多肽”在此是可相互交換使用的。術(shù)語“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在此也是可相互交換使用的。術(shù)語“hedgehog片段”和“hedgehogN-端片段”在此可與“hedgehog”相互相互使用。如果具有至少以下一種性質(zhì)，hedgehog分子就具有“生物活性”(ⅰ)分子滿足在此限定的(SEQIDNO4)的hedgehog共有標(biāo)準(zhǔn)，并具有結(jié)合其受體、patched的能力，或者其在表達時編碼具有該特征的多肽；(ⅱ)分子滿足在此限定的hedgehog共有標(biāo)準(zhǔn)，或者其在表達時編碼具有該特征的多肽；以及(ⅲ)其可在C3H10T1／2細胞中誘導(dǎo)堿性磷酸酯酶活性。通常情況下，如果蛋白具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認為是蛋白的體內(nèi)作用的代表性、與其相一致或者是合理預(yù)期的體外作用、性質(zhì)、或特征，則任何蛋白都具有“生物活性”。術(shù)語“疏水性的”是指具有非極性原子化學(xué)基團相互作用而不是與水或其他極性原子相互作用的趨勢。疏水性的物質(zhì)大部分是不溶于水的。具有疏水性的天然物質(zhì)包括脂質(zhì)、脂肪酸、磷脂、鞘脂、?；视?、蠟、固醇、類固醇、萜、前列腺素、血栓烷、白三烯、類異戊二烯、retenoids、生物素以及疏水性氨基酸，如色氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、脯氨酸和酪氨酸。如果其物理性質(zhì)是由于存在非極性原子來確定的，則化學(xué)基團也可以是疏水性的或者具有疏水性。該術(shù)語包括親脂性基團。與多肽有關(guān)的“親脂性基團”是指具有高烴含量并由此使基團對脂質(zhì)相具有高親和性的基團。親脂性基團可例如包括具有約7-30個碳原子的相對較長鏈的烷基或環(huán)烷基(優(yōu)選正烷基)。烷基的端部可以帶有羥基或伯胺“尾”。為進一步說明，親脂性分子包括天然及合成的芳香和非芳香基團，如脂肪酸、酯和醇，其他的脂質(zhì)分子，籠狀結(jié)構(gòu)如金剛烷和富勒烯(buckminsterfullerenes)，以及芳香烴如苯、北、菲、蒽、萘、芘、屈和并四苯?！皟?nèi)部氨基酸”，代表在肽序列中既不是N-端氨基酸也不是C-端氨基酸的任何氨基酸?！氨砻姘被幔?，代表當(dāng)代表折疊成天然形式的時候暴露在溶劑中的任何氨基酸?！凹毎庑盘柕鞍住笔侵赣杉毎蟹置诨蛘呓Y(jié)合在細胞外側(cè)、而且在結(jié)合于目標(biāo)細胞之蛋白的受體上時引發(fā)目標(biāo)細胞中的反應(yīng)的任何蛋白。相對于具體的治療方法，“有效量”的hedgehog多肽是指根據(jù)臨床上對待治療疾病的標(biāo)準(zhǔn)或者化妝目的，制劑中的多肽的量在以部分所希望的劑量施用時對照細胞增殖速率和／或細胞分化狀態(tài)和／或細胞存活率的變化。用本發(fā)明的方法治療的“患者”或者“宿主”可以是人或非人動物。細胞的“生長狀態(tài)”是指細胞的增殖速率和細胞的分化狀態(tài)。除非另有說明，本發(fā)明的實施使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的細胞生物學(xué)、細胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、蛋白化學(xué)、以及免疫學(xué)中的常規(guī)技術(shù)。此等技術(shù)在文獻中都有描述。Ⅱ、分離的hedgehog蛋白的總性質(zhì)本發(fā)明方法的hedgehog組合物的多肽部分是根據(jù)多種技術(shù)產(chǎn)生的，包括天然蛋白的純制、重組產(chǎn)生的蛋白以及合成化學(xué)。多肽形式的hedgehog治療劑優(yōu)選得自于脊椎動物hedgehog蛋白，例如具有相應(yīng)于脊椎生物之天然hedgehog蛋白或其片段的序列。但是，應(yīng)認識到，hedgehog蛋白可相應(yīng)于在任何后生生物中的hedgehog蛋白(或者其片段)。本發(fā)明中所用的分離的hedgehog蛋白是天然產(chǎn)生或者重組的hedgehog蛋白，并可從無脊椎或脊椎動物中獲得(見以下參考文獻)。脊椎動物hedgehog蛋白的成員具有同源性，其中蛋白是由Drosophilahedgehog(hh)基因編碼的(33)。目前，鼠基因組和cDNA文獻的組合篩選已鑒別出三種哺乳動物hh，稱為Sonichedgehog(Shh)、Indianhedgehog(Ihh)和Deserthedgehog(Dhh)，它們也存在于其他哺乳動物中，包括人，而且還存在于魚和鳥中。其他成員包括Moonrathedgehog(Mhh)、以及雞Sonichh和zebrafishSonichh。鼠和雞Shh以及鼠Ihh基因編碼斷裂的多核苷酸，產(chǎn)生約20kDa的氨基端片段(見圖8)和約25kDa的羧基端片段。最優(yōu)選的20kDa片段具有共有序列SEQIDNO4，并包括SEQIDNOS1-3的氨基酸序列。包括20kDa部分的其他各種片段也被認為是在本發(fā)明的范圍中。披露這些序列以及它們的化學(xué)和物理性質(zhì)的文獻包括(34-38)、PCT專利申請WO95／23223(Jessell，Dodd，Roelink和Edlund)、WO95／18856(Ingham，McMahon和Tabin)和WO96／17924(Beachy等人)?？捎糜诒景l(fā)明方法中的成員包括任何天然hedgehog蛋白，包括等位、種系對應(yīng)物或其他的變體，而無論天然或化學(xué)形成的，包括突變蛋白，以及重組形式和新的活性成員。特別有用的hedgehog多肽包括SEQIDNOS1-4。用于本發(fā)明中的分離的hedgehog多肽具有生物活性。多肽包括至少60％、80％、90％、95％、98％或99％同源于氨基酸序列SEQIDNOS1-4的氨基酸序列。多肽還可包括基本上與氨基酸序列SEQIDNOS1-4相同的氨基酸序列。多肽的長度至少具有5、10、20、50、100、或150個氨基酸，而且包括至少5、優(yōu)選至少10、更優(yōu)選至少20、最優(yōu)選至少50、100或150個與SEQIDNOS1-4鄰接的氨基酸。本發(fā)明的優(yōu)選多肽包括hedgehog多肽序列以及其他N-端和／或C-端氨基酸序列，或者其可包括所有hedgehog氨基酸序列或其片段。分離的hedgehog多肽還可是具有第一hedgehog部分和第二多肽部分的重組融合蛋白，例如第二部分多肽具有與hedgehog不相關(guān)的氨基酸序列。第二多肽部分可例如是組氨酸標(biāo)記物、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、DNA結(jié)合域或聚合酶活化域。本發(fā)明的多肽包括那些由于多基因的存在、替代性轉(zhuǎn)錄事件、替代性RNA剪接、以及替代性翻譯和后翻譯事件而產(chǎn)生的多肽。多肽可完全通過合成方法來制得，或者在系統(tǒng)如培養(yǎng)細胞中表達，當(dāng)?shù)鞍自谔烊患毎斜磉_時該系統(tǒng)產(chǎn)生基本上相同的后翻譯改性，或者當(dāng)在天然細胞中表達時該系統(tǒng)不產(chǎn)生后翻譯改性。在優(yōu)選實施方案中，分離的hedgehog是具有一種或多種以下特征的hedgehog多肽(ⅰ)其與氨基酸SEQIDNOS1-4具有至少30、40、42、50、60、70、80、90或95％相同的序列；(ⅱ)其具有胱氨酸或官能等價物作為N-端；(ⅲ)其可在C3H10T1／2細胞中誘導(dǎo)堿性磷酸酯酶活性；(ⅳ)其與SEQIDNOS1-4的多肽序列具有至少50％、優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少70、80、90或95％的總序列相同性；(ⅴ)其可由天然源如哺乳動物細胞中分離；(ⅵ)其可結(jié)合或與patched相互作用；以及(ⅶ)其是經(jīng)疏水性改性的(即、其具有至少一個連接在多肽上的疏水性基團)。Ⅲ、其他蛋白因為目前已有將胱氨酸殘基(或其官能等價物)改造進多肽的原序列中的技術(shù)，實際上可用在此描述的方法將任何蛋白轉(zhuǎn)化為疏水性改性的形式。病毒受體、細胞受體、以及細胞配體都是有用的，這是因為它們通常結(jié)合具有許多受體復(fù)制體的細胞或組織?？墒褂帽景l(fā)明的方法復(fù)合化的有用病毒-細胞蛋白受體包括ICAM1(一種鼻病毒受體)、CD2(Epstein-Ban病毒受體)、以及CD4(人免疫缺損病毒(HIV)的受體)。其他蛋白包括細胞粘連分子，例如ELAM-1和VCAM-1和VAM-1b以及它們的淋巴細胞對應(yīng)物(配體)；淋巴細胞伴隨抗原LFA1、LFA2(CD2)和LFA3(CD58)，CD59(CD2的第二配體)，CD11／CD18中的成員以及非常晚抗原如VLA4和它們的配體。由各種病原體(如細菌、真菌、病毒和其他真核寄生蟲)產(chǎn)生的免疫原也可用作本發(fā)明方法中的多肽。細菌免疫原包括但不限于針對細菌性肺炎和肺囊蟲性肺炎的細菌源。寄生蟲源包括Plasmodium瘧疾寄生蟲。病毒源包括痘病毒(如牛痘、單純皰疹、巨細胞病毒)；腺病毒；乳多空病毒(如乳頭瘤病毒)；細小病毒(如腺伴隨病毒)；逆轉(zhuǎn)錄病毒(如HTLVⅠ、HTLVⅡ、HIVⅠ和HIVⅡ)以及其他病毒。免疫球蛋白或其片段也可用作根據(jù)本發(fā)明改性的多肽。人們可以使用常規(guī)方法(49)產(chǎn)生識別特異性抗原的單克隆Fab片段，并使用單獨的Fab域作為根據(jù)本發(fā)明的多聚結(jié)構(gòu)中的功能部分。其他有用的蛋白包括凝溶膠蛋白(50)；細胞因子，包括各種干擾素(干擾素-α、干擾素-β、和干擾素-γ)；各種白介素(如IL-1、-2、-3、-4等)；腫瘤壞死因子-α和-β；單細胞刺激因子(M-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅細胞生成素、血小板衍生的生長因子(PDGF)、以及人和動物激素，包括生長激素和胰島素。通常情況下，本發(fā)明之經(jīng)改性的蛋白的結(jié)構(gòu)具有以下通式A-Cys-[Sp]-B-[Sp]-X，其中A是疏水性基團；Cys是胱氨酸或其官能衍生物；[Sp]是任選的間隔肽序列；B蛋白(其任選地具有在此所示的其他間隔肽序列)；以及X是連接(任選通過間隔肽)在蛋白的C-端上或者蛋白的其他表面位點上的疏水性基團，而衍生化的蛋白包括A或X中的至少一個。如果X是膽固醇，則B可能是或可能不是hedgehog蛋白。如上所述，間隔基的目的是在疏水性基團和蛋白的其他部分之間形成間隔，以使疏水性基團(如經(jīng)改性的N-端胱氨酸)更易于連接在有可能為脂質(zhì)或小泡的其他部分上。間隔基的另一個目的是使改性步驟更難于干擾蛋白的功能。間隔基在長度上可與單個氨基酸一樣小。通常情況下，脯氨酸和甘氨酸是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的間隔序列得自于Sonichedgehog，并由氨基酸序列G-P-G-R組成。Ⅳ、制備重組多肽在此描述的分離多肽可用任何本領(lǐng)域中已知的合適方法來制備。此等方法包括直接蛋白合成法直至構(gòu)建編碼分離多肽序列并在合適的轉(zhuǎn)化宿主中表達這些序列的DNA序列。在重組方法的一個實施方案中，DNA序列通過分離或合成編碼野生型目的蛋白的DNA序列來構(gòu)建。任選地，該序列可通過位點特異性誘變來進行誘變處理，以形成其功能類似物。見例如(40)和第4，588，585號美國專利。其他構(gòu)建編碼目的多肽的DNA序列的方法是使用寡核苷酸合成劑的化學(xué)合成法。此等寡核苷酸可優(yōu)選根據(jù)所希望的多肽的氨基酸序列來設(shè)計，并優(yōu)選地選擇那些有利于其中產(chǎn)生目標(biāo)重組多肽的宿主細胞的編碼子。標(biāo)準(zhǔn)方法可適用于合成編碼目的分離多肽的分離多核苷酸序列。例如，可使用完整氨基酸序列構(gòu)建反向翻譯的基因。見Maniatis等人，同上。另外，可合成包含編碼特定分離多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可合成編碼部分所希望的多肽的幾個小的寡核苷酸，然后進行連接。單獨的寡核苷酸通常包含用于補償性裝配的5＇或3＇突出端。一旦裝配(通過合成、位點針對性的誘變或者通過其他方法)，編碼特定的目的分離多肽的突變DNA序列插入在表達載體中，并操作性地連接在適合于在所希望的宿主中表達蛋白的表達控制序列上。合適的裝配可通過核苷酸測序、限制性作圖、以及生物活性多肽在合適宿主中的表達來證實。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，為使轉(zhuǎn)染基因在宿主中產(chǎn)生高水平的表達，該基因必須操作性地連接在轉(zhuǎn)錄和翻譯表達控制序列上，該序列在所選擇的表達宿主中是功能性的。表達控制序列和表達載體的選擇取決于宿主的選擇。可以使用各種表達宿主／載體組合。對于真核宿主有用的表達載體包括例如由SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和巨細胞病毒得到的包含表達控制序列的載體。對于細菌宿主有用的表達載體包括已知的細菌質(zhì)粒，如Esherichiacoli的質(zhì)粒，包括pCR1、pBR322、pMB9以及它們的衍生物，更寬宿主范圍的質(zhì)粒，如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。優(yōu)選的E．Coli載體包括含有λ噬菌體pL啟動子的pL載體(第4，874，702號美國專利)、包含T7聚合酶啟動子的pET載體(Studier等人，MethodsinEnzymology18560-89，19901)以及pSP72載體(Kaelin等人，同上)。對于酵母細胞有用的表達載體例如包括2T和著絲質(zhì)粒。另外，各種表達控制序列都可用于這些載體中。此等有用的表達控制序列包括與上述表達載體的結(jié)構(gòu)基因有關(guān)的表達控制序列。有用的表達控制序列的例子包括例如SV40或腺病毒的早和晚啟動子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、噬菌體λ的主要操縱基因和啟動子區(qū)域如pL、fd包衣蛋白的控制區(qū)域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酯酶的啟動子如Pho5、酵母α-接合系統(tǒng)的啟動子、以及已知控制原核或真核細胞和它們的病毒的基因表達的其他序列、以及它們的各種組合。可使用任何合適的宿主以定量地產(chǎn)生在此所述的分離hedgehog多肽，包括細菌、真菌(酵母)、植物、昆蟲、哺乳動物或其他合適的動物細胞或細胞系、以及轉(zhuǎn)基因動物或植物。更具體而言，這些宿主包括已知的真核和原核宿主，如E．Coli、Pseudomonas、Bacillus、Streptomyces株，真菌，酵母(如Hansenula)，昆蟲細胞如Spodopterafrugiperda(SF9)，以及HighFiveTM(見實施例1)，動物細胞如中華倉鼠卵巢(CHO)、鼠細胞如NS／O細胞、非洲綠猴細胞COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10，以及人細胞和植物細胞。應(yīng)理解的是，并不是所有的載體和表達控制序列對于表達特定的分離多肽都具有相同的作用。所有的宿主也不是對相同的表達系統(tǒng)都起到相同的作用。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可不用進行實驗就在這些載體、表達控制系統(tǒng)和宿主中進行選擇。例如，為在大規(guī)模的動物培養(yǎng)中產(chǎn)生目標(biāo)分離多肽，表達載體的復(fù)制數(shù)量必須被控制?？蓴U增的載體在本領(lǐng)域中是已知的。例如參見(41)以及第4，470，461和5，122，464號美國專利。DNA序列操作性地連接在表達控制序列上包括在DNA序列的上游在正確的閱讀框中提供翻譯起始信號。如果所表達的具體DNA序列不是以蛋氨酸開始的，則起始信號將產(chǎn)生另外一個氨基酸(蛋氨酸)，其位于產(chǎn)物的N-端。如果疏水性基團連接在包含N-端蛋氨酸的蛋白上，則該蛋白可直接使用在本發(fā)明的組合物中。然而，因為蛋白的優(yōu)選N-端是由胱氨酸(或其功能類似物)組成的，蛋氨酸必須在使用前被除去。在本領(lǐng)域中有許多將此等N-端蛋氨酸從用它們表達的多肽中除去的方法。例如，某些宿主和發(fā)酵條件允許在體內(nèi)基本上除去所有的N-端蛋氨酸。其他宿主需要體外除去N-端蛋氨酸。此等體外和體內(nèi)方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。由轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的蛋白可根據(jù)任何合適的方法進行純制。此等標(biāo)準(zhǔn)方法包括色譜法(如離子交換、親和、以及尺寸柱色譜)、離心、差示溶解度、或通過蛋白純制中任何其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。對于免疫親和色譜法(見實施例1)，如Sonichedgehog的蛋白可通過將其結(jié)合在親和柱上來分離，該親和柱包含抗Sonichedgehog的抗體或者相關(guān)蛋白，然后固定在固定載體上?；蛘?，在蛋白上連接親和標(biāo)記物如六組氨酸、麥芽糖結(jié)合域、流感包衣序列、以及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，以更容易由合適的親和柱中純制。分離蛋白也可物理性地用諸如蛋白酶解、核磁共振以及X射線晶體學(xué)的技術(shù)來表征。A、片段和類似物的制備分離蛋白的片段(如SEQIDNOS1-4的片段)也可通過重組法、蛋白酶解消化、或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過化學(xué)合成來有效地制備。在重組法中，多肽的內(nèi)部或端片段可通過由編碼分離hedgehog多肽的DNA序列的一個端部(對于端片段)或兩個端部(對于內(nèi)部片段)除去一個或多個核苷酸來產(chǎn)生。誘變DNA的表達產(chǎn)生多肽片段。用“端切”的內(nèi)切核酸酶進行消化也可產(chǎn)生編碼一系列片段的DNA。編碼蛋白片段的DNA也可通過隨機剪切、限制消化或其組合來產(chǎn)生。蛋白片段可直接由完整的蛋白產(chǎn)生。肽可特異性地用蛋白酶解酶斷裂，包括但不限于纖溶酶、凝血酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或胃蛋白酶。這些酶對其攻擊的肽鍵類型都是特異性的。胰蛋白酶催化水解的肽鍵中，羰基是堿性氨基酸的，通常為精氨酸或賴氨酸。胃蛋白酶和糜蛋白酶催化水解的羰基是芳香氨基酸的，如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。防止易受蛋白水解酶攻擊的位點斷裂，由此可產(chǎn)生另外經(jīng)斷裂的蛋白片段。例如，賴氨酸的ε-氨基酸基團在中等堿性溶液中與乙基三氟硫代乙酸酯反應(yīng)，形成被阻斷的氨基酸殘基，其相鄰肽鍵就不再對胰蛋白酶的水解作用敏感?？筛男缘鞍滓栽黾訉Φ鞍姿饷该舾械碾逆I。例如，用β-鹵代乙胺對胱氨酸殘基進行烷基化產(chǎn)生被胰蛋白酶水解的肽鍵(51)。另外，可使用在特異性殘基處斷裂肽鏈的化學(xué)試劑。例如，溴化氰在蛋氨酸殘基處斷裂肽(52)。因此，用各種改性劑、蛋白水解酶和／或化學(xué)試劑的組合進行處理，由此可將蛋白分裂成所希望長度的片段，其中沒有片段的重疊，或者將其分裂成所希望重疊的重疊片段。片段也可通過使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)例如Merrifield固相Fmoc或t-Boc化學(xué)(Merrifield，RecentProgressinHormoneResearch23∶451(1967))經(jīng)化學(xué)方法合成。以下將討論用于產(chǎn)生和測試片段及類似物的現(xiàn)有技術(shù)的方法的例子。這些或類似的方法可用于制備和篩選具有生物活性的分離多肽(如hedgehog)的片段及類似物。測試hedgehog片段和類似物是否具有生物活性的示例性方法見實施例3。B、制備經(jīng)改變的DNA和肽序列隨機法蛋白的氨基酸序列變體(如SEQIDNOS1-4的變體)可通過隨機誘變編碼蛋白或其特定部分的DNA來制備。有用的方法包括PCR誘變以及飽和誘變法。也可通過合成一套簡并的寡核苷酸序列來形成一系列隨機的氨基酸序列變體。使用經(jīng)改變的DNA和肽來產(chǎn)生給定蛋白的氨基酸序列變體的方法在本領(lǐng)域中是已知的。以下的此類方法的例子并不是用于限制本發(fā)明的范圍，而僅是用于說明代表性的技術(shù)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可認識到在此方面還可使用其他方法。PCR誘變簡言之，使用Taq聚合酶(或其他聚合酶)在DNA的克隆片段中引入隨機的突變(42)。PCR條件的選擇應(yīng)通過使用例如5的dGTP／dATP比例并在PCR反應(yīng)中添加Mn2+而用TaqDNA聚合物降低DNA合成的保真度。擴增的DNA片段集合體插入合適的克隆載體中，以形成隨機的突變基因庫。飽和誘變(43)中描述了通用的方法。簡言之，該技術(shù)包括通過體外化學(xué)處理或輻射單鏈DNA、然后合成cDNA鏈來產(chǎn)生突變。突變頻率用處理的程度來調(diào)節(jié)，而基本上所有可能的堿替代都可得到。簡并的寡核苷酸誘變可由一系列簡并的寡核苷酸序列產(chǎn)生同源性肽庫。簡并序列的化學(xué)合成可在自動DNA合成儀中進行，然后將合成的基因連接在合適的表達載體中。例如參見(44、45)以及Itakura等人(RecombinantDNA，Proc．3rdClevelandSymposiumonMacromolecules，pp．273-289(A．G．Waltong編輯)，Elsevier，Amsterdam，1981)。C、經(jīng)改變的DNA和肽序列的制備直接法非隨機或直接的誘變可在編碼分離肽的多核苷酸序列的特異性部分中產(chǎn)生特異性的序列或突變，以形成包括缺失、插入、或替換分離肽之已知氨基酸序列的殘基的變體。突變位點可單獨或系列地如下進行改變(1)首先根據(jù)要達到的結(jié)果用保守的氨基酸、然后用更多的游離基選擇進行替換；(2)刪除目標(biāo)殘基；或(3)在鄰近位點插入相同或不同類別的殘基，或者組合上述選擇1-3。為清楚起見，此等位點直接法是其中可將N-端胱氨酸(或其功能類似物)引入給定的多肽序列中的方法，以形成用于疏水性基團的連接位點。丙氨酸掃描誘變該方法局限于那些對于誘變而言為優(yōu)選位點的所希望的蛋白的殘基或區(qū)域(46)。在丙氨酸篩選中，可選擇該殘基或目標(biāo)殘基組并用丙氨酸替換。該替換可影響氨基酸與相鄰氨基酸和／或與周圍含水或膜環(huán)境的相互作用。那些對替換具有官能敏感性者可通過在其他位點處引入其他變體來精制。寡核苷酸介導(dǎo)的誘變該方法的一個版本可用于制備DNA的替換、缺失、以及插入變體(47)。簡言之，通過雜交編碼DNA突變的寡核苷酸引物成為通常為單鏈質(zhì)?；蚴删w的DNA模板來改變所希望的DNA，所述質(zhì)粒或噬菌體包含所希望之蛋白(例如hedgehog蛋白)的未經(jīng)改變或野生型的DNA序列模板。雜交后，用DNA聚合酶制備第二和補償性的模板DNA鏈，其將插入寡核苷酸引物，然后在所希望的DNA序列中編碼所選擇的改變。通常情況下使用鏈長至少為25個核苷酸的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸具有12-15個核苷酸，這些核苷酸完全補償在突變一側(cè)上的模板。這確保寡核苷酸將適當(dāng)?shù)仉s交成單鏈DNA模板分子。盒式誘變該方法(48)需要包含待突變的蛋白亞單元DNA的質(zhì)粒或其他載體。鑒別在蛋白亞單元DNA中的編碼子，然后在經(jīng)鑒別的突變位點的各側(cè)上插入獨特的限制性內(nèi)切核酸酶，其中使用上述涉及寡核苷酸的誘變法。接著在這些位點處剪切質(zhì)粒，使其線性化。編碼在限制位點之間但包含所希望之突變的DNA序列的雙鏈寡核苷酸使用標(biāo)準(zhǔn)方法合成。兩個鏈單獨合成，然后使用標(biāo)準(zhǔn)法雜交在一起。該雙鏈寡核苷酸是“盒”，而且其具有與線性質(zhì)粒兩端相配適的3＇和5＇端，使得它能夠直接連接于其中。質(zhì)?，F(xiàn)在包含突變的所希望的蛋白亞單元DNA序列。組合透變在該方法的一個版本中(Ladner等人，WO88／06630)，同源物或其他相關(guān)蛋白組的氨基酸序列進行比較，優(yōu)選促進盡可能最高的同源性。出現(xiàn)在對比序列的給定位置處的所有氨基酸可進行選擇，以產(chǎn)生簡并的組合序列。在核酸水平上進行組合誘變，由此產(chǎn)生不同的基因庫。例如，合成寡核苷酸的混合物可用酶連接在基因序列中，以使簡并的潛在序列如單獨的肽一樣可被表達，或者如包含整個簡并序列的蛋白一樣。D、分離多肽的其他變體本發(fā)明中包括的分離分子是等位變體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、以及用DNA編碼的蛋白，所述DNA在高或低嚴格條件下雜交成核酸，該核酸編碼諸如Sonichedgehog(SEQIDNO1)的N-端片段的多肽以及特異性通過針對hedgehog肽的抗血清、特別是通過針對hedgehog的活性位點或結(jié)合位點的抗血清而結(jié)合的多肽。在此所述的所有變體期望(1)保留原始蛋白的生物功能；以及(2)保留連接至疏水性基團(如脂質(zhì))上的能力。本發(fā)明方法的特征還在于分離肽如hedgehog的片段、優(yōu)選生物活性片段或類似物的用途。具體而言，生物活性片段或類似物是具有體內(nèi)或體外活性者，該活性是SEQIDNOS1-4所示肽或者其他天然分離hedgehog的特征。更優(yōu)選的是，疏水性改性的片段或類似物在體內(nèi)或體外實驗中具有至少10％、優(yōu)選40％或更多、或最優(yōu)選至少90％的Sonichedgehog活性(見實施例3)。類似物與天然的分離蛋白的不同之處在于氨基酸序列或者不涉及序列或者這兩個方面。本發(fā)明最優(yōu)選的多肽具有優(yōu)選的非序列改性，其包括體內(nèi)或體外化學(xué)衍生化(如其N-端的衍生化)，以及有可能的乙?；?、甲基化、磷?；?、酰胺化、羧基化或糖苷化的變化。其他類似物包括諸如Sonichedgehog的蛋白或其生物活性片段，其序列與野生型共有序列(如SEQIDNO4)的不同在于一個或多個保守性氨基酸替換或者一個或多個非保守性的氨基酸替換、或者不消除分離蛋白之生物活性的缺失或插入。保守性替換通常包括用具有類似特征的其他氨基酸替換其中的一個氨基酸，如以下組中的替換纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸和異亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非極性的疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。極性的中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。其他保守性的替換對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。例如，對于丙氨酸，保守性的替換可選自于D-丙氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸、L-胱氨酸和D-胱氨酸。對于賴氨酸，替換可以是D-賴氨酸、精氨酸、D-精氨酸、高精氨酸、蛋氨酸、D-蛋氨酸、鳥氨酸、或D-鳥氨酸中的任何一種。通常情況下，可用于在分離多肽的功能性質(zhì)中誘導(dǎo)產(chǎn)生變化的替換如下(ⅰ)極性殘基，如絲氨酸或蘇氨酸，用于替換或者被疏水性殘基如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸替換；(ⅱ)胱氨酸殘基用于替換或者被任何其他的殘基(見實施例10)替換；(ⅲ)具有正電性側(cè)鏈的殘基如賴氨酸、精氨酸或組氨酸，用于替換或者被具有負電性側(cè)鏈的殘基如谷氨酸或天冬氨酸替換；或者(ⅳ)具有大的側(cè)鏈的殘基如苯丙氨酸用于替換或者被不具有此等側(cè)鏈的殘基如賴氨酸替換?？捎糜诒景l(fā)明方法中的其他類似物是具有可增加肽的穩(wěn)定性的改性者。此等類似物可在肽序列中包括例如一個或多個非肽鍵(其替換肽鍵)。其還包括包含除天然L-氨基酸以外的殘基的類似物，例如D-氨基酸或非天然或合成的氨基酸，如β或γ氨基酸和環(huán)狀類似物。在分離的hedgehog多肽中插入D-氨基酸代替L-氨基酸可以增加其對蛋白酶的耐受性。參見第5，219，990號美國專利(同上)。適用于分離的hedgehog類似物的術(shù)語“片段”可與單個氨基酸一樣大小，其條件是保留生物活性。其在長度是可以是至少約20個殘基、更通常至少約40個殘基、優(yōu)選至少約60個殘基。片段可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來產(chǎn)生。候選片段具有分離hedgehog的生物活性的能力也可用在此所述的本領(lǐng)域已知的方法來評估。ⅴ、制備疏水性衍生物本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，增加信號蛋白如hedgehog蛋白的整體疏水性可增加該蛋白的生物活性。信號蛋白如hedgehog的效力可如下增加(a)化學(xué)改性，例如在N-端胱氨酸的巰基和／或α-胺上添加疏水性基團(實施例8和9)；(b)用疏水性氨基酸替換N-端胱氨酸(實施例10)；或者(c)用不同的氨基酸替換N-端胱氨酸，然后化學(xué)改性經(jīng)替換的殘基，以在替換位點處增加疏水性基團。另外，通過(a)用疏水性氨基酸替換內(nèi)部殘基；或者(b)用不同的氨基酸替換內(nèi)部殘基、然后化學(xué)改性經(jīng)替換的殘基，以在替換部位處添加疏水性基團(見實施例10)，由此在蛋白表面上的內(nèi)部殘基處用疏水性基團改性蛋白如hedgehog蛋白，這將維持或者增強蛋白的生物活性。再者，通過(a)用疏水性氨基酸替換C-端殘基；或者(b)用不同的氨基酸替換C-端殘基、然后化學(xué)改性經(jīng)替換的殘基，以在替換部位處添加疏水性基團，由此在C-端處用疏水性基團改性蛋白如hedgehog蛋白，這將維持或增強蛋白的生物活性。有很多可用于衍生hedgehog多肽的親脂性基團。親脂性基團例如是具有約7-30個碳原子的相對較長的烷基或環(huán)烷基(優(yōu)選正烷基)。烷基可以用羥基或伯胺“尾”作為端部。為進一步說明，親脂性分子包括天然及合成的芳香和非芳香基團如脂肪酸、酯和醇，其他脂質(zhì)分子，籠結(jié)構(gòu)如金剛烷和富勒烯，以及芳香烴如苯、北、菲、蒽、萘、芘、屈和并四苯。特別有用的親脂性分子是脂族環(huán)烴、飽和及不飽和脂肪酸以及其他脂質(zhì)和磷脂基團、蠟、膽固醇、類異戊二烯、萜和多脂族環(huán)烴如金剛烷和富勒烯、維生素、聚乙二醇或寡聚乙二醇、(C1-C18)-烷基磷酸二酯、-O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-烷基、以及特別是與芘衍生物的結(jié)合物。親脂性基團可以是適合用于本發(fā)明中的親脂性染料，其包括但不限于二苯基己三烯、Nile紅、N-苯基-1-萘胺、Prodan、Laurodan、芘、北、羅丹明、羅丹明B、四甲基羅丹明、Texas紅、硫羅丹明、1，1′-雙十二烷基-3，3，3＇，3＇-四甲基indo羰花青高氯酸鹽、十八烷基羅丹明B以及可以從MolecularProbesInc．得到的BODIPY染料。其他示例性的親脂性基團包括脂族羰基，其包括1-或2-金剛烷基乙?；?、3-甲基金剛烷-1-基乙?；?、3-甲基-3-溴-1-金剛烷基乙酰基、1-萘烷乙酰基、樟腦乙酰基、莰烷乙酰基、降金剛烷基乙?；⒔当橐阴；?、二環(huán)[2．2．2．]-辛-5-烯乙?；?、1-甲氧基二環(huán)[2．2．2]-辛-5-烯-2-羰基、cis-5-降冰片烯-內(nèi)-2，3-二羰基、5-降冰片烯-2-基乙?；?、(1R)-(-)-桃金娘烯烷乙?；?、2-降冰片烷乙?；⒖?3-氧-三環(huán)[2．2．1．0&lt;2，6&gt;]-庚烷-7-羰基、癸?；?、十二烷?；?、十二烷烯?；?、十四烷二烯?；?、癸炔酰基或十二炔酰基。示例性疏水性改性的結(jié)構(gòu)見圖12所示。如果在具體的位置處沒有合適的氨基酸，則使用位點針對性的誘變，以在該位點處設(shè)置反應(yīng)性氨基酸。反應(yīng)性氨基酸包括胱氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、精氨酸、蛋氨酸、以及色氨酸?？墒褂谜T變以在N-或C-端或者在內(nèi)部位置處設(shè)置反應(yīng)性氨基酸。例如，我們發(fā)現(xiàn)，可化學(xué)改性生物活性蛋白如hedgehog蛋白的N-端胱氨酸，或者全部消除N-端胱氨酸并仍保留蛋白的生物活性，其條件是改性或替換的活性基團是疏水性的。發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，hedgehog的生物活性的增強大致與改性基團的疏水性有相關(guān)關(guān)系。除增強蛋白的活性外，改性或替換N-端胱氨酸可消除在蛋白的制備、純制、配制和儲存期間發(fā)生胱氨酸之非所希望的交叉反應(yīng)和／或改性。N-端胱氨酸的硫醇具有非常強的反應(yīng)性，這是因為其靠近α-胺，降低了胱氨酸的pKa，并增加了在中性或酸性pH時反應(yīng)性硫醇離子的質(zhì)子解離和形成。我們已經(jīng)證實，用疏水性氨基酸替換hedgehog的N-端胱氨酸可在以細胞為基礎(chǔ)的信號實驗中得到效力增加的蛋白。通過替換胱氨酸，該方法消除了抑制在蛋白的制備、純制、配制和儲存期間發(fā)生胱氨酸之非所希望的其他改性的問題。該方法的通性用我們以下的發(fā)現(xiàn)來支持三種不同的疏水性氨基酸，苯丙氨酸、異亮氨酸和蛋氨酸，分別產(chǎn)生更具活性的hedgehog。因此，用任何其他疏水性的氨基酸替換胱氨酸應(yīng)可產(chǎn)生活性的蛋白。另外，因為我們已在C3H10T1／2實驗中發(fā)現(xiàn)氨基酸或活性改性基團的疏水性與相應(yīng)經(jīng)改性的蛋白效力之間的相關(guān)關(guān)系(如Phe＞Met，長鏈脂肪酸＞短鏈脂肪酸)，所以可認為在hedgehog序列上添加更多的疏水性氨基酸可增加蛋白的效力，超過添加單個氨基酸所達到的水平。的確，在C3H10T1／2實驗中，與僅添加單個異亮氨酸(見實施例10)的突變體相比，在人Sonichedgehog的N-端上添加兩個連續(xù)的異亮氨酸殘基可使效力增加。因此，在表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)中于hedgehog蛋白的N-端或C-端或者這些位置的一些組合處添加疏水性氨基酸，可預(yù)期產(chǎn)生活性更高的蛋白。經(jīng)替換的氨基酸不必是20種常見氨基酸中的一種。對于在蛋白的特定位點處替換非天然的氨基酸的方法已有報道(78、79)，而且如果氨基酸的疏水性更強、更耐受酶解攻擊、或者可用于進一步在體內(nèi)針對hedgehog蛋白的特殊位點，這將是非常有利的，而后一種情況可使活性更強或更具特異性。非天然的氨基酸可在體外翻譯過程中插入在蛋白的特殊位點處，而且在體內(nèi)產(chǎn)生更大規(guī)模地形成此等經(jīng)改性蛋白的系統(tǒng)的方法已有報道。出乎意料的是，如hedgehog蛋白的蛋白根據(jù)本發(fā)明改性后仍可保留其生物活性。首先，N-端胱氨酸在所有已知的hedgehog蛋白序列中都被保留，包括魚、蛙、昆蟲、鳥和哺乳動物。因此，有理由相信N-端胱氨酸的巰基對于蛋白的結(jié)構(gòu)或活性是非常重要的。第二，由于酶解斷裂或突變成親水性氨基酸(如天冬氨酸或組氨酸)，缺乏N-端胱氨酸的hedgehog蛋白在以細胞為基礎(chǔ)的C3H10T1／2實驗中是無活性的，該實驗描述于實施例3中。有許多改性N-端胱氨酸的方法可保護硫醇并添加疏水性基團。這些改性法將在以下詳細討論。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定何種改性對于具體的治療應(yīng)用是最合適的。影響此等選擇的因素包括生產(chǎn)、純制和配制的成本和難易程度、溶解度、穩(wěn)定性、效力、藥物動力學(xué)和藥代動力學(xué)、安全性、免疫原性以及組織靶向。A、原始氨基酸序列的化學(xué)改性可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多種方式進行N-端胱氨酸的化學(xué)改性，以保護硫醇，并用疏水性基團同時活化。巰基基團，其中以硫醇離子作為活性種類，在蛋白中是最具有反應(yīng)性的官能團，有許多試劑可比任何其他基團更快地與硫醇反應(yīng)。見有關(guān)蛋白結(jié)合與交聯(lián)的化學(xué)(ChemistryofProteinConjugationandCross-Linking)(S．S．Wong，CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)L，1991)。N-端胱氨酸的硫醇可在所有hedgehog蛋白中發(fā)現(xiàn)，并認為比序列中的內(nèi)部胱氨酸具有更高的反應(yīng)性。這是因為接近α-胺將降低硫醇的pKa，使得反應(yīng)性硫醇離子在中性或酸性pH時產(chǎn)生更大的解離度。另外，結(jié)構(gòu)N-端的胱氨酸比hedgehog序列中的其他兩個胱氨酸更易于暴露，所述其他兩個胱氨酸發(fā)現(xiàn)被埋在蛋白結(jié)構(gòu)中。我們已經(jīng)證實，N-端胱氨酸僅在與N-乙基馬來酰亞胺于pH5．5反應(yīng)1小時(見實施例9)、以及在與N-異丙基碘代乙酰胺于pH7．0反應(yīng)18小時(見實施例9)后才被改性。該方法的其他例子是與其他α-鹵代乙?；衔?、有機汞、二硫化物試劑、以及其他N-取代的馬來酰亞胺的反應(yīng)。這些活性種類的多數(shù)疏水性衍生物都可市售得到(如碘乙酸乙酯(Aldrich，MilwaukeeWI)、二硫二苯(Aldrich)、和N-芘馬來酰亞胺(MolecularProbes，EugeneOR))或可容易地合成(如N-烷基碘代乙酰胺(84)、N-烷基馬來酰亞胺(85)、和有機汞化合物(86))。我們已經(jīng)表明，人Sonichedgehog的N-端胱氨酸可特異性地用N-異丙基碘代乙酰胺改性，而且在C3H10T1／2實驗中，經(jīng)疏水性改性的蛋白的效力比未經(jīng)改性的蛋白高2倍(見實施例9)。可以認為，用長鏈烷基碘代乙酰胺衍生物改性Shh可產(chǎn)生具有更高效力的經(jīng)改性的蛋白。此等N-烷基碘代乙酰胺可容易地通過使用市售起始物由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員合成得到。N-端胱氨酸的反應(yīng)性的其他方面是可參與對于其1，2-氨基硫醇構(gòu)型而言為獨特的反應(yīng)化學(xué)中。一個例子是與硫酯基團反應(yīng)通過硫酯的快速S-N遷移形成N-端酰胺基團。該反應(yīng)化學(xué)可與合成肽一起偶聯(lián)，并可用于通過合適的活化肽添加單個或單個、天然或非天然的氨基酸或其他疏水性基團。在此所示的另一個例子是與醛反應(yīng)形成噻唑烷加成物。硫醇酯(如C2-C24飽和及不飽和脂肪酰基輔酶A酯(SigmaChemicalCo．，St．LouisMO))、醛(丁醛、正癸醛以及正十二烷基醛(Aldrich))和酮(如2-、3-和4-癸酮(Aldrich))的許多疏水性衍生物都可市售得到或者可容易地合成(87、88)。按照類似的方式，實施例9中所述的以1-溴-2-丁酮化學(xué)為例說明的硫代嗎啉衍生物可由各種α-鹵代酮起始物制備(88)。因為很容易發(fā)現(xiàn)改性N-端胱氨酸或者任何蛋白中的胱氨酸之硫醇的替代方法，我們并不希望囿于在此所述的具體實施例。蛋白的α-胺相對于蛋白中的其他胺優(yōu)選改性，這是因為在中性或酸性pH時其較低的pKa產(chǎn)生更大量的反應(yīng)性未質(zhì)子化的形式。我們已經(jīng)表明，用長鏈脂肪酰胺基團改性N-端胺能夠在保持游離胱氨酸硫醇基團的同時活化hedgehog蛋白至兩個數(shù)量級(見實施例8)。因此，針對優(yōu)選與N-端胺反應(yīng)的化學(xué)也可用于增加hedgehog蛋白的效力。已知芳基鹵、醛和酮、酸酐、異氰酸酯、異硫氰酸酯、亞氨酸酯、酰鹵、N-羥基琥珀酰亞胺基(如硫-NHS-乙酸酯)、硝基苯基酯、?；溥?、和其他活化酯能夠與胺官能團反應(yīng)。用某些其他氨基酸替換hedgehog的N-端胱氨酸時，也可使用其他化學(xué)方法，以在N-端上添加疏水性基團。一個例子是在N-端添加絲氨酸或蘇氨酸，氧化該氨基酸形成醛，然后在蛋白上連接包含1，2氨基硫醇結(jié)構(gòu)(如胱氨酸)的化學(xué)基團。第二個例子是在N-端添加組氨酸，以偶聯(lián)至C-端的硫代羧酸。其他氨基酸的化學(xué)改性對于改性許多其他氨基酸有具體的化學(xué)方法。因此，用于合成活性更高形式之hedgehog的其他途徑是可化學(xué)性地將疏水性基團連接在hedgehog中除N-端胱氨酸以外的氨基酸上。如果在所希望的位置處沒有合適的氨基酸，可使用位點針對性的誘變，以在hedgehog結(jié)構(gòu)的該位點處添加反應(yīng)性氨基酸，而無論在N-端或C-端或其他位置處。反應(yīng)性氨基酸包括胱氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、精氨酸、蛋氨酸、和色氨酸。因此，增加hedgehog的疏水性的目的可通過許多化學(xué)方法來實現(xiàn)，而且我們不希望用具體的化學(xué)或者改性位點來限制，這是因為我們的結(jié)果支持該方法的通用性。可用多種方法將hedgehog多肽連接在疏水性基團上，包括化學(xué)偶聯(lián)法或基因工程法。為說明起見，有大量的化學(xué)交聯(lián)劑對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。對于本發(fā)明，優(yōu)選的交聯(lián)劑是雜雙官能交聯(lián)劑，其可用于分步連接hedgehog多肽和疏水性基團。雜雙官能交聯(lián)劑對于結(jié)合蛋白具有設(shè)計更特異性偶聯(lián)方法的能力，并由此降低發(fā)生非所希望的副反應(yīng)如均蛋白聚合物的可能性。在本領(lǐng)域中已知有許多的雜雙官能交聯(lián)劑。它們包括琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)、m-馬來酰亞胺基苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙?；?氨基苯甲酸酯(SIAB)、琥珀酰亞胺基4-(對馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(SMPT)、N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞胺基6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酸]己酸酯(LC-SPDP)。那些具有N-羥基琥珀酰亞胺基團的交聯(lián)劑可以N-羥基磺基琥珀酰亞胺類似物來得到，該類似物通常具有更大的水溶解度。另外，那些在連接鏈中具有二硫橋的交聯(lián)劑可以烷基衍生物的形式來合成，以降低體內(nèi)連接劑的斷裂量。除雜雙官能交聯(lián)劑外，還有許多其他交聯(lián)劑，包括同雙官能和光反應(yīng)性交聯(lián)劑。在本發(fā)明中，二琥珀酰亞胺基辛二酸酯(DSS)、雙馬來酰亞胺基己烷(BMH)、和二甲基庚二酰胺酸酯·2HCl(DMP)是有用的同雙官能交聯(lián)劑的例子，而二-[β-(4-疊氮基水楊酸酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)和N-琥珀酰亞胺基-6-(4＇-疊氮基-2＇-?；交?氨基)己酸酯(SANPAH)是有用的光反應(yīng)性交聯(lián)劑的例子。對于最近的蛋白偶聯(lián)技術(shù)的綜述，可參見Means等人(1990)BioconjugateChemistry12-12，其在此并入作為參考。一類特別有用的雜雙官能交聯(lián)劑，包括上述物質(zhì)，含有伯胺反應(yīng)基團、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、或其水溶性類似物N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)。在堿性pH時，伯胺(賴氨酸ε基團)是未質(zhì)子化的，而且可通過親核攻擊NHS或磺基-NHS酯來反應(yīng)。該反應(yīng)導(dǎo)致酰胺鍵的形成，而且以副產(chǎn)物的形式釋放NHS或磺基-NHS。作為雜雙官能交聯(lián)劑一部分的其他反應(yīng)性基團是硫醇反應(yīng)性基團。通常的硫醇反應(yīng)性基團包括馬來酰亞胺、鹵素、以及吡啶基二硫化物。馬來酰亞胺特異性地在略酸性至中性(pH6．5-7．5)的條件下于幾分鐘內(nèi)與游離的巰基(胱氨酸殘基)反應(yīng)。鹵素(碘乙?；倌軋F)在生理pH條件下與-SH基團反應(yīng)。這些反應(yīng)性基團導(dǎo)致穩(wěn)定硫醚鍵的形成。雜雙官能交聯(lián)劑的第三個組分是間隔臂或橋。該橋是連接兩個反應(yīng)端的結(jié)構(gòu)。橋的最明顯貢獻是其對立體障礙的作用。在某些情況下，較長的橋可更容易跨過連接兩個復(fù)雜雙分子所必須的距離。例如，SMPB具有14．5埃的跨度。使用雜雙官能試劑制備蛋白-蛋白結(jié)合物是涉及胺反應(yīng)和巰基反應(yīng)的兩步驟法。對于第一步驟的胺反應(yīng)，所選擇的蛋白應(yīng)包含伯胺。這可以是存在于大多數(shù)蛋白的N-端上的賴氨酸ε胺或伯α胺。該蛋白不應(yīng)包含游離巰基。如果待結(jié)合的兩個蛋白都包含游離巰基，則可用例如N-乙基馬來酰亞胺改性其中一個蛋白以使所有巰基都被阻斷(見Partis等人(1983)J．Pro．Chem．2263，其在此并入作為參考)?？墒褂肊llman試劑來計算具體蛋白中的巰基量(例如參見Ellman等人(1958)Arch．Biochem．Biophys．74443以及Riddles等人(1979)Anal．Biochem．9475，它們在此并入作為參考)。反應(yīng)緩沖液應(yīng)是無外源胺和巰基的。反應(yīng)緩沖液的pH應(yīng)為7．0-7．5。該pH范圍防止馬來酰亞胺基團與胺反應(yīng)，保護馬來酰亞胺基團與巰基的第二反應(yīng)。包含NHS酯的交聯(lián)劑具有有限的水溶解度。在將交聯(lián)劑引入至反應(yīng)化合物之前，它們應(yīng)溶解在最小量的有機溶劑(DMF或DMSO)中。交聯(lián)劑／溶劑形成乳劑，其使反應(yīng)發(fā)生。磺基-NHS類似物更易溶于水，并可直接添加在反應(yīng)緩沖液中。高離子強度的緩沖液應(yīng)避免，這是因為它們具有使磺基-NHS酯“鹽析”的趨勢。為避免由于水解導(dǎo)致的反應(yīng)性丟失，在溶解蛋白溶液后立即將交聯(lián)劑添加至反應(yīng)混合物中。在濃的蛋白溶液中反應(yīng)是更有效的。反應(yīng)混合物的pH越趨于堿性，則反應(yīng)速率越快。NHS和磺基-NHS酯的水解速率也隨pH增加而增加。更高的溫度將增加水解和?；姆磻?yīng)速率。一旦反應(yīng)完成，立即用巰基反應(yīng)基團活化第一個蛋白。經(jīng)活化的蛋白可通過簡單的凝膠過濾或透析由反應(yīng)混合物中分離。為實施交聯(lián)的第二步，即、巰基反應(yīng)，所選用于與馬來酰亞胺、活化鹵素或吡啶基二硫化物反應(yīng)的親脂性基團必須包含游離巰基。或者，可通過添加巰基來改性伯胺。在所有情況下，緩沖液應(yīng)脫氣，以防止巰基被氧化?？商砑覧DTA以螯合任何存在于緩沖液中的氧化性金屬。緩沖液應(yīng)不含任何包含巰基的化合物。在略酸性-中性pH范圍(pH6．5-7．5)馬來酰亞胺特異性地與-SH基團反應(yīng)。中性pH對于涉及鹵素和吡啶二硫化物的反應(yīng)是足夠的。在此條件下，馬來酰亞胺通常在幾分鐘內(nèi)與-SH基團反應(yīng)。對于鹵素和吡啶基二硫化物則需要更長的反應(yīng)時間。在胺反應(yīng)步驟中制得的第一巰基反應(yīng)性蛋白與包含巰基的親脂性基團在合適的緩沖條件下混合。結(jié)合物用諸如凝膠過濾或透析等的方法從反應(yīng)混合物中分離。對于結(jié)合反應(yīng)，示例性的活化親脂性基團包括N-(1-芘)馬來酰亞胺、2，5-二甲氧基芪-4＇-馬來酰亞胺、曙紅-5-馬來酰亞胺、熒光素-5-馬來酰亞胺、N-(4-(6-二甲基氨基-2-苯并呋喃基)苯基)馬來酰亞胺、苯酮-4-馬來酰亞胺、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4＇-馬來酰亞胺(DABMI)、四甲基羅丹明-5-馬來酰亞胺、四甲基羅丹明-6-馬來酰亞胺、羅丹明紅TMC2馬來酰亞胺、N-(5-氨基戊基)馬來酰亞胺三氟乙酸鹽、N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺三氟乙酸鹽、Oregon綠TM488馬來酰亞胺、N-(2-((2-(((4-疊氮基-2，3，5，6-四氟)苯甲?；?氨基)乙基)二硫基)乙基)馬來酰亞胺(TFPAM-SSl)、2-(1-(3-二甲基氨基丙基)-吲哚-3-基)-3-(吲哚-3-基)馬來酰亞胺(二吲哚基馬來酰亞胺；GF109203X)、BODIPY_FLN-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺、N-(7二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)馬來酰亞胺(DACM)、AlexaTM488C5馬來酰亞胺、AlexaTM594C5馬來酰亞胺鈉鹽、N-(1-芘)馬來酰亞胺、2，5-二甲氧基芪-4′-馬來酰亞胺、曙紅-5-馬來酰亞胺、熒光素-5-馬來酰亞胺、N-(4-(6-二甲基氨基-2-苯并呋喃基)苯基)馬來酰亞胺、苯酮-4-馬來酰亞胺、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4＇-馬來酰亞胺、1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)惡唑-2-基)甲磺酸吡啶翁、四甲基羅丹明-5-馬來酰亞胺、四甲基羅丹明-6-馬來酰亞胺、羅丹明紅TMC2馬來酰亞胺、N-(5-氨基戊基)馬來酰亞胺、N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺、N-(2-((2-(((4-疊氮基-2，3，5，6-四氟)苯甲?；?氨基)乙基)二硫基)乙基)馬來酰亞胺、2-(1-(3-二甲基氨基丙基)-吲哚-3-基)-3-(吲哚-3-基)馬來酰亞胺、N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)馬來酰亞胺(DACM)、11H-苯并[a]芴、苯并[a]芘。在一個實施方案中，hedgehog多肽可使用芘馬來酰亞胺來衍生化，后者可從MolecularProbes(Eugene，Oreg．)購得，例如N-(1-芘)馬來酰亞胺或1-芘甲基碘乙酸酯(PMIA酯)。如圖1所示，芘衍生的hedgehog蛋白的活性曲線表明，其活性比未經(jīng)改性蛋白的活性高2個數(shù)量級。B、制備疏水性肽衍生物根據(jù)本發(fā)明，也可使用疏水性肽來改性蛋白。在此所用術(shù)語“肽”包括至少一個氨基酸殘基的序列。優(yōu)選的是，肽的長度在1個氨基酸和18-26個氨基酸之間，后者是蛋白的膜跨越片段的典型長度。為增加蛋白的疏水性，氨基酸主要從以下疏水性氨基酸中選擇苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、色氨酸、丙氨酸、脯氨酸、和酪氨酸。疏水性肽也可包含具有疏水性特征或D-氨基酸、類肽鍵、N-端乙?；蚪档碗囊妆幻附獾钠渌卣鞯姆翘烊话被犷愃莆铩Ｔ诘鞍椎木唧w位點處替換非天然氨基酸的方法是已知的(78、79)。通常情況下，疏水性肽懸掛在蛋白的各種位點上。一個位點可以是N-端殘基。或者，疏水性肽在N-端殘基處被替換。在另一個實施方案中，疏水性肽懸掛在蛋白的C-端?；蛘撸杷噪脑贑-端殘基處被替換。C-端可以是天然的C-端氨基酸，但也可以是經(jīng)剪切的蛋白的C-端，以將疏水性肽懸掛在經(jīng)剪切的蛋白的最終C-端氨基酸上，其也被稱為“C-端”。經(jīng)剪切的hedgehog蛋白在天然C-端序列中有最多11個氨基酸缺失時仍可保留活性。疏水性肽也可插在N-端殘基和緊鄰N-端殘基的內(nèi)部殘基之間，或者在C-端殘基和緊鄰C-端殘基的內(nèi)部殘基之間，或者在兩個內(nèi)部殘基之間。在某個實施方案中，親脂性基團是兩親性多肽，如爪蟾抗菌肽、殺菌肽、attacin、馬耳他素、短桿菌肽S、Staph．Aureus的α-毒素、丙甲甘肽或者合成的兩親性多肽。病毒顆粒的融合包衣蛋白也可以是本發(fā)明hedgehog蛋白的兩親性序列的常規(guī)來源。C、制備脂質(zhì)衍生物本發(fā)明所包括的另一種形式的蛋白是用各種脂質(zhì)基團衍生的蛋白。通常情況下，“脂質(zhì)”是不同來源的疏水性物質(zhì)的一員，這些物質(zhì)的特征是在有機溶劑中有各種溶解度，但在水中大部分都是不溶性的。本發(fā)明包括的主要脂質(zhì)類別是脂肪酸和固醇(如膽固醇)。本發(fā)明的衍生蛋白包含環(huán)狀、非環(huán)狀(如直鏈的)、飽和或不飽和的、單羧酸的脂肪酸。示例性的飽和脂肪酸具有以下通式CH3(CH2)nCOOH。下表列出了可使用常規(guī)化學(xué)方法來衍生化的一些脂肪酸的例子。表2示例性飽和及不飽和脂肪酸飽和脂肪酸CH3(CH2)nCOOH不飽和脂肪酸<tablesid="table2"num="002"><table>CH3CH=CHCOOH巴豆酸CH3(CH2)3CH=CH(CH2)7COOH肉豆蔻油酸*CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH棕櫚油酸*CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH油酸*CH3(CH2)3(CH2CH=CH)2(CH2)7COOH亞油酸CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7COOH亞麻酸CH3(CH2)3(CH2CH=CH)4(CH2)3COOH花生四烯酸</table></tables>星號(*)表示我們在由可溶性結(jié)構(gòu)分泌的重組hedgehog蛋白中發(fā)現(xiàn)的脂肪酸?？蛇B接在蛋白上的其他脂質(zhì)包括支鏈脂肪酸以及磷脂基的脂肪酸，如磷脂酰肌醇(如磷脂酰肌醇4-單磷酸酯和磷脂酰肌醇4，5-二磷酸酯)、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、和類異戊二烯如法尼基或香葉基。我們已經(jīng)證實，脂質(zhì)改性的hedgehog蛋白可由天然物質(zhì)進一步純制，或者可通過化學(xué)改性可溶性且未經(jīng)改性的蛋白得到。對于從天然物質(zhì)中純制得到的蛋白，我們表明如果在昆蟲細胞中表達全長的人Sonichedgehog(Shh)并組合使用SP-Sepharose色譜和免疫親和色譜法從經(jīng)洗滌劑處理的細胞中純制膜結(jié)合的Shh，則經(jīng)純制的蛋白在還原SDS-PAGE凝膠上以一條明顯的帶移動，其表觀質(zhì)量為20kDa(見實施例1)。用反相HPLC可容易地辨別可溶性的、膜結(jié)合的Shh蛋白，而結(jié)合形式卻隨后在乙腈梯度中洗脫出來(見實施例1和圖3)。我們還表明，人Sonichedgehog以兩種形式結(jié)合在細胞膜上，一種形式包含膽固醇，并因而類似于以前對Drosophilahedgehog(18)報道的數(shù)據(jù)，而第二種新的形式包含膽固醇和棕櫚酸改性基團?？扇芮医Y(jié)合形式的Shh用電子噴射質(zhì)譜進行分析，其中使用三聯(lián)四極質(zhì)譜儀，并裝配有電子噴射離子源(實施例1)，還可用液體色譜-質(zhì)譜進行分析(見實施例1)。由內(nèi)切蛋白酶Lys-C消化的結(jié)合Shh中鑒別N-端肽可用MALDIPSD質(zhì)譜測量飛行質(zhì)譜儀的MALDI時間來證實。棕櫚?；奈稽c通過肽作圖和序列分析的組合法來鑒別，而且是在蛋白的N-端(SEQIDNOS1-4中成熟蛋白序列的殘基1)。兩種結(jié)合形式在C3H10T1／2堿性磷酸酯酶實驗中的活性是相同的，但令人感興趣的是，都比缺乏結(jié)合基團的可溶性人Shh的效力高約30倍。脂質(zhì)改性對Shh與其受體patched的表觀結(jié)合親和性沒有顯著的影響(圖7)。我們接下來通過在C3H10T1／2細胞上分析可溶性且結(jié)合的Shh單獨或者在有抗hedgehog中和Mab5E1存在時的堿性磷酸酯酶誘導(dǎo)作用檢驗了衍生形式的實用性。另外，在patched轉(zhuǎn)染的EBNA-293細胞上用FACS分析評估了可溶性且結(jié)合的Shh對結(jié)合patched的相對效力(實施例3)。對于通過化學(xué)改性可溶的且未經(jīng)改性的蛋白而得到的脂質(zhì)改性蛋白，我們已表明，棕櫚酸和其他脂質(zhì)可添加在可溶性Shh上以產(chǎn)生經(jīng)脂質(zhì)改性形式，其在C3H10T1／2實驗中具有更強的效力(實施例8)。我們已經(jīng)表明(實施例1、2和8)，N-端胱氨酸上的硫醇和α-胺有助于脂質(zhì)衍生化反應(yīng)。不希望囿于任何具體的理論，蛋白上的脂質(zhì)改性以形成硫酯中間體開始，脂質(zhì)基團然后通過形成環(huán)形中間體轉(zhuǎn)移至N-端的α-胺上。通常情況下，反應(yīng)性脂質(zhì)基團因此可為飽和或不飽和羧酸的硫酯形式如輔酶A硫酯。此等物質(zhì)以及它們的衍生物可包括例如市售的輔酶A衍生物，如棕櫚酰油酰輔酶A、二十烷酰輔酶A、二十碳四烯酰輔酶A、月桂酰輔酶A等。這些物質(zhì)可容易地由SigmaChemicalCompany(St．Louis，MO．，1998catalogpp．303-306)得到。已分析了不同的脂質(zhì)基團對hedgehog蛋白的功能活性的影響(見實施例8以及圖10和11)。類似地，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可方便地測試不同的脂質(zhì)基團對如上述部分Ⅲ中所述的其他蛋白的功能活性的影響。例如，使用本領(lǐng)域已知的方法已完成了根據(jù)本發(fā)明進行脂質(zhì)改性的凝溶膠蛋白(50)、各種干擾素(干擾素-α、干擾素-β和干擾素-γ)、各種自介素(如IL-1、-2、-3、-4、等等)、腫瘤壞死因子-α和-β、以及其他生長因子的功能測試。雖然我們已確立了可將脂肪酸連接在hedgehog蛋白的N-端胱氨酸上的化學(xué)方法，但仍可預(yù)期脂質(zhì)可使用酶促反應(yīng)連接在相同或其他位點上。蛋白的體內(nèi)棕櫚?；怯梢活惙Q為棕櫚酰輔酶A蛋白S-棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的酶來催化的。使用經(jīng)純化的酶時，蛋白底物的體外?；驯蛔C實(80、81)。棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的底物特異性尚未被徹底定義；細胞和病毒蛋白的棕櫚酰化位點的分析在包圍經(jīng)改性的胱氨酸殘基的共有序列中幾乎沒有，但是表明在胱氨酸的兩個氨基酸內(nèi)共同存在賴氨酸或精氨酸殘基以及接近胱氨酸的大且疏水性氨基酸。Shh的氨基端序列CGPGRGFG可與該共有序列相匹配，并用作棕櫚酰化的識別位點。作為一個替代方案，hedgehog蛋白氨基端的肉豆蔻酰化可使用N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶(NMT)來進行，該酶的許多種已在哺乳動物(82)和酵母(83)中被表征。N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶的識別位點可引入hedgehogN-端序列中，以有利于酶的識別。這些策略需要使用脂肪?；?輔酶A衍生物作為底物，如同在實施例8中所述用于人Sonichedgehog的非酶促脂肪?；?。另外，具有經(jīng)引入的識別序列的蛋白可在合適的細胞系中表達時進行肉豆蔻?；?。用疏水性基團改性蛋白如hedgehog的其他方法是增加識別位點，以在蛋白的C-端添加類異戊二烯基團。法尼基和香葉基-香葉基添加的識別位點是已知的，而且蛋白可在真核細胞中表達時進行改性(Gelb等人，Cur．Opin．Chem．Biol．240-48(1998))。Ⅵ、多聚蛋白復(fù)合物在此所述的疏水性改性的蛋白特別適合于被制成多聚蛋白復(fù)合物。本發(fā)明的多聚蛋白復(fù)合物包括任選通過它們的疏水性基團(如脂質(zhì))連接在小泡上的蛋白。小泡可以是天然形成的生物膜、由天然物質(zhì)純制得到的，或者小泡是合成的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的小泡是基本上由兩親性物質(zhì)如表面活性劑或磷脂制成的球形結(jié)構(gòu)。這些球形小泡的脂質(zhì)通常組織成具有一個或更多個結(jié)構(gòu)層的脂質(zhì)形式，如多層小泡(多個洋蔥形殼的脂質(zhì)雙層，其中在雙層之間包含水性體積)或微團。具體而言，脂質(zhì)體是基本上由各種類型的脂質(zhì)、磷脂、以及輔助性的親脂性成分組成的小的球形小泡。這些成分通常排列成雙層形式，類似于生物膜的脂質(zhì)排列。典型情況下，成分脂質(zhì)或類脂分子的極性端與包圍溶液相接觸，通常為水溶液，而脂質(zhì)或類脂分子的非極性疏水性端與其他脂質(zhì)或類脂分子的非極性疏水性端相接觸。所形成的雙層膜(如小泡)可選擇性地透過具有某些尺寸、疏水性、形狀和凈電荷的分子。大多數(shù)的小泡的性質(zhì)是脂質(zhì)或類脂的，但也存在其他脂質(zhì)體雙層結(jié)構(gòu)，包括表面活性劑以及脂質(zhì)或膽固醇。脂質(zhì)體小泡是特別優(yōu)選的，這是因為它們可用于許多治療、診斷、工業(yè)和商業(yè)領(lǐng)域。它們可用于轉(zhuǎn)運不易溶于水的分子或者是需要定時釋放時。因為它們可選擇性地透過許多化學(xué)化合物，脂質(zhì)體作為藥物載體或生物材料是非常有用的。因此，脂質(zhì)衍生的蛋白如hedgehog可通過摻入在脂質(zhì)體小泡的脂質(zhì)雙層中而被制成多聚體。到達目標(biāo)部位時，脂質(zhì)體可降解(例如通過胃腸道中的酶)或者它們可與細胞的膜融合。已知有幾種制備小泡如脂質(zhì)體的方法。制造磷脂小泡的方法是眾所周知的(53)。對于常規(guī)使用方法的綜述可參見(54)。更常規(guī)使用的方法是(1)超聲處理包含脂質(zhì)的溶液，有時然后進行蒸發(fā)／凍干和再水化(見例如Stryer，Biochemistry，第290-291頁，F(xiàn)reeman&amp;Co．，NewYork，(1988)，以及(55))；(2)均化脂質(zhì)溶液，有時在高壓或高剪切力下(見例如1988年5月10日頒發(fā)的第4，743，449號美國專利以及1988年6月28日頒發(fā)的第4，753，788號美國專利)；(3)水化以及有時超聲處理小泡形成脂質(zhì)的干燥膜，其中脂質(zhì)膜是通過蒸發(fā)溶解在有機溶劑中的脂質(zhì)溶液而制成的(見例如1984年6月5日頒發(fā)的第4，452，747號美國專利、1990年1月23日頒發(fā)的第4，895，719號美國專利、以及1990年8月7日頒發(fā)的第4，946，787號美國專利)；(4)凍干或蒸發(fā)和再水化(見例如1990年1月30日頒發(fā)的第4，897，355號美國專利、1988年11月5日公布的EP267，050、1988年10月11日頒發(fā)的第4，776，991號美國專利、1986年2月19日公布的EP172，007、以及1986年4月24日公布的第AU-A-48713／85號澳大利亞專利申請)；(5)溶劑注射或灌注脂質(zhì)溶液于水性介質(zhì)中或者相反進行(見例如(56)、1990年5月1日頒發(fā)的第4，921，757號美國專利、1988年11月1日頒發(fā)的第4，781，871號美國專利、1988年3月24日公布的WO87／02396、以及1990年1月23日頒發(fā)的第4，895，452號美國專利)；(6)噴霧干燥(見例如1986年4月24日公布的第AU-A-48713／85號澳大利亞專利申請、以及1989年5月16日頒發(fā)的第4，830，858號美國專利)；(7)過濾(見例如WO85／01161)；(8)反相蒸發(fā)(例如見(57))；以及(9)上述方法的組合(見例如(58)和(59))。在用于制備小泡時，優(yōu)選的脂質(zhì)或類脂成分包括磷脂，磷脂、堿性脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、脂肪酸以及它們的衍生物的混合物。優(yōu)選的脂質(zhì)具有以下特征當(dāng)單獨分散于水中時，在超過脂質(zhì)轉(zhuǎn)化溫度以上的溫度時，它們?yōu)橹|(zhì)乳劑相。在某些實施方案中，脂質(zhì)是超過約12個碳原子的單脂肪鏈，并可以是飽和或不飽和的、或者經(jīng)取代的。合適的脂質(zhì)包括以下脂肪酸的酯、醇和酸形式硬脂酸、油酸、亞油酸、花生酸、花生四烯酸、以及其他單鏈脂肪酸。另外的候選者是視黃醇類物質(zhì)、特別是視黃醇和視黃酸的酯、醇、和酸形式。其他優(yōu)選的脂質(zhì)包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰甘油(PG)以及它們的衍生物，它們可由各種天然物質(zhì)合成產(chǎn)生或衍生。在某些實施方案中，小泡可立體地通常摻入聚乙二醇(PEG)或通過合成磷脂(結(jié)合在二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，見例如(61))上的PEG頭部基團來穩(wěn)定。優(yōu)選的表面活性劑是具有良好混溶性者，如TweenTM、TritonTM。十二烷基硫酸鈉(SDS)、月桂硫酸鈉或辛基糖苷鈉。當(dāng)在表面活性劑的相轉(zhuǎn)化溫度以上時添加至水溶液，優(yōu)選的表面活性劑形成微團。該表面活性劑可由一或多個脂肪鏈構(gòu)成。這些脂肪鏈可以是飽和、不飽和、或者以其他方式取代的如乙氧基化的，典型的脂肪鏈包含大于約12個碳原子。其他合適的表面活性劑包括以下者月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-、或硬脂基-磺基甜菜堿；月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-、或硬脂基-肌氨酸；亞油基-、肉豆蔻基-、或鯨蠟基-甜菜堿；月桂酰胺基丙基-、柯卡酰胺基丙基-、亞油酰胺基丙基-、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕櫚酰胺基丙基-、或異硬脂酰胺基丙基-甜菜堿(如月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺基丙基-、棕櫚酰胺基丙基-、或異硬脂酰胺基丙基-二甲基胺；甲基可可?；蚣谆突??；撬徕c；以及MONAQUAT系列(MonaIndustries，Inc．，Paterson，N．J．)。見實施例4。適合用于制備多聚蛋白復(fù)合物的優(yōu)選固醇和固醇酯包括膽固醇、膽甾烷醇、膽固醇硫酸酯、以及其他的膽固醇類似物和衍生物。小泡可包括許多不同的脂質(zhì)和洗滌劑的事實允許在工程化具有所希望的性質(zhì)的結(jié)合蛋白-小泡復(fù)合物時有很大的可變性。例如，人們可制造通過改變起始物中脂質(zhì)的組成而結(jié)合不同種類的蛋白的小泡，以產(chǎn)生更大的小泡，或者通過增加小泡中磷脂酰肌醇脂質(zhì)的百分數(shù)。Ⅶ、實用性通常情況下，在此所述的改性蛋白可用于治療可用未經(jīng)改性的蛋白來治療的一些病癥。但是，在此所述經(jīng)疏水性改性的蛋白與未經(jīng)改性的形式相比具有幾個顯著的改進。首先，它們效力的增加使得可用更小量的蛋白在更短的時間來治療。這對于全身和CNS應(yīng)用都是非常重要的。第二，用化學(xué)反應(yīng)性更低的氨基酸替換N-端胱氨酸將使臨床應(yīng)用的蛋白更易于制造、配制和儲存。第三，蛋白的藥代動力學(xué)將通過疏水性改性而改變，而這將使蛋白局限于給藥部位的附近，由此通過使全身接觸最小化增加了安全性，而且通過增加局部濃度增加了其效力。本發(fā)明的蛋白還可用于檢測其相應(yīng)受體的診斷組合物和方法中。作為第一點的一個實施例，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在全身應(yīng)用后hedgehog的半衰期非常短，而且需要多次注射以達到對蛋白的強烈反應(yīng)。改性形式的更高效力以及在脂質(zhì)體中配制成制劑的可能性都使得用更少的治療即可實現(xiàn)反應(yīng)。對于CNS應(yīng)用，更高的效力能夠以小的體積提供直接注射于CNS中所必須的足量蛋白。第二點的重要性是用以下事實說明的我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)hedgehog的N-端胱氨酸非常易受化學(xué)攻擊，或者形成其他化學(xué)加合物或者與其他hedgehog蛋白發(fā)生氧化性二聚反應(yīng)。為防止這一點，在純制期間需要特殊的緩沖液和程序，而且在最終制劑中需要使用二硫蘇糖醇。這些措施使得必須在底物模型中仔細評估制劑緩沖液的作用。作為第三點的一個實施例，蛋白從給藥部位向外擴散的范圍越有限，則局部濃度越高。該更高的局部濃度因此可在治療神經(jīng)疾病期間在直接注射于所希望的腦或脊柱區(qū)域后產(chǎn)生更特異性的臨床反應(yīng)。類似地，經(jīng)改性的蛋白可局部給藥于骨折部位以幫助骨折的愈合，給藥于生殖腺以治療生育性疾病，眼內(nèi)給藥以治療眼疾病，以及在皮下給藥以治療皮膚病癥和刺激局部毛發(fā)生長。疏水性改性的蛋白局限于給藥部位因此降低了非所希望的與其他組織和器官全身接觸的可能性。對于治療應(yīng)用，本發(fā)明的疏水性改性的蛋白放入在藥物學(xué)上可接受的無菌等滲制劑中，并可任選地通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法給藥。制劑優(yōu)選為液體劑型，或者可以是凍干粉末?？梢韵胂蟮氖牵嗑鄣鞍讖?fù)合物的治療性給藥可包括摻入在此所述之衍生化的蛋白的脂質(zhì)體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解到，本發(fā)明之經(jīng)疏水性改性的蛋白的具體給藥、劑量、以及臨床應(yīng)用將取決于具體的蛋白及其生物活性而變化。作為本發(fā)明蛋白在治療方面的一個應(yīng)用實施例，治療性的疏水性改性的hedgehog蛋白可給藥于患有各種神經(jīng)病癥的患者。hedgehog蛋白調(diào)節(jié)神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期間以及假設(shè)在成人時的分化的能力表明，有理由相信疏水性改性的hedgehog有利于控制成人神經(jīng)元的維持、功能性能、以及正常細胞的老化；損傷細胞的修復(fù)和再生；以及預(yù)防由于某些病理病癥中分化的缺失而導(dǎo)致的變性和早熟死亡。因此，本發(fā)明的疏水性改性的hedgehog組合物通過用局部灌注進行治療可預(yù)防和／或減少由以下情況導(dǎo)致的神經(jīng)疾病(ⅰ)神經(jīng)系統(tǒng)的的急性、亞急性或慢性損傷，包括外傷、化學(xué)損傷、血管損傷、和缺乏(如中風(fēng)導(dǎo)致的缺血)、以及感染和腫瘤誘導(dǎo)的損傷；(ⅱ)神經(jīng)系統(tǒng)的老化，包括阿耳茨海默氏??；(ⅲ)神經(jīng)系統(tǒng)的慢性神經(jīng)變性疾病，包括帕金森氏病、亨廷頓病、肌萎縮性側(cè)索硬化等；以及(ⅳ)神經(jīng)系統(tǒng)的免疫疾病，包括多發(fā)性硬化。疏水性改性的蛋白也可注射于腦髓液中，例如針對腦細胞的缺乏，或者例如針對其他組織或器官系統(tǒng)特異性疾病所需要的注射在淋巴系統(tǒng)或血液中。本發(fā)明的hedgehog組合物可用于解救例如各種神經(jīng)元免受損傷誘導(dǎo)的死亡以及在此等損傷后引導(dǎo)這些神經(jīng)元再生。所述損傷可歸因于以下情況(但不僅限于此)CNS創(chuàng)傷性梗塞、感染、代謝性疾病、營養(yǎng)缺乏、以及毒性藥物(例如順鉑治療)。某些hedgehog蛋白可導(dǎo)致新生或增生變形的細胞，成為分裂期后或凋亡。因此，此等組合物可用于治療例如惡性瘤、成神經(jīng)管細胞瘤和神經(jīng)外胚層腫瘤。蛋白可連接在可檢測標(biāo)記物上，如熒光或放射性不透明物質(zhì)，以及給藥于宿主以發(fā)現(xiàn)可表達hedgehog受體的組織。該蛋白還可結(jié)合在諸如辣根過氧化物酶的物質(zhì)上，該物質(zhì)可用作免疫細胞化學(xué)染料，以便肉眼觀察組織部分上hedgehog配體-陽性細胞的面積。本發(fā)明之疏水性改性的蛋白可單獨或者以多價蛋白復(fù)合物的形式使用，用于特異性針對表達該蛋白之受體的癌癥和腫瘤的醫(yī)療治療。此等物質(zhì)可通過使用它們作為抗腫瘤藥物、毒素、以及細胞毒性的放射性核素如釔90的轉(zhuǎn)運載體而使其作為更有效的癌癥治療劑。毒素也可結(jié)合在疏水性改性的hedgehog(或者包含其多價復(fù)合物的小泡)上，以選擇性靶向和殺死hedgehog反應(yīng)性細胞，如表達hedgehog受體的腫瘤。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的，其他毒素也同樣是有用的。此等毒素包括但不限于Pseudomonas外毒素、Diphtheria毒素和皂草素。該方法已被證明是成功的，因為在數(shù)量非常有限的組織中表達hedgehog受體。用于此等治療的其他方法是使用放射性同位素標(biāo)記的經(jīng)疏水性改性的蛋白(或其多價復(fù)合物)。此等經(jīng)放射性標(biāo)記的化合物將優(yōu)選靶向表達蛋白受體、稀疏正常組織的細胞中的放射活性部位。取決于所用的放射性同位素，由結(jié)合在腫瘤細胞上的放射性標(biāo)記的蛋白發(fā)出的射線也可殺死附近不表達蛋白受體的惡性腫瘤細胞?？墒褂酶鞣N放射性核素。放射性碘(例如131I)已成功地用于針對B細胞淋巴瘤上存在的CD20的單克隆抗體(63)。治療中所用的蛋白組合物可根據(jù)醫(yī)療實踐考慮待治療的疾病、單獨病人的病癥、給藥分離多肽的部位、給藥方法、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他因素配制成各種制劑和劑量?？赏ㄟ^混合所希望純度的蛋白、含蛋白的小泡或者衍生化的復(fù)合物與生理上可接受的載體(如在所用劑量和濃度時對接受者無毒性的載體)來制備治療劑。可以想象到，向部位局部給藥是治療性給藥本發(fā)明蛋白的主要途徑。靜脈給藥或通過插管或其他手術(shù)管給藥也是可以想象到的。其他的途徑包括片劑等、用于液體制劑的市售噴霧劑、以及吸入凍干或氣霧化制劑。在由粉末制劑復(fù)原后可以使用液體制劑。給藥劑量取決于所用小泡和蛋白的性質(zhì)，如結(jié)合活性和體內(nèi)半衰期、制劑中小泡和蛋白的濃度、給藥途徑、給藥部位和速率、患者的臨床耐受性、患者面臨的病理疾病、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他因素。通常情況下，優(yōu)選每次給藥的劑量為每個患者約5×10-7至5×10-9M，但該劑量取決于蛋白的性質(zhì)。在一系列連續(xù)的給藥期間可使用不同的劑量。本發(fā)明還涉及一種藥物制劑，其包括根據(jù)本發(fā)明改性的hedgehog蛋白和藥物學(xué)上可接受的載體。在一個實施方案中，該制劑也可包括小泡。本發(fā)明之經(jīng)疏水性改性的hedgehog蛋白也可用于基因治療方法中。對于神經(jīng)變性疾病，已知有幾個動物模型具有臨床預(yù)測價值。對于帕金森氏病，模型涉及嚙齒動物或靈長類動物中的保護或復(fù)原，在該模型中通過全身給藥MPTP或局部(顱內(nèi))給藥6-羥基多巴胺(6-OHDA)(它們是兩種選擇性的多巴胺能毒素)損壞黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能通道。具體的模型是MPTP處理的鼠模型(64)；MPTP處理的靈長類動物(marmoset或Rhesus)模型(65)；以及單側(cè)6-OHDA損傷鼠模型(66)。對于ALS(肌萎縮性側(cè)索硬化)，模型涉及幾個鼠系的治療，這些鼠系表現(xiàn)出自發(fā)的運動神經(jīng)元變性，包括wobbler(67)和pmn鼠(68)，還涉及表達人突變超氧化物酶歧化酶(hSOD)基因的轉(zhuǎn)基因鼠的治療，所述基因已連接在家族性ALS上(69)。對于脊髓損傷，最常見的模型涉及鼠的挫傷性損傷，通過標(biāo)準(zhǔn)的體重下降或者流體(水動力)損傷(70)。對于亨廷頓病，模型涉及保護鼠紋狀體免受興奮毒素(NMDA、喹啉酸、紅藻氨酸、3-硝基-丙酸、APMA)損傷(71、72)。近來，還有人描述了超表達人三核苷酸的轉(zhuǎn)基因鼠模型，所述三核苷酸重復(fù)地在huntingtin基因中展開(73)。對于多發(fā)性硬化，小鼠和大鼠中的EAE通過用MBP(髓鞘堿性蛋白)的免疫或者通過用MBP活化的T細胞被動轉(zhuǎn)移來誘導(dǎo)(74)。對于阿耳茨海默氏病，相關(guān)的鼠模型是對鼠中傘-穹損傷(中隔損傷)的保護的測定，供應(yīng)海馬膽堿能神經(jīng)支配的主神經(jīng)束(75)以及超表達人β-淀粉基因的轉(zhuǎn)基因鼠的使用。對于周圍神經(jīng)疾病，相關(guān)的模型是保護小鼠和大鼠中周圍神經(jīng)傳導(dǎo)率的丟失，該丟失是化學(xué)治療劑如紫杉醇、長春新堿和順鉑導(dǎo)致的(76)?，F(xiàn)參考以下非限制性的實施例來更具體地描述本發(fā)明。實施例1當(dāng)在昆蟲細胞中表達時對人Sonichedgehog進行脂質(zhì)改性A、人Sonichedgehog的表達全長人Sonichedgehog(Shh)的cDNA為亞克隆于pBluescriptSK+(20)(Ontogeny，Inc．，CambridgeMA的DavidBumcrot贈送)中的1．6kbEcoRI片段。根據(jù)制造商的推薦方案使用Pharmacia試劑盒通過獨特的位點消除誘變添加5＇和3＇NotI位點，該位點緊鄰Shh開放閱讀框的側(cè)面。然后將攜帶全長ShhcDNA的1．4kbNotI片段亞克隆于昆蟲表達載體pFastBac(LifeTechnologies，Inc．)中。使用LifeTechnologies，Inc．提供的程序產(chǎn)生重組桿狀病毒。所得病毒用于產(chǎn)生高效價的病毒原料液。制備和純制Shh的方法如以下所述。膜伴隨Shh的存在是用FACS和Western印跡分析來檢查。峰值表達出現(xiàn)在感染后的48小時。對于Western印跡分析，由Shh感染或未感染的細胞中得到的上清液和細胞溶解產(chǎn)物在還原條件下在10-20％梯度凝膠上進行SDS-PAGE，電泳轉(zhuǎn)移至硝基纖維素，然后用對抗N-端Shh15多肽-匙孔血藍蛋白結(jié)合物的鼠多克隆抗血清檢測Shh。細胞溶解產(chǎn)物通過在20mMNa2HPO4pH6．5、1％NonidetP-40和150mMNaCl或者20mMTris-HClpH8．0、50mMNaCl、0．5％NonidetP-40和0．5％脫氧膽酸鈉中于25℃下溫育細胞5分鐘來制備，然后在Eppendorf中于13000rpm和4℃下離心10分鐘沉淀顆粒物。B、純制膜結(jié)合的人Sonichedgehog在HighFiveTM昆蟲細胞(Invitrogen)中使用如上所述編碼全長Shh的重組桿狀病毒來制造膜結(jié)合形式的Shh。HighFiveTM細胞在10L控制氧含量的生物反應(yīng)器中于sf900II血清培養(yǎng)基(LifeTechnologies，Inc．)中在28℃下生長。細胞在后對數(shù)期以約2×106細胞／ml在MOI為3時用病毒感染，然后在感染后48小時收集(收集時細胞的存活率大于50％)。離心收集細胞，并在10mMNa2HPO4pH6．5、150mMNaClpH+0．5mMPMSF中洗滌。所得細胞沉淀物(150g濕重)懸浮在1．2L的以下物質(zhì)中10mMNa2HPO4pH6．5、150mMNaCl、0．5mMPMSF、5μM胃蛋白酶抑制劑A、10μg／ml亮抑蛋白酶肽和2μg／mlE64，然后添加120ml的10％TtritionX-100溶液。在冰上孵育30分鐘后，離心(1500×g，10分鐘)除去顆粒物。所有隨后的步驟都在4-6℃下進行。用0．5MMESpH0．5的原料液(50mM最終)將上清液的pH調(diào)節(jié)為5．0，然后裝在150mlSP-SepharoseFastFlow柱(Pharmacia)上。該柱用300ml的5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl、0．5mMPMSF、0．1％NonidetP-40洗滌，然后用200ml的5mMNa2HPO4pH5．5、300mMNaCl、0．1％NonidetP-40洗滌，再用5mMNa2HPO4pH5．5、800mMNaCl、0．1％NonidetP-40洗脫結(jié)合的hedgehog。Shh接下來在5E1-Sepharose樹脂上進行免疫親和色譜，所述樹脂是通過每mlCNBr活化的Sepharose4B樹脂結(jié)合4mg抗體而制成的。SP-Sepharose洗脫池用2體積的50mMHEPESpH7．5稀釋，然后將該物質(zhì)負載于5E1樹脂上(1小時)。將樹脂收集在柱中，用10柱體積的PBS洗滌，該PBS包含0．1％氫化TritionX-100(Calbiochem)，然后用25mMNaH2PO4pH3．0、200mMNaCl、0．1％氫化TritonX-100洗脫。洗脫流分用0．1體積的1MHEPESpH7．5中和，然后由240-340nm處的吸光度測量分析總蛋白含量，以及通過SDS-PAGE分析純度。組分在-70℃下保存。匯集三個親和步驟的峰值組分，用1．3體積的50mMHEPESpH7．5、0．2％氫化TritionX-100稀釋，然后再將該物質(zhì)負載于5E1樹脂上。將樹脂收集在柱中，用3柱體積的PBSpH7．2、1％辛基糖苷(USBiochemicalCorp．)洗滌，然后用25mMNaH2PO4pH3．0、200mMNaCl、1％辛基糖苷洗脫。如上所述中和并分析洗脫組分，匯集、由0．2微米過濾器中過濾、等分，然后儲存在-70℃下。當(dāng)全長人sonichedgehog(Shh)表達在HighFiveTM昆蟲細胞中時，Western印跡檢測到超過95％的N-端片段是細胞結(jié)合形式的。通過SDS-PAGE，經(jīng)純制的蛋白以單個明顯的帶移動，其表觀質(zhì)量為20kDa(圖1，泳道c)。該蛋白比在E．Coli中產(chǎn)生的可溶性蛋白(圖1，泳道b-d)移動快約0．5kDa，這與以前公開的數(shù)據(jù)一致(19)。如所描述的(19)相類似，可溶性且膜結(jié)合的Shh蛋白還可容易地通過反相HPLC來區(qū)別，其中結(jié)合形式在乙腈梯度中較后被洗脫。洗脫膜結(jié)合形式所需的乙腈濃度為60％，而對于可溶形式的僅為45％。這表明蛋白的疏水性顯著增加。C、膜結(jié)合的人Sonichedgehog的質(zhì)譜分析等份的Shh在C4柱(Vydac，Cat．No．214TP104，柱尺寸4．6mm內(nèi)徑×250mm)上于室溫下進行反相HPLC。結(jié)合組分用0-80％梯度的在0．1％三氟乙酸中的乙腈洗脫30分鐘，流速為1．4ml／min。在280nm處監(jiān)測柱洗脫物，并收集0．5分鐘的流分。在SpeedVac濃縮器中干燥25μL等份包含蛋白的流分，溶解在電泳樣品緩沖液中，然后用SDS-PAGE分析。匯集含hedgehog的流分，在SpeedVac濃縮器中濃縮4倍，使用1．33的消光系數(shù)用1mg／ml的Shh溶液通過在280nm處的吸光度分析蛋白含量。樣品在MicromassQuattroII三聯(lián)四極質(zhì)譜儀上進行ESI-MS，該質(zhì)譜儀裝配有電子噴射離子源。直接以10μl／min的流速使用50％水、50％乙腈、0．1％甲酸作為溶劑在注射器泵中將6μl體積的HPLC純制的hedgehog擴散在離子源中。在整個樣品擴散處進行掃描。得到所有電子噴射質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并以文件模式儲存，然后使用MicromassMassLynx數(shù)據(jù)系統(tǒng)進行處理。與MicromassQuattroII三聯(lián)四極質(zhì)譜儀一起通過反相HPLC在線分析由內(nèi)切蛋白酶Lys-C消化吡啶基乙基化的Shh產(chǎn)生的肽。在ReliasilC18柱上用MichromTM超快速微量蛋白分析儀系統(tǒng)分離消化物，其中流速為50μl／min，用5-85％在0．05％三氟乙酸中的乙腈梯度洗脫。在整個范圍中由m／z400-2000進行掃描，并如上所述進行處理。由結(jié)合Shh得到的N-端肽的測序在Voyager-DETMSTR(PerSeptiveBiosystems，F(xiàn)ramingham，MA)飛行時間(TOF)質(zhì)譜分析上通過源后衰變(PostSourceDecay)(PSD)測量來進行，其中使用α-氰基-4-羥基肉桂酸作為基質(zhì)(22，23)。精確地使0．5μl經(jīng)HPLC純制的內(nèi)切蛋白酶Lys-C肽與0．5μl基質(zhì)在靶板上混合。為覆蓋片段離子的整個光譜范圍，在11個步驟中將鏡電壓由20降低至1．2kV?？扇苄郧夷そY(jié)合形式的Shh的電子噴射離子化質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明，原始物質(zhì)的質(zhì)量分別為19560和20167Da(圖2)。19560Da的測量質(zhì)量與以Cys-1起始并以Gly-174結(jié)束的Shh的預(yù)期質(zhì)量(計算質(zhì)量為19560．02Da)相匹配。相反地，20167Da質(zhì)量既不與預(yù)測的一致，而且結(jié)合的與可溶形式質(zhì)量之間的差值607Da也不能用任何已知的改性或酶解過程來解釋。以前，Porter等人(18)證實，Drosophilahedgehog包含膽固醇基團，而且因此人系統(tǒng)中的質(zhì)量差異有可能至少是部分地由于膽固醇(酯化膽固醇的計算質(zhì)量為368．65Da)。19796Da處的結(jié)合Shh質(zhì)譜中存在微小組分，其與主峰差371Da，支持該結(jié)論。對于膽固醇的進一步證據(jù)是通過用中等堿在能夠斷裂膽固醇連接但不破壞肽鍵的條件下處理結(jié)合Shh而得到的(18)，然后通過質(zhì)譜(MS)再分析反應(yīng)產(chǎn)物。簡言之，昆蟲細胞衍生的Shh用50mMKOH、95％甲醇在室溫下處理1小時，然后用ESI-MS分析或者用內(nèi)切蛋白酶Lys-C消化，并在MicromassQuattroII三聯(lián)四極質(zhì)譜儀上進行LC(液體色譜)-MS。對于進行LC-MS的樣品，蛋白首先用4-乙烯基吡啶處理。堿處理使質(zhì)量移動387Da，這與膽固醇加水的丟失相一致(見表3)?？扇苄許hh的質(zhì)量不受堿處理的影響。這些觀察一起提示出，膜結(jié)合的人Shh包含兩個改性，膽固醇和質(zhì)量為236Da的第二個基團。該值與所添加的棕櫚?；鶊F的質(zhì)量(238Da)之間的類似性提示出蛋白可能被棕櫚酰化。如下所述，更精確的質(zhì)量測算表明在0．1Da的棕櫚?；鶊F的預(yù)期質(zhì)量內(nèi)的相關(guān)關(guān)系。表3結(jié)合Shh的MS特征。在部分a中計算質(zhì)量值使用平均殘基質(zhì)量來確定，而在部分b中為單同位素質(zhì)子化質(zhì)量。*在此所述的所有質(zhì)量值都是質(zhì)子化的質(zhì)量。隨后我們測定了結(jié)合Shh有可能用改變的洗脫梯度通過HPLC分餾在亞種中，并研制出一種簡單的HPLC分析來定量各種形式。這些分析的結(jié)果見圖3所示。在該分析中，未改性的Shh首先洗脫(峰1)，然后是膽固醇改性的Shh洗脫出(峰2)，而最后是包含膽固醇和棕櫚酸改性的Shh的產(chǎn)物洗脫(峰3)。峰3的復(fù)雜形狀反映了棕櫚?；男孕问降拇嬖?，其是通過MALDIPSD測量的測序來鑒別的。變化為2Da，小于預(yù)測的，并因此有可能包含不飽和鍵(數(shù)據(jù)未顯示)。D、在人Sonichedgehog序列中棕櫚酸改性的局部化人序列中棕櫚?；奈稽c是通過組合使用肽作圖和序列分析來鑒別的。圖4B表明了用LC-MS讀數(shù)由肽作圖分析可溶性蛋白得到的結(jié)果。98％以上的可溶性Shh序列的質(zhì)量數(shù)據(jù)可由該分析中計算出。用星號標(biāo)注的峰相應(yīng)于N-端肽(殘基1-9加4-乙烯基吡啶，觀察質(zhì)量為983．50Da，計算質(zhì)量為983．49Da，表3)。在對應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物的分析中(圖4A)，該肽沒有，替代的是疏水性更強的肽，其質(zhì)量為1221．79Da(用星號標(biāo)注)。1221．79Da基團與存在N-端肽的改性形式相一致，即983．49Da對應(yīng)于肽成分加238．23Da。1221．79Da肽接下來通過MALDIPSD測量進行序列分析。所得的PSD譜示于圖5中。檢測到對應(yīng)于b1、b2、b4、b5、b8+H2O、y8、y7、y5、y4、y3、y2、y1片段的離子。另外，b1和b2離子表明吡啶基乙基化的Cys-1加成物是棕櫚酰化的。只有包含Cys-1的離子包含所添加的238．23Da質(zhì)量。因為胱氨酸是蛋白體內(nèi)棕櫚?；恼Ｎ稽c，所以發(fā)現(xiàn)連接在N-端胱氨酸上的新型加成物并不令人驚奇。但是，兩個證據(jù)提示脂質(zhì)連接在胱氨酸的氨基上，而不是硫醇上。首先，在肽作圖研究中，我們使用4-乙烯基吡啶作為光譜標(biāo)記物以監(jiān)測游離的硫醇基團(72)。吡啶基乙基化對于胱氨酸硫醇是高度特異性的，并增加105Da加成物，其可用MS檢測。在PSD光譜中觀察到的包含Cys-1的片段包括棕櫚酰基和吡啶基乙基兩個改性，表明存在游離硫醇基團。第二，結(jié)合Shh進行自動N一端Edman測序，但沒有得到序列，這提示在N-端的α-胺處的阻斷。相反地，相應(yīng)的可溶形式的Shh可容易地測序。實施例2人Sonichedgehog可在無細胞系統(tǒng)中用棕櫚酸改性用3H-棕櫚酸在無細胞的系統(tǒng)中標(biāo)記可溶性Shh，其中使用改進版的公開程序(24)。肝勻漿在3000×g下10分鐘、9000×g下20分鐘、以及100000×g下30分鐘順序進行離心，由此從鼠肝中分離粗的微粒體組分。將100000×g沉淀物懸浮在10mMHEPESpH7．4、10％蔗糖中，然后再于100000×g下離心20分鐘。將最終沉淀物(得自于10g肝臟)懸浮在3ml的20mMTris-HClpH7．4、150mMNaCl、1mMEDTA、10μg／ml亮抑蛋白酶肽、0．15％TritionX-100中，等分并儲存在-70℃下。反應(yīng)物包含3μgShh、1μl鼠微粒體、50ng／ml輔酶A(Sigma)、0．3mMATP、20mMTris-HClpH7．4、150mMNaCl、1mMEDTA、10μg／ml亮抑蛋白酶肽、以及0．5μCi-[9，10-3H]-棕櫚酸(50Ci／mmol；NewEnglandNuclear)，反應(yīng)在室溫下進行1小時。隨著減少電泳樣品緩沖液反應(yīng)停止，在10-20％梯度凝膠上進行SDS-PAGE，然后用熒光進行肉眼觀察。如圖1所示(泳道e)，Shh很容易地標(biāo)記有放射性示蹤物。反應(yīng)混合物中約1百個其他蛋白中沒有一個被標(biāo)記(見泳道j中相應(yīng)的考馬斯藍染色的凝膠圖譜)，這表明棕櫚?；磻?yīng)的高度特異性。棕櫚?；磻?yīng)的特異性的進一步證據(jù)是，我們測試了兩種Shh變體，其中棕櫚?；奈稽c已被消除。圖1(泳道f)顯示了截短形式的可溶性Shh的分析結(jié)果，該Shh缺少成熟序列的頭10個氨基酸殘基，而泳道g是Shh的突變體，其在N-端包含單個Cys-1向Ser的點突變。這些變體沒有一個被標(biāo)記。N-端胱氨酸作為脂質(zhì)衍生化位點的重要性已被以下事實進一步證實野生型可溶性Shh容易被標(biāo)記，而N-端胱氨酸向絲氨酸的突變體不被標(biāo)記。不能標(biāo)記N-端絲氨酸突變體引發(fā)了對簡單反應(yīng)機制的爭論，在該機制中棕櫚?；苯舆B接在N-端的α-胺上，這是因為在測試條件下絲氨酸應(yīng)取代胱氨酸。我們還使用可溶性的Shh檢測了游離N-端的作用，該Shh帶有N一端組氨酸(His)-標(biāo)記物突出。在這些研究中所用的可溶性Shh首先制成為His標(biāo)記的融合蛋白，其在成熟序列的連接處具有腸激酶斷裂位點，然后用腸激酶處理以除去His標(biāo)記物。盡管存在胱氨酸的游離硫醇基團，但His標(biāo)記的Shh仍未能棕櫚?；?見圖1，泳道i)。雖然我們不能排除N-端突出立體地抑制了棕櫚?；l(fā)生的可能性，但Cys-1是在腸激酶斷裂位點的PI，位置上，而且易于被酶處理。因此，似乎Cys-1的硫醇和α-胺都對棕櫚?；磻?yīng)有幫助。因為所有已知的棕櫚?；磻?yīng)定向于Cys、Ser或Thr殘基的側(cè)鏈，所以我們推論hedgehog上的改性以形成硫酯中間體開始，而且棕櫚?；ㄟ^形成環(huán)狀中間體轉(zhuǎn)移至N-端上。使用棕櫚?；o酶A改性人Sonichedgehog的研究證實了上述假設(shè)(見實施例8)。實施例3證實天然脂肪?；娜薙onichedgehog在以細胞為基礎(chǔ)的(C3H10T1／2)實驗中效力增加測試Shh在以細胞為基礎(chǔ)的實驗中的功能，其中在C3H10T1／2細胞(25)測量堿性磷酸酯酶誘導(dǎo)作用，共進行5天。該實驗在96孔板中進行。樣品重復(fù)進行兩次。對于結(jié)合Shh(100μg／ml)，樣品首先用正常生長培養(yǎng)基稀釋200倍，然后在板中進行系列的2倍稀釋。各孔對于所添加的辛基糖苷的潛在作用進行歸一化，其中是在培養(yǎng)基中添加0．005％辛基糖苷。使用中和鼠mAb5E1(26)的阻斷研究如下進行在室溫下于培養(yǎng)基中混合Shh和一系列的抗體稀釋物30分鐘，然后在板中添加測試樣品。在該實驗中，可溶性人Shh產(chǎn)生劑量依賴性的反應(yīng)，其中IC50為1μg／ml，最大信號出現(xiàn)在3μg／ml(圖6A)。結(jié)合的人Shh中，在C-端連接膽固醇，在N-端連接棕櫚?；湓趯嶒炛蓄愃频禺a(chǎn)生劑量依賴性的反應(yīng)，但IC50為0．03μg／ml，最大信號出現(xiàn)在0．1μg／ml，這表明其效力約為可溶性Shh的30倍。為證實所觀察到的活性是hedgehog特異性的，我們還測試了該活性是否可被抗hedgehog中和mAb5E1抑制。5E1處理可抑制可溶性和結(jié)合的Shh(圖6B)。結(jié)合Shh的抑制需要5E1的十分之一，這與其實驗中活性增加相一致。在受體結(jié)合實驗中測試了結(jié)合Shh，監(jiān)測其結(jié)合patched的能力，其中使用最近公開的實驗的改進版(10)。結(jié)合Shh顯示出劑量依賴性地結(jié)合表達patched的細胞，其中表觀IC50為400ng／ml(圖7)。在相同的實驗中，可溶性Shh結(jié)合patched的表觀IC50為150ng／ml，這表明結(jié)合形式僅與其受體略微緊密地結(jié)合。實施例4在重組為脂質(zhì)體后分析結(jié)合的人Sonichedgehog本實施例說明在1∶1-100∶1之寬范圍的脂質(zhì)∶蛋白比(w／w)中通過洗滌劑稀釋重組實驗為正電荷和負電荷的脂質(zhì)體對C3H10T1／2實驗中結(jié)合Shh的活性沒有作用。重組為包含磷脂的脂質(zhì)體為含脂質(zhì)的蛋白提供了一種有用的制劑，這是因為它能夠使含脂質(zhì)的蛋白在接近正常沉降中存在。為測試此等制劑對于結(jié)合Shh是否是可行的，我們使用了洗滌劑稀釋法以將蛋白摻入在脂質(zhì)體中(60)，其中所用的脂質(zhì)體與辛基糖苷和目的蛋白混合，然后將洗滌劑稀釋至低于其臨界膠束濃度，由此驅(qū)動重組。雖然可以利用大量純的或者脂質(zhì)混合物的任何一種，我們選擇了兩種市售的混合物作為模型包含卵L-α-磷脂酰膽堿、二鯨蠟基磷酸酯和膽固醇的負電荷脂質(zhì)體試劑盒(Cat．No．L-4262；Sigma，St．Louis，MO)；以及由卵磷脂酰膽堿、硬脂胺和膽固醇組成的正電荷脂質(zhì)體試劑盒(Cat．No．L-4137，Sigma)。簡言之，將脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至Pyrex管中，在氮氣流中干燥，然后凍干殘留的溶劑。將脂質(zhì)懸浮在10mMHEPESpH7．5、100mMNaCl、2．0％辛基糖苷中，攪拌，然后進行超聲處理，直至懸浮液的外觀變?yōu)橥该鞯摹＝又?．2微米過濾器中過濾脂質(zhì)。在辛基糖苷中用400、1000、5000和20000倍過量的脂質(zhì)(w／w)處理由桿狀病毒感染的HighFiveTM昆蟲細胞中得到的結(jié)合Shh等份，然后在預(yù)溫育15分鐘后稀釋樣品，并在C3H10T1／2實驗中分析活性。正或負電荷脂質(zhì)體處理對hedgehog的活性都沒有作用，這表明脂質(zhì)載體是可行的制劑。為證實hedgehog的確已被重組，用平行的樣品進行離心，其條件是結(jié)合Shh正常沉淀，而脂質(zhì)體飄浮在樣品的表面。在此情況下，結(jié)合Shh飄浮在表面上，這表明重組已經(jīng)發(fā)生。實施例5由哺乳動物(EBNA-293)細胞得到的膜結(jié)合人Sonichedgehog的特征為評估棕櫚?；瘜τ赟onichedgehog是常規(guī)改性通路或者其對于昆蟲細胞形成是特異性的，還在哺乳動物系統(tǒng)中于EBNA-293中制造蛋白。為在哺乳動物細胞中表達全長Shh，將包含全長Shh的1．4kbNotI片段(見實施例1)克隆入載體CH269pCEP4(Invitrogen，SanDiego，CA(21))的衍生物中。使用轉(zhuǎn)染胺(LifeTechnologies，Inc．)將構(gòu)建物轉(zhuǎn)染入EBNA-293細胞中，然后于轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞。表面Shh的表達用FACS和Western印跡分析證實。在窄孔C4柱(見實施例3)上用反相HPLC使由EBNA-293得到的結(jié)合Shh分級分離。用ESI-MS(表4中的部分a和b)或MALDI-TOFMS在FinniganLaserMat質(zhì)譜儀上使用α-氰基-4-羥基肉桂酸作為基質(zhì)(表4的部分c)分析各個峰。通過SDS-PAGE證實，蛋白移動略快于可溶性的Shh，其在反相HPLC分析中滯后在C4柱上，而且通過質(zhì)譜證實其包含相應(yīng)于棕櫚酸加膽固醇改性的離子。但是，昆蟲細胞衍生的產(chǎn)物中超過80％的產(chǎn)物包含棕櫚酸和膽固醇改性，但與此不同的是，HPLC洗脫圖和質(zhì)譜分析的數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)哺乳動物細胞衍生的蛋白缺乏棕櫚?；?見表4和圖3C)。也就是說，在EBNA-293細胞的峰2中，經(jīng)修剪的(des-1-10)對完整蛋白的MS信號的比例為50％，而峰1中僅約10％的Shh是經(jīng)修剪的。令人感興趣的是，昆蟲細胞和哺乳動物細胞衍生的產(chǎn)物都在C3H10T1／2實驗中顯示了可比的活性，這提示膽固醇以及膽固醇加棕櫚酸改性都是官能化的。是否簡單地使用第二脂質(zhì)連接以進一步穩(wěn)定蛋白與膜的結(jié)合或者其是否起著更重要的作用以及是否影響其形成或蛋白-蛋白接觸仍需要確定。蛋白的脂肪酸衍生化是常見的翻譯后改性，其在成熟過程中后期發(fā)生(28，29)。對于胱氨酸衍生物，該過程是動態(tài)的，涉及單獨的酶，該酶添加和除去巰基上的改性。此等衍生化(如棕櫚?；?的最常見功能是改變蛋白的物理-化學(xué)性質(zhì)，如將蛋白靶向至其功能位點、促進蛋白-蛋白的相互作用、以及介導(dǎo)蛋白-膜的相互作用(30)。對于hedgehog，雖然在昆蟲和哺乳動物細胞衍生的制劑的棕櫚?；潭壬洗嬖诓町?昆蟲細胞為80％，而哺乳動物細胞為30％)是令人驚奇的，但我們不知道其是否為生理顯著性的或者其是否簡單地反映兩種測試系統(tǒng)對于添加和除去棕櫚酸的細胞機制上的差異。昆蟲和哺乳動物細胞中改性程度的差異不可能是物種相關(guān)性的，這是因為在昆蟲細胞中產(chǎn)生的結(jié)合的Drosophilahedgehog缺乏棕櫚酸(19)，盡管其具有獨立的N-端序列。表4EBNA-293衍生的結(jié)合人Sonichedgehog的質(zhì)譜分析實施例6鼠Sonichedgehog的脂質(zhì)改性本實施例說明各種脂質(zhì)可連接在可溶性的鼠hedgehog上，如果編碼殘基1-174的鼠Shh基因是在HighFiveTM昆蟲細胞中表達的，基本上與實施例1中所述的全長人Shh一樣。脂質(zhì)改性使該部分為膜結(jié)合的。N-端片段(未處理的鼠Sonichedgehog的殘基1-174)與人Sonichedgehog的N-端片段的差異僅有2個氨基酸殘基。在鼠SonichedgehogN-端片段中，蘇氨酸替代了44位處的絲氨酸，而天冬氨酸替代了173位處的甘氨酸。如果在High-FiveTM昆蟲細胞／桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達缺乏自動處理域的鼠Sonichedgehog，絕大多數(shù)的蛋白分泌在培養(yǎng)基中，這是因為其缺少將膽固醇基團連接在C-端上的能力。該可溶性的形式具有特異性的生物活性(用實施例3中C3H10T1／2堿性磷酸酯酶誘導(dǎo)實驗來測量)，該活性類似于由E．Coli表達并純制的人Sonichedgehog的可溶性N-端片段。但是，總蛋白的小部分仍與昆蟲細胞有關(guān)。細胞結(jié)合的鼠Sonichedgehog蛋白基本上如實施例1所述進行純制，而且發(fā)現(xiàn)其在堿性磷酸酯酶實驗(數(shù)據(jù)未示出)中比分別由E．Coli和HighFiveTM昆蟲細胞／桿狀病毒表達系統(tǒng)純制的人或鼠Sonichedgehog的可溶性N-端片段具有更顯著的活性。隨后用HPLC和電子噴射質(zhì)譜分析對鼠SonichedgehogN-端片段的研究(如實施例1中所述)提示，蛋白是脂質(zhì)改性的，而且有超過1種類型的脂質(zhì)改性。支持證據(jù)包括以下事實1、細胞結(jié)合形式比可溶性的人和鼠sonichedgehogN-端片段在C4反相HPLC柱(Vydac目錄號214TP104)中更慢被洗脫，該柱用在0．1％三氟乙酸中的0-70％乙腈梯度線性洗脫30分鐘；2、如表5所示，細胞結(jié)合形式的質(zhì)量與脂質(zhì)改性蛋白的預(yù)測值一致。表5鼠Sonichedgehog的各種脂質(zhì)改性形式的質(zhì)量*在計算預(yù)期質(zhì)量時實驗平均質(zhì)量脂質(zhì)基團的位置使用序列分析和肽作圖的組合法來確定。自動N-端Edman測序脂質(zhì)改性形式表明，N-端被阻斷，提示脂質(zhì)連接在N-端胱氨酸的α-胺上。使用4-乙烯基吡啶烷基化的脂質(zhì)改性形式的Endo-Lys-C肽作圖、MALDI-TOF質(zhì)譜分析和MALDIPSD分析(如實施例1中所述)來證實脂質(zhì)改性的位置并確定它們的精確質(zhì)量。如表6所示，攜帶脂質(zhì)改性的N-端肽(包括殘基1-9加上連接在N-端胱氨酸的硫醇側(cè)鏈上的4-乙烯基吡啶)的質(zhì)量在0．1Da范圍內(nèi)與脂質(zhì)改性的肽預(yù)期值一致。表6由各種脂質(zhì)改性的鼠Sonichedgehog分離的N-端肽的質(zhì)量*在計算預(yù)期質(zhì)量時實驗平均質(zhì)量除表6中所示的脂質(zhì)改性肽，還可檢測到質(zhì)量為1191．74、1219．84和1247．82的肽。這些質(zhì)量分別與不飽和形式的肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯和硬脂酸酯一致，但是未能確定烷基鏈中雙鍵的位置。這些事實表明，飽和以及不飽和脂肪酸可共價鍵地連接在N-端胱氨酸上。對于飽和以及不飽和脂質(zhì)改性的肽，如實施例1中所述的MALDIPSD分析證實脂質(zhì)共價鍵地連接在N-端胱氨酸殘基上。實施例7Indianhedgehog的脂質(zhì)改性為評估棕櫚?；磻?yīng)對于人Shh是否是獨特的或者它是否發(fā)生在其他hedgehog蛋白上，我們測試了人Indianhedgehog(在E．Coli中表達為His標(biāo)記的融合蛋白，在緊鄰成熟序列的起始部分處具有腸激酶斷裂位點，并精確地如重組人Sonichedgehog進行純制(實施例9))是否能夠被棕櫚?；渲惺褂昧巳鐚嵤├?中所述的實驗。人Indianhedgehog是經(jīng)改性的(見圖1，泳道h)，表明棕櫚酰化有可能是hedgehog蛋白的一個常見特征。用放射性棕櫚酸在無細胞的系統(tǒng)中直接標(biāo)記Shh和Ihh的能力能夠簡單篩選改性反應(yīng)中所涉及的氨基酸。另外，用實施例8中所述的方法棕櫚酰化的Indianhedgehog在C3H10T1／2實驗中明顯比未經(jīng)改性的Ihh具有更強的效力。實施例8使用酰基輔酶A對Sonichedgehog進行脂質(zhì)改性包含N-端胱氨酸的蛋白的體外?；赏ㄟ^一個兩步的、與脂肪酸-硫酯供體的化學(xué)反應(yīng)來完成。在第一步中，硫酯供體的酰基通過自發(fā)的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)移至蛋白之N-端胱氨酸的巰基上。隨后，?；M行S至N遷移轉(zhuǎn)移至N-端胱氨酸的α-胺上，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。蛋白上胺官能團的直接?；搽S與硫酯的長時間溫育而發(fā)生，但是蛋白上胱氨酸的存在將加速該反應(yīng)，并控制在酰化位點上。在本實施例中，使用市售輔酶A衍生物(SigmaChemicalCompany，St．LouisMO)，但其他硫酯基團也可達到相同的結(jié)果。事實上，某些硫酯離去基團，如硫芐基酯，有可能反應(yīng)更迅速。內(nèi)部胱氨酸殘基也可促進至鄰近的賴氨酸(如在內(nèi)部胱氨酸-賴氨酸對中)的?；?，而且這可通過使用合成肽方便地進行測試。在與硫酯反應(yīng)期間發(fā)生在蛋白上的第二?；赏ㄟ^控制緩沖液組成、pH或者通過鄰近賴氨酸的位點針對性誘變來防止。在預(yù)分析?；瘜θ薙onichedgehog于C3H10T1／2細胞中誘導(dǎo)堿性磷酸酯酶的能力的影響時，反應(yīng)混合物包含1mg／ml人Sonichedgehog(51μM)、500μM特殊的市售酰基輔酶A(測試的化合物包括乙?；o酶A(C20)、丁?；o酶A(C40)、己?；o酶A(C60)、辛?；o酶A(C80)、癸?；o酶A(C100)、月桂?；o酶A(C120)、肉豆蔻酰基輔酶A(C140)、棕櫚酰基輔酶A(C160)、棕櫚油酰基輔酶A(C160)、硬脂?；o酶A(C180)、二十碳?；o酶A(C200)、二十二碳?；o酶A(C220)、二十四碳?；o酶A(C240)、琥珀酰基輔酶A和苯甲?；o酶A)、25mMDTT、以及50mMNa2HPO4pH7．0。反應(yīng)物在生物下溫育3小時，然后立即如實施例3所述在C3H10T1／2實驗中分析(無需純制)生物活性。反相HPLC以及其他物理方法中所分析的樣品通常儲存在-70℃下。HPLC分析在VydacC4反相柱(4．6mm內(nèi)徑×250mm，5微米顆粒)上進行，其中用在0．1％TFA中的5-85％乙腈梯度洗脫40分鐘，流速為1ml／min。在280nm處監(jiān)測洗脫物，在一些實驗中收集流分，并在SDS-PAGE上分析hedgehog蛋白，其中用考馬斯染色和Western印跡檢測。各種反應(yīng)混合物的活性比較(圖10)表明，與未改性的蛋白相比，12-18個碳原子之間的鏈長在誘導(dǎo)堿性磷酸酯酶活性方面是最佳的。增加鏈長進一步導(dǎo)致活性的表觀下降，而且不飽和棕櫚油?；o酶A(C161)中的雙鍵使其活性與完全飽和的棕櫚酰基輔酶A(C160)的相同。在反相HPLC分析反應(yīng)混合物時，我們觀察到許多更短鏈的?；o酶A衍生物不與hedgehog蛋白反應(yīng)，并因此圖10中所示的生物活性的依賴性并不完全反映酰基鏈長。為得到經(jīng)改性蛋白的真實活性的數(shù)據(jù)、以及活性對?；滈L的依賴性的數(shù)據(jù)，我們研制了合成并純制單獨N-端?；问降姆椒āＷ貦磅；?、肉豆蔻?；?、月桂?；⒐秕；⒁约靶刘；娜薙onichedgehog蛋白攜帶單個連接在N-端胱氨酸的α-胺上的酰基鏈，它們是在包含以下物質(zhì)的反應(yīng)混合物中制得的0．80mg／ml(41μM)人Sonichedgehog，410μM(10倍摩爾濃度過量)的棕櫚?；o酶A、肉豆蔻酰基輔酶A、或月桂酰基輔酶A，或者4．1mM(100倍摩爾濃度過量)的癸?；o酶A或辛酰基輔酶A，25mMDTT(對于包含棕櫚?；o酶A、肉豆蔻?；o酶A或月桂?；o酶A的反應(yīng)混合物)或者0．5mMDTT(對于包含癸?；o酶A或辛酰基輔酶A的反應(yīng)混合物)，以及40mMNa2HPO4pH7．0。反應(yīng)混合物在28℃下溫育24小時。N-端胱氨酸與?；蝓サ姆磻?yīng)使得酰基通過自發(fā)的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)移至巰基上，然后通過S至N遷移轉(zhuǎn)移至α-胺上，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。游離巰基接著進行第二轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，產(chǎn)生帶有脂肪?；牡鞍?，該脂肪酰基通過硫酯鍵連接在巰基上。硫酯連接的?；鶆t如下除去順序地添加0．11體積的1MNa2HPO4pH9．0和0．11體積的1M羥胺(0．1M最終濃度)，然后在28℃下溫育18小時，這將僅剩下連接在蛋白上的酰基酰胺(62)。然后添加0．25體積的5％辛基糖苷(1％最終濃度)，并在室溫下溫育混合物1小時。然后在1％辛基糖苷存在下使用SP-SepharoseFastFlow(Pharmacia)和BioScaleS(Biorad)陽離子交換色譜純制蛋白。經(jīng)純制的蛋白相對于5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl、1％辛基糖苷、0．5mMDTT進行透析，然后儲存在-70℃下。需要辛基糖苷的存在，以維持所有的溶解度，通過稀釋和透析除去洗滌劑分別導(dǎo)致丟失75％、41％和15％的棕櫚?；?、肉豆蔻?；驮鹿瘐；鞍?。HPLC純制的蛋白的ESI-MS證實它們的完整性棕櫚?；腟onichedgehog，測量質(zhì)量=19798，計算質(zhì)量=19798．43；肉豆蔻酰化的Sonichedgehog，測量質(zhì)量=19770，計算質(zhì)量=19770．33；月桂?；腟onichedgehog，測量質(zhì)量=19742，計算質(zhì)量=19742．33；癸?；腟onichedgehog，測量質(zhì)量=19715，計算質(zhì)量=19714．28；辛酰化的Sonichedgehog，測量質(zhì)量=19686，計算質(zhì)量=19686．23。在C3H10T1／2實驗中分析各種酰化形式的人Sonichedgehog(圖11)表明，蛋白的活性取決于鏈長。棕櫚?；?、肉豆蔻?；?、以及月桂酰化的蛋白顯示出幾乎相同的活性，其中EC50值為5-10ng／ml(與未改性的蛋白相比，效力增加100-200倍)。癸酰化的人Sonichedgehog的EC50值為60-70ng／ml(與未改性的蛋白相比，效力增加15-30倍)，其活性低于棕櫚?；摹⑷舛罐Ⅴ；?、和月桂?；牡鞍?，而辛?；男问斤@示最低的活性，其EC50為100-200ng／ml(與未改性的蛋白相比，效力增加10倍)。所有?；问蕉急任锤男缘牡鞍椎男ЯΩ撸笳叩腅C50為1000-2000ng／ml。除EC50降低外，棕櫚?；?、肉豆蔻酰化的、以及月桂?；牡鞍着c未改性的蛋白相比誘導(dǎo)約2倍更高的堿性磷酸酯酶活性，而癸?；暮托刘；牡鞍锥嗾T導(dǎo)1．5倍。在C3H10T1／2實驗中除觀察到肉豆蔻?；娜薙onichedgehog的效力增加外，在胚胎期E11鼠端腦的外植體中誘導(dǎo)前腦神經(jīng)元方面，肉豆蔻?；问奖任锤男缘牡鞍酌黠@更有效力。用各種濃度的未經(jīng)改性的或者肉豆蔻?；腟onichedgehog溫育E11端腦外植體，并隨后染色dlx和islet-1／2基因(前腦神經(jīng)元的標(biāo)記物)的產(chǎn)物的外植體，它們表明在48nM時首先觀察到未經(jīng)改性的蛋白的誘導(dǎo)作用，但在3nM時首先觀察到肉豆蔻?；问降恼T導(dǎo)作用。而且，未經(jīng)改性的蛋白在3070nM時誘導(dǎo)限制性表達，而肉豆蔻?；牡鞍自?8nM時誘導(dǎo)寬范圍的表達。當(dāng)胚胎期E9預(yù)期端腦與未經(jīng)改性的或者肉豆蔻?；牡鞍滓黄饻赜龝r，觀察到類似的效力增加。染色Nkx2．1基因產(chǎn)物(前腦神經(jīng)元的早期標(biāo)記物)的外植體表明，在384nM時首先觀察到未經(jīng)改性的蛋白誘導(dǎo)Nkx2．1，而肉豆蔻?；牡鞍自?2nM時首先觀察到表達Nkx2．1。再者，在48nM肉豆蔻酰化的Sonichedgehog時，Nkx2．1的表達被擴展，而使用未經(jīng)改性的形式時在該濃度下沒有檢測到。另外，肉豆蔻酰化的人Sonichedgehog已顯示出比未改性的蛋白具有更顯著的保護性，減少由于向鼠腦紋狀體給藥丙二酸酯而導(dǎo)致的損傷體積(見實施例16)。實施例9人Sonichedgehog的N-端胱氨酸的化學(xué)衍生物A、總的方法蛋白的烷基化。在50μl的6M鹽酸胍、50mMNa2HPO4pH7．0中于室溫下用0．5μl的4-乙烯基吡啶處理包含約20μg蛋白的樣品2小時。添加40體積的冷乙醇，由此使S-吡啶基乙基化的蛋白沉淀。在-20℃下儲存溶液1小時，然后在14000×g和4℃下離心8分鐘。棄掉上清液，然后用冷乙醇洗滌沉淀物。蛋白儲存在-20℃下。肽作圖。烷基化蛋白(0．4mg／ml，在1M鹽酸胍、20mMNa2HPO4pH6．0中)用endoLys-C(WakoPureChemicalIndustries，Ltd．)以1∶20的比例進行消化。消化在室溫下進行30小時。用5μl的25％三氟乙酸進行酸化，由此使反應(yīng)停止。在Waters2690SeparationModule上分析消化物，該儀器上裝有996型光電二極管矩陣檢測器。在注射前，將固態(tài)的鹽酸胍添加在消化物中至6M的濃度，以溶解不溶的物質(zhì)。分離時使用反相VydacC18(2．1mm內(nèi)徑×250mm)柱，用0．1％三氟乙酸／乙腈梯度洗脫90分鐘，0．1％三氟乙酸／乙腈的流速為0．2ml／min。手工收集每個峰用于質(zhì)譜分析。質(zhì)量測定。完整蛋白的分子質(zhì)量用電子噴射離子化質(zhì)譜(ESI-MS)在MicromassQuattroII三聯(lián)四極質(zhì)譜儀上測定。使用在線Michrom超快微量蛋白分析儀用ReliasilC4(1mm內(nèi)徑×50mm)柱使樣品脫鹽。流速為20μl／min。使用MicromassMassLynx數(shù)據(jù)系統(tǒng)處理所有的電子噴射質(zhì)譜數(shù)據(jù)。肽的分子質(zhì)量在Voyager-DETMSTR(PerSeptiveBiosystems，F(xiàn)ramingham，MA)上通過基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜分析(MALDI-TOF-MS)進行測定。在相同的儀器上通過源后衰變(PSD)測量來進行改性肽的測序。使用α-氰基-4-羥基肉桂酸作為基質(zhì)。N-端測序。蛋白通過Edman降解在Perkin-ElmerAppliedBiosystems477A型脈沖液體蛋白測序儀上測序。在測序儀的樣品添加柱中直接添加硫脯氨酸(thiaproline)(噻唑烷-4-羧酸)，由此在線制備PTH-硫脯氨酸。用于化學(xué)改性的野生型可溶性人SonichedgehogN-端片段的細菌表達和純制。由表達Shh的細胞得到的細菌沉淀物，為總蛋白的4-5％，將其融化，以1∶4(w／v)的比例重新懸浮在溶胞緩沖液(25mMNa2HPO4pH8、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMPMSF、0．5mMDTT)中，然后由12000p．s．i．的Gaulin壓縮機(由APVRannie，Copenhagen，Denmark制造)中通過兩次以進行溶解。除非另有說明，所有隨后的純制步驟都在2-8℃下進行。在19000×g下離心勻漿60分鐘，然后在所得的溶胞產(chǎn)物中以1∶10(v／v)的比例添加MES0．5mpH5。將溶胞產(chǎn)物(pH5．5)添加在SPSepharoseFastFlow(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱(4gE．Coli濕重／ml樹脂)上，該柱用25mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl平衡。用4柱體積(CV)的平衡緩沖液洗滌，然后用3CV的25mMNa2HPO4pH5．5、200mMNaCl、0．5mMDTT洗滌，再于相同的緩沖液中用800mMNaCl洗脫His標(biāo)記的Shh。用280nm處的吸光度和SDS-PAGE分析洗脫流分。在峰值Shh的池中添加咪唑(1M原料液pH7)和NaCl(5M原料液)以分別形成20mM和1M的最終濃度，該峰值Shh的池中包含由SPSepharose洗脫液的流分。然后將該物質(zhì)添加在NTA-Ni瓊脂糖(Qiagen，SantaClara，CA)柱(20mg／ml樹脂)中，該柱用25mMNa2HPO4pH8、1MNaCl、20mM咪唑、0．5mMDTT平衡。用5CV的相同緩沖液洗滌上述柱，然后用3CV的25mMNa2HPO4pH8、1MNaCl、200mM咪唑、0．5mMDTT洗脫His標(biāo)記的Shh。由NTA-Ni柱中流出的在洗脫池中的蛋白含量用280nm處的吸光度來測定。將所述池溫?zé)嶂潦覝兀缓筇砑拥润w積的2．5M硫酸鈉。在室溫下進行PhenylSepharose步驟。將所述物質(zhì)添加在PhenylSepharoseFastFlow(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱(20mg／ml樹脂)上，該柱用25mMNa2HPO4pH8、400mMNaCl、1．25M硫酸鈉、0．5mMDTT平衡。用25mMNa2HPO4pH8、400mMNaCl、0．5mMDTT洗脫His標(biāo)記的Shh。通常情況下，我們由0．5kg的細菌漿液(濕重)中回收2-3g的His標(biāo)記的Shh。產(chǎn)物由0．2μm過濾器中過濾，等分，然后儲存在-70℃下。用SDS-PAGE測定His標(biāo)記的Shh的純度為95％。進一步估算經(jīng)純制的產(chǎn)物的特征，對樣品進行電子噴射離子化質(zhì)譜(ESI-MS)分析。約50％的蛋白失去N-端蛋氨酸。為斷裂六組氨酸標(biāo)記物，以1∶1000(w／w)的酶Shh比例使腸激酶(Biozyme，SanDiego，CA)與His標(biāo)記的Shh在28℃下溫育2小時。使消化物由第二NTA-Ni瓊脂糖柱(20mgShh／ml樹脂)中通過，由此除去未斷裂的His標(biāo)記的Shh和游離His標(biāo)記物。在裝填前，將咪唑(1M原料液，pH7)和NaCl(5M原料液)添加在消化物中使最終濃度分別為20mM和600mM。將該物質(zhì)裝填在NTA-Ni柱上，該柱在25mMNa2HPO4pH8、600mMNaCl、20mM咪唑、0．5mMDTT中平衡，然后收集流分。用1CV的相同緩沖液洗滌該柱，并收集流分。在NTA-Ni瓊脂糖未結(jié)合的流分中添加MES(0．5M原料液，pH5)至最終濃度為50mM，然后添加2體積的水。將該物質(zhì)裝填在第二個SPSepharoseFastFlow柱(20mg／ml樹脂)上，該柱用5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl、0．5mMDTT平衡。所述柱用3CV的平衡緩沖液、1CV包含300mMNaCl的相同緩沖液洗滌。用5mMNa2HPO4pH5．5、800mMNaCl、0．5mMDTT洗脫Shh。原子吸收數(shù)據(jù)表明在該階段Shh包含0．5mol當(dāng)量的Zn2+。在Shh洗脫液中添加等摩爾濃度的ZnCl2，然后相對5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl、0．5mMDTT透析蛋白。SDS-PAGE、大小排阻色譜(SEC)和ESI-MS證實所得的Shh的純度大于98％，而原子吸收證實其包含0．9-1．1Zn2+／Shh。His標(biāo)記的Shh以及除去His標(biāo)記物后得到的產(chǎn)物的ESI-MS數(shù)據(jù)總結(jié)于表7中。表7Shh的ESI-MS特征B、特異性的化學(xué)改性用N-乙基馬來酰亞胺改性人Sonichedgehog。在5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl、0．5mMDTT中經(jīng)純制的Shh用10mMN-乙基馬來酰亞胺在冰上處理1小時，然后在5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl中透析。MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)表明，N-乙基馬來酰亞胺(NEM)改性的蛋白的質(zhì)量增加126Da，這表示在Shh中僅有一個胱氨酸殘基被該試劑改性。N-端測序數(shù)據(jù)表明，蛋白是可測序的，而且在第一個循環(huán)中檢測出一個不尋常的峰(數(shù)據(jù)未顯示)，可能與PTH-NEM-Cys有關(guān)。吡啶基乙基化的NEM-Shh在變性條件下的質(zhì)譜分析表明在蛋白中僅有兩個胱氨酸殘基被烷基化，證實了僅有N-端胱氨酸殘基的硫醇基團在天然條件下被NEM改性(表8)。其他兩個胱氨酸殘基明顯被埋在蛋白的疏水性芯中，在變性前沒有被改性。表8NEM改性的Shh的MS特征<tablesid="table5"num="007"><table>蛋白質(zhì)量(計算)質(zhì)量(測量)吡啶基乙基化的NEMShh19895Da如果包含2個游離胱氨酸殘基19895Da如果包含3個游離胱氨酸殘基20000Da</table></tables>當(dāng)在C3H10T1／2實驗(見實施例2)中測試時，N-乙基馬來酰亞胺改性的hedgehog蛋白在活性上與未經(jīng)改性的蛋白相同。這證實hedgehogN-端處的游離巰基對于活性不是必須的，而且N-乙基馬來酰亞胺的疏水性與其他疏水性更強的改性基團相比足以使hedgehog具有某些活性，所述其他改性例如將Cys-1轉(zhuǎn)化為His或Asp，這將降低活性。用甲醛改性人Sonichedgehog以形成N-端硫脯氨酸，以及用乙醛和丁醛處理形成N-端硫脯氨酸衍生物。對于甲醛改性，在5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl、0．5mMDTT中3mg／ml經(jīng)純制的Shh用0．1％甲醛在室溫下處理1-6小時，其中使用或不使用10％甲醇。蛋白相對于5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl進行透析，或者在如以下所述的CM-Poros柱(PerseptiveBiosystems)上純制，然后相對于5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl進行透析。對于用乙醛或丁醛的改性，在5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl、0．5mMDTT中3mg／ml經(jīng)純制的Shh用0．1％乙醛或丁醛在室溫下處理1小時，然后在CM-Poros柱上純制蛋白。甲醛、乙醛和丁醛處理的蛋白的ESI-MS數(shù)據(jù)表明，它們的質(zhì)量比未經(jīng)改性的蛋白分別高出13Da、27Da和54Da(見表9)。表9用甲醛、乙醛和丁醛處理的人Sonichedgehog的預(yù)期和觀察質(zhì)量*使用平均質(zhì)量用于計算預(yù)期質(zhì)量。對于甲醛處理的蛋白，如上所述，肽作圖證實改性位點發(fā)生在跨越頭9個N-端殘基的肽中，而且精確的質(zhì)量增加是12Da。該肽之MALDI-PSDMS研究結(jié)果表明改性發(fā)生在Cys-1上，而且可用N-端α-胺和Cys-1硫醇側(cè)鏈的改性形成硫脯氨酸來解釋(見圖12)。硫脯氨酸的結(jié)構(gòu)通過自動N-端Edman測序使用“在線”制備的PTH-硫脯氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)物來證實。對于乙醛和丁醛處理的蛋白，ESI-MS數(shù)據(jù)與通過如與甲醛反應(yīng)相同的化學(xué)發(fā)生的改性一致，但尚未明確改性位點。當(dāng)在C3H10T1／2以細胞為基礎(chǔ)的實驗中測試時，甲醛、乙醛和丁醛改性的蛋白的效力比未經(jīng)改性的Shh分別高約8、2和3倍。用N-異丙基碘代乙酰胺改性人Sonichedgehog。本實施例表明與未經(jīng)改性的Shh相比，用碘代乙酰胺的疏水性衍生物改性人Shh可增強蛋白的效力。經(jīng)純制的Shh(1mg／ml，在5mMNa2HPO4pH7．0、150mMNaCl、0．1mMDTT中)在4℃下與1mM的N-異丙基碘代乙酰胺(NIPIA)溫育18小時。將DTT添加至10mM最終濃度，然后樣品相對于5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl、0．5mMDTT進行廣泛透析。在SPSepharoseFastFlow樹脂上純制樣品，并相對于5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl、0．5mMDTT進一步透析。ESI-MS數(shù)據(jù)表明完全轉(zhuǎn)化為質(zhì)量是19660的物質(zhì)，相應(yīng)于單一改性的蛋白的預(yù)期質(zhì)量值(19659)。N-端胱氨酸的特異性改性用蛋白水解片段的肽作圖證實。當(dāng)在C3H10T1／2以細胞為基礎(chǔ)的實驗中測試時，NIPIA改性的人Shh的效力比未經(jīng)改性的蛋白高約2倍。雖然蛋白的改性僅導(dǎo)致效力的中度增加，但預(yù)期用長鏈烷基碘代乙酰胺衍生物改性蛋白將產(chǎn)生效力增加更高的疏水性改性的蛋白，可能類似于在棕櫚?；⑷舛罐Ⅴ；⒑驮鹿瘐；腟hh蛋白中觀察到的100-200倍(見實施例8)。用1-溴-2-丁酮改性人Sonichedgehog以在N-端形成6元疏水性環(huán)。Shh的硫代嗎啉基-(四氫噻嗪基-)衍生物如下制備在室溫下使人Shh-N(3mg／ml，在5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl、0．15mMDTT中)與11mM1-溴-2-丁酮一起溫育60分鐘，然后用5mMNaCNBH3在室溫下還原60分鐘。在如下所述的CM-Poros柱(PerseptiveBiosystems)上純制反應(yīng)產(chǎn)物，并相對于5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl、0．5mMDTT進行透析。ESI-MS和蛋白水解肽作圖的數(shù)據(jù)表明，所述產(chǎn)物是所期望的硫代嗎啉基衍生物(計算質(zhì)量=19615，觀察質(zhì)量質(zhì)量=19615)和兩種蛋白形式的混合物，所述蛋白都具有16個額外的質(zhì)量單位。這些形式之一是未環(huán)化的酮基-硫醚中間體。在C3H10T1／2實驗中測試混合物，表明其比未經(jīng)改性的蛋白的效力高5倍。實施例10人Sonichedgehog的遺傳工程誘變A、N-端胱氨酸的遺傳工程誘變在本實施例中，我們顯示在如實施例3所述的C3H10T1／2以細胞為基礎(chǔ)的實驗中與野生型蛋白相比，單和多疏水性氨基酸殘基特異性替換人Sonichedgehog的N-端胱氨酸(Cys-1)導(dǎo)致效力的增加。ShhCys-1突變體的構(gòu)建。攜帶由p6H-SHH產(chǎn)生的His標(biāo)記的野生型ShhN-端片段的584bpNcoI-XhoI限制性片段亞克隆在pUC野生的克隆載體pNN05中，以構(gòu)建質(zhì)粒pEAG649。根據(jù)制造商的建議方案使用Pharmacia試劑盒對pEAG649質(zhì)粒模板進行獨特的位點消除誘變，由此制備可溶性人Shh的Cys-1突變體。在設(shè)計誘變引物時，如果所希望的突變不產(chǎn)生限制性位點變化，則在鄰近的編碼子中引入產(chǎn)生限制性位點變化的沉默突變，以有利于誘變后突變克隆的鑒別。為避免異常編碼子的使用，從至少在人ShhcDNA序列中其他地方發(fā)生至少一次的那些編碼子中選擇經(jīng)取代的編碼子。使用以下誘變引物(1)對于C1F5＇GGCGATGACGATGACAAATTCGGACCGGGCAGGGGGTTC3＇(SEQIDNO)，其引入一個ApoI位點以制成pEAG837；(2)對于C1I5＇GGCGATGACGATGACAAAATAGGACCGGGCAGGGGGTTC3＇(SEQIDNO)，其失去RsrII位點以制成pEAG838；以及(3)對于C1M5＇GGCGATGACGATGACAAAATGGGCCCGGGCAGGGGGTTCGGG3＇(SEQIDNO)，其失去RsrII和AvaII位點以制成pEAG839。通過攜帶質(zhì)粒pEAG837-839中突變SHH蛋白的N-端的180bpNcoI-BglII限制性片段由DNA測序來證實突變。將各突變質(zhì)粒的180bpNcoI-BglII片段和得自于pEAG649的404bpBglII-XhoI片段亞克隆于p6H-SHHH的用磷酸酯酶處理過的5．64kbXhoI-NcoIpET11d載體骨架中，由此構(gòu)建表達載體。引入的限制性位點變化的存在在各Cys-1突變體(在pEAG840中的C1F，在pEAG841中的C1I，以及在pEAG842中的C1M)的表達載體中重新證實。根據(jù)制造商的建議方案將表達載體轉(zhuǎn)化入競爭性E．ColiBL21(DE3)pLysS(Stratagene)中，然后在包含100μg／ml氨芐青霉素和30μg／ml氯霉素的LB瓊脂板上進行選擇。選擇單獨的菌落，并使轉(zhuǎn)化的細菌生長至0．4-0．6的A600，然后用0．5mMIPTG誘導(dǎo)3小時。通過還原SDS-PAGE和Westem印跡分析細菌沉淀物對突變蛋白的表達。根據(jù)制造商的建議方案使用Pharmacia試劑盒，通過獨特的位點消除誘變制備帶有多個N-端疏水性取代(ClII)的可溶性人Shh突變體。在設(shè)計誘變引物時，如果所希望的突變不產(chǎn)生限制性位點變化，則在鄰近的編碼子中引入產(chǎn)生限制性位點變化的沉默突變，以有利于誘變后突變克隆的鑒別。為避免異常編碼子的使用，從至少在人ShhcDNA序列中其他地方發(fā)生至少一次的那些編碼子中選擇經(jīng)取代的編碼子。對于ClII，在C1F模板質(zhì)粒pEAG837上使用以下誘變引物5＇GCGGCGATGACGATGACAAAATCATCGGACCGGGCAGGGGGTTCGGG3＇(SEQIDNO)，其除去ApoI位點以制備pEAG872。通過攜帶突變ClIIShh的0．59kpNcoI-XhoI限制性片段由DNA測序來證實突變。將突變質(zhì)粒的NcoI-XhoI片段亞克隆于p6H-SHHH的用磷酸酯酶處理過的5．64kbXhoI-NcoIpET11d載體骨架中，由此構(gòu)建表達載體。引入的限制性位點變化的存在在ClII突變體的表達載體pEAG875中重新證實。根據(jù)制造商的建議方案將表達載體轉(zhuǎn)化入競爭性E．ColiBL21(DE3)pLysS(Stratagene)中，然后在包含100μg／ml氨芐青霉素和30μg／ml氯霉素的LB瓊脂板上進行選擇。選擇單獨的菌落，并使轉(zhuǎn)化的細菌生長至0．4-0．6的A600，然后用0．5mMIPTG誘導(dǎo)3小時。如上所述分析細菌沉淀物，以證實突變Shh蛋白的表達。人Sonichedgehog的Cys-1突變體的純制。如上述對野生型蛋白的描述由細菌沉淀物中純制His標(biāo)記的突變hedgehog蛋白，但有兩個變化。(1)取消PhenySepharose步驟，取而代之的是在腸激酶斷裂步驟中的制備中，將由第一個NTA-Ni柱中的蛋白池透析入25mMNa2HPO4pH8、400mMNaCl、0．5mMDTT中。(2)最終離子交換步驟由在SP-SepharoseFastFlow上洗脫變化為在CM-Poros柱(PerseptiveBiosystems)上進行梯度洗脫。這在50mMNa2HPO4pH6．0中進行，用超過30個柱體積的0-800mMNaCl梯度。由該步驟中匯集的峰流分透析入5mMNa2HPO4pH5．5、150mMNaCl中，然后儲存在-80℃下。純制蛋白的質(zhì)譜給出各純制形式的預(yù)期質(zhì)量離子。人Sonichedgehog的Cys-1突變體的活性。如表10所示，在C3H10T1／2實驗中，N-端胱氨酸的突變對于所得hedgehog蛋白的效力產(chǎn)生顯著的作用。對于單個變化，效力通常與取代氨基酸的疏水性有關(guān)，也就是說，與野生型胱氨酸相比，苯丙氨酸和異亮氨酸產(chǎn)生最大的活化作用，蛋氨酸的活化作用較低，而組氨酸和天冬氨酸消除了活性。用兩個異亮氨酸替代胱氨酸比單個異亮氨酸替換產(chǎn)生更大的活性增加。如果將9種氨基酸歸類為比胱氨酸的疏水性更大(蛋白結(jié)構(gòu)和分子性質(zhì)(Proteinsstructuresandmolecularproperties)，第2版，1993，T．E．Creighton，W．H．FreemanCo．第154頁)，上述測試的取代明顯地不是對能夠提升hedgehog活性的N-端處的可能突變的窮盡研究。但是，該結(jié)果證實，活化作用不限于單個氨基酸結(jié)構(gòu)，而且多于1個的氨基酸的取代能夠進一步增加效力。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠用其他N-端處的氨基酸取代產(chǎn)生效力比野生型蛋白更高的hedgehog形式。表10在C3H10T1／2實驗中人Sonichedgehog氨基酸改性的相對效力B、內(nèi)部殘基的遺傳工程誘變ClII／A169C突變體的構(gòu)建。根據(jù)制造商的建議方案用Pharmacia試劑盒并采用如上所述的誘變寡設(shè)計原則進行獨特的位點消除誘變，由此制備可溶性人Shh突變體ClII／A169C(其中胱氨酸替換可缺少的C-端殘基A169，該殘基預(yù)測具有高度的分離溶劑接近性)。在ClIIShh模板pEAG872上使用以下誘變引物5＇GAGTCATCAGCCTCCCGATTTTGCGCACACCGAGTTCTCTGCTTTCACC3＇(SEQIDNO)，以添加FspI位點制備pSYS049。通過0．59kbNcoI-XhoI限制片段由DNA測序證實ClII／A169C突變。將NcoI-XhoI片段亞克隆于p6H-SHHH的用磷酸酯酶處理過的5．64kbXhoI-NcoIpET11d載體骨架中，由此構(gòu)建表達載體。引入的限制性位點變化的存在在表達載體中重新證實。如上所述將表達載體轉(zhuǎn)化入競爭性E．ColiBL21(DE3)pLysS中，選擇菌落，誘導(dǎo)并篩選對于Shh的表達。ClII／A169C突變體的純制。如實施例9對野生型Shh所述純制ClII／A169C突變體，但有以下變化。(1)在溶胞緩沖液中除去EDTA。(2)交換NTA-Ni和SPSepharose步驟的順序，并省略PhenylSepharose步驟。(3)在離心澄清溶胞細菌后，在上清液中添加額外的氯化鈉至最終濃度為300mM。(4)NTA-Ni柱的洗脫緩沖液包含25mMNa2HPO4pH8．0、200mM咪唑、400mMNaCl。(5)NTA-Ni柱的洗脫池用3體積的100mMMESpH5．0稀釋，然后裝填在SPSepharose柱上。(6)在添加腸激酶前，SPSepharose洗脫池用半體積的50mMNa2HPO4pH8．0稀釋。以及(7)最終SPSepharose柱的緩沖液中的DTT包含0．2mMDTT，而且該步的洗脫池等分，并儲存在-70℃下。ClII／A169C突變體的疏水性改性和活性。對于用N-(1-芘)馬來酰亞胺(Sigma)的改性，用等體積的50mMMESpH6．5稀釋經(jīng)純制的ClII／A169C(4．6mg／ml，在5mMNa2HPO4pH5．5、800mMNaCl、0．2mMDTT中)，在該混合物中添加二十分之一體積的芘馬來酰亞胺，其源自于在DMSO中的2．5mg／ml原料液。樣品在黑暗中于室溫下溫育1小時。此時，添加另外的DTT至0．5mM，并在室溫下進一步溫育樣品1小時。在如實施例3中所述的C3H10T1／2實驗中直接測試經(jīng)改性的蛋白的活性。在改性前，蛋白的特異性活性是EC50=0．22μg／ml，而用芘馬來酰亞胺處理后，其特異性活性增加至EC50=0．08μg／ml。經(jīng)?？捎^察到改性產(chǎn)物的特異性活性增加3倍，這表明與ClII起始物相比，接近于Shh的C-端添加疏水性基團可進一步增加活性。與野生型未改性的Sonichedgehog蛋白相比，N-(1-芘)馬來酰亞胺改性的ClII蛋白的效力高出約30倍。雖然芘馬來酰亞胺提供了一個用于評估在此位點上的改性的簡單測試系統(tǒng)，但還可使用其他的疏水性馬來酰亞胺或其他的胱氨酸靶向化學(xué)品。實施例11在C3H10T1／2實驗中比較各種疏水性改性的人Sonichedgehog的效力在如實施例3所述的C3H10T1／2實驗中測試各種疏水性改性的人Sonichedgehog(使用部分V中所述的化學(xué)法和遺傳工程法制備的)的活性。在如實施例3中所述的濃度范圍上實驗各衍生物。在實驗中產(chǎn)生50％最大反應(yīng)的hedgehog衍生物的濃度與野生型濃度進行比較。相對活性見下表11和圖13。表11在C3H10T1／2實驗中hedgehog衍生物的相對效力C3H10T1／2實驗證實與野生型未經(jīng)改性的蛋白相比hedgehog的各種疏水性改性都增加了蛋白的活性。親水性改性(天冬氨酸和組氨酸)沒有這種作用。實施例12疏水性改性的人Sonichedgehog在鼠丙二酸誘導(dǎo)的紋狀體損傷實驗中的效力評估在鼠紋狀體(等同于靈長類caudate和putamen的嚙齒類動物)中注射丙二酸(線粒體酶琥珀酸酯脫氫酶的抑制劑)可導(dǎo)致紋狀體中脊髓神經(jīng)元的變性。在人中，caudate和putamen中的中脊髓神經(jīng)元變性是亨廷頓病的主要病理特征。因此，在鼠中丙二酸誘導(dǎo)的紋狀體損傷可被用作測試疏水性改性的hedgehog蛋白是否能夠防止在亨廷頓病中變性的神經(jīng)元死亡的模型。使用立體定位技術(shù)向Sprague-Dawley鼠的紋狀體注射各種濃度的疏水性改性的人Sonichedgehog。在戊巴比妥鈉麻醉(40mg／kg)下進行立體定位注射(2μl)，并放置在以下協(xié)同部位上在前囪之前0．7mm、橫向距中線2．8mm、以及垂直距離前囪處頭骨表面5．5mm。在注射疏水性改性的蛋白后的各種時間(通常48小時)處用異氟烷麻醉鼠，并在紋狀體的相同協(xié)同部位處進行丙二酸的立體定位注射(2μmol，在2μl中)。丙二酸注射后4天，殺死鼠，并取出腦用于組織學(xué)分析。以25μm的厚度由紋狀體切下冠狀部分并染色，用于細胞色素氧化酶活性，以區(qū)別損傷和未損傷的組織。使用圖象分析系統(tǒng)測量紋狀體中的損傷體積。疏水性改性的人Sonichedgehog蛋白在丙二酸誘導(dǎo)的鼠紋狀體損傷模型中的作用見圖14所示。未改性的Sonichedgehog(如在實施例9中制得的)、肉豆蔻?；腟hh(如實施例8中制得的)、以及Shh的ClII突變體(如在實施例10中制得的)，都在該模型中以類似的程度減少損傷體積。但是，疏水性改性的蛋白(肉豆蔻?；腟hh和ClIIShh)與未改性的Sonichedgehog相比顯示出效力增加。實施例13sHh-N的N-辛基馬來酰亞胺衍生化對于1mg／ml的最終濃度(1)制備在DMSO(約4．2mg／ml)中的20mM辛基馬來酰亞胺(m．w．=209)溶液。(2)用PBS(Gibco產(chǎn)品#20012-027，pH7．2)10倍稀釋10mg／mlsHh-N的原料液(在5mMNaPO4pH5．5、150mMNaCl、0．5mMDTT中)，形成1mg／ml(或者50μM)的sHh-N溶液。(注DTT在隨后的反應(yīng)中與sHh-N競爭馬來酰亞胺，其在該溶液中也是50μM)(3)在1mg／mlsHh-N中立即添加1／200體積的辛基馬來酰亞胺(即5μl／ml)。這使辛基馬來酰亞胺與sHh-N的摩爾比為2∶1(100μM50μM)。(4)輕柔搖晃試管以混合上述溶液，并在室溫下溫育1小時。(5)最后，在各試管中添加1／1000體積的0．35MDTT，以清除任何殘余的辛基馬來酰亞胺，并作為還原劑。(6)對于載體對照，按1∶10的比例混合載體溶液(5mMNaPO4pH5．5、150mMNaCl、0．5mMDTT)和PBS(Gibco產(chǎn)品#20012-027，pH7．2)。添加1／400體積的20mM辛基馬來酰亞胺之DMSO溶液和1／400體積的DMSO，以形成50μMN-辛基馬來酰亞胺和0．5％DMSO的最終濃度。最后，添加1／1000體積的0．35MDTT。1mg／mlN-辛基馬來酰亞胺sHh溶液的大約組成PBS(約pH7．2)50μM結(jié)合在N-辛基馬來酰亞胺上的sHh-N50μM結(jié)合在N-辛基馬來酰亞胺上的DTT350μMDTT0．5％DMSON-辛基馬來酰亞胺載體溶液的大約組成PBS(約pH7．2)50μM結(jié)合在N-辛基馬來酰亞胺上的DTT350μMDTT0．5％DMSO對于3mg／ml的最終濃度(1)制備在DMSO(約12．6mg／ml)中的60mM辛基馬來酰亞胺(m．w．=209)溶液。(2)用PBS(Gibco產(chǎn)品#20012-027，pH7．2)10倍稀釋10mg／mlsHh-N的原料液(在5mMNaPO4pH5．5、150mMNaCl、0．5mMDTT中)，形成3mg／ml(或者150μM)的sHh-N溶液。(注DTT在隨后的反應(yīng)中與sHh-N競爭馬來酰亞胺，其在該溶液中也是150μM)(3)在3mg／mlsHh-N中立即添加1／200體積的辛基馬來酰亞胺(即5μl／ml)。這使辛基馬來酰亞胺與sHh-N的摩爾比為2∶1(300μM150μM)。(4)輕柔搖晃試管以混合上述溶液，并在室溫下溫育1小時。(5)最后，在各試管中添加1／1000體積的0．35MDTT，以清除任何殘余的辛基馬來酰亞胺，并作為還原劑。(6)對于載體對照，按3∶7的比例混合載體溶液(5mMNaPO4pH5．5、150mMNaCl、0．5mMDTT)和PBS(Gibco產(chǎn)品#20012-027，pH7．2)。添加1／400體積的60mM辛基馬來酰亞胺之DMSO溶液和1／400體積的DMSO，以形成150μMN-辛基馬來酰亞胺和0．5％DMSO的最終濃度。最后，添加1／1000體積的0．5MDTT。3mg／mlN-辛基馬來酰亞胺sHh溶液的大約組成PBS(約pH7．2)150μM結(jié)合在N-辛基馬來酰亞胺上的sHh-N150μM結(jié)合在N-辛基馬來酰亞胺上的DTT500μMDTT0．5％DMSON-辛基馬來酰亞胺載體溶液的大約組成PBS(約pH7．2)150μM結(jié)合在N-辛基馬來酰亞胺上的DTT500μMDTT0．5％DMSO0．5％DMSO參考文獻1．Perrimon，N．(1995)細胞80，517-5202．Johnson，R．L．和Tabin，C．(1995)細胞81，313-3163．Riddle，R．D．等人(1993)細胞75，1401-14164．Niswander，L．等人(1994)自然371，609-6125．Laufter，E．等人(1994)細胞79，993-10036．Roberts，D．J．等人(1995)Development121，3163-31747．Chiang，C．等人(1996)自然382，407-4138．Bellusci，S．等人(1997)Development124，53-639．Marigo，V．等人(1996)自然384，176-17910．Stone，D．M．等人(1996)自然384，129-13411．Alcedo，J．等人(1996)細胞86，221-232．12．Dominguez，M．等人(1996)科學(xué)272，1621-162513．Alexandre，C等人(1996)Genes＆Dev．10，2003-201314．Therond，P．P．等人(1996)Proc．Natl．Acad．Sci．USA93，4224-4228515．Lee，J．J．等人(1994)科學(xué)266，1528-153616．Bumcrot，D．A．等人(1995)，Mol．CellBiol．15，2294-230317．Porter，J．A．等人(1995)自然374，363-36618．Porter，J．A．等人(1996)科學(xué)274，255-25819．Porter，J．A．等人(1995)細胞86，21-3420．Marigo，V．等人(1995)Genomics28，44-5121．Sanicola，M．等人(1997)Proc．Natl．Acad．Sci．USA94，6238-624322．Spengler，B．等人(1992)RapidCommun．MassSpectrom．6，105-10823．Spengler，B．等人(1992)J．Phys．Chem．96，9678-968424．Caron，J．M．(1997)Mol．Biol．Cell8，621-63625．Kinto，N．等人(1997)FEBSLetts．404，319-32326．Ericson，J．等人(1996)細胞87，661-67327．Wen，D．等人(1996)生物化學(xué)30，9700-970928．Bizzozero．O．A．(1996)Meth．Enzymol．250，361-38229．Wedegaermer，P．B．等人(1995)J．Biol．Chem．270，503-50630．Grosenbach，D．W．等人(1997)J．Biol．Chem．272，1956-196431．Pepinsky，R．B．等人(1991)J．Biol．Chem．266，18244-1824932．TanakaHall，T．M．等人(1995)自然378，212-21633．Mohler和Vani，(1992)Development115，957-97134．Hall等人(1995)自然378，212-21635．Ekker等人(1995)CurrentBiology5，944-95536．Fan等人(1995)細胞81，457-46537．Chang等人(1994)Development120，3339-335338．Echelard等人(1993)細胞75，1414-143039．Ericson等人(1995)細胞81，747-75640．Zoeller等人(1984)Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81，5662-6641．Kauffman和Sharp，(1982)Mol．Cell．Biol．，2，1304-131942．Leung等人(1989)技術(shù)1，11-1543．Mayers等人(1989)科學(xué)229，24244．Harang，SA．，(1983)Tetrahedron39，345．Itakura等人(1984)Ann．Rev．Biochem．53，32346．Cunningham和Wells(1989)科學(xué)244，1081-108547．Adelman等人，(1983)DNA2，18348．Wells等人(1985)基因34，31549．W．D．Huse等人(1989)科學(xué)246，1275-128150．H．L．Yin和T．P．Stossel(1979)自然281，583-58651．Lindley(1956)自然178，64752．Gross和Witkip，(1961)J．Am．Chem．Soc．83，151053．D．M．Haverstick和M．Glaser，(1987)Proc．Natl．Acad．Sci．USA64，4475-447854．Szoka等人(1980)Ann．Rev．Biophys．Bioeng．9，467-50855．Ohsawa等人，(1984)Chem．Pharm．Bull．32，244256．Batzri等人，(1973)Biochim．Biophys．Acta298，1015-101957．Szoka等人，(1978)Proc．Natl．Acad．Sci．USA75，4191-419958．Pick，(1981)Arch．Biochem．Biophys．212，186-19459．Kasahara等人，(1977)J．Biol．Chem．251，7384-739060．Racker等人，(1979)Arch．Biochem．Biophys．198，470-47761．Papahadjopoulos等人，(1991)Proc．Natl．Acad．Sci．USA88，11460-1146462．Chou，T．C．和Lipmann，F(xiàn)．(1952)J．Biol．Chem．196，8963．Kaminski等人，(1993)NewEngl．J．Med．329，45964．Tomac等人(1995)自然373，335-33965．Gash等人(1996)自然380，252-25566．Hoffer等人(1994)NeuroscienceLett．182．107-11167．Duchen，L．W．和Strich，S．J．，(1968)J．Neuro1．Neurosurg．Psychiatry31，535-54268．Kennel等人(1996)NeurobiologyofDisease3，137-14769．Ripps等人(1995)Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92689-69371．Nicholson，L．等人(1995)Neuroscience66，507-52172．Beal，M．F．等人(1993)J．Neuroscience13，4181-419273．Davies，S．等人(1997)細胞90，537-54874．Hebr-Katz，R．(1993)Int．Rev．Imunol．9，237-28575．Borg等人(1990)BrainRes．，518，295-29876．Apfel等人(1991)Ann．Neurol．，29，87-9077．Noren，C．J．等人(1989)科學(xué)244，182-18878．Thorson，J．S．等人(1989)MethodsMol．Biol．77，43-7379．Das，A．K．等人(1997)J．Biol．Chem．272，11021-1102580．Berthiaume，L．&amp;Resh，M．D．(1995)J．Biol．Chem．270，22399-2240581．Raju，R．V．等人(1995)Mol．CellBiochem．149-150，pp．191-20282．Duronio，R．J．等人(1993)，蛋白的脂質(zhì)改性(LipidModificationofProteins)，M．J．Schlesinger編輯83．Krutsch，H．C．&amp;Inman，J．K．(1993)Anal．Biochem．209，109-11684．Heitz，J．R．等人(1968)Arch．Biochem．Biophys．12，627-63685．Stefanini，S．等人(1972)Arch．Biochem．Biophys．151．28-3486．Kawaguchi，A．J．(1981)Biochem．(Tokyo)89，337-33987．House，H．O．(1972)，現(xiàn)代合成反應(yīng)(ModemSyntheticReactions)W．A．Benjamin編輯所有上述文獻和出版物都在此并入作為參考。等同物雖然我們已經(jīng)描述了許多本發(fā)明的實施方案，但對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，上述基礎(chǔ)性的實施方案還可進行變化，形成可利用本發(fā)明組成和方法的其他實施方案。因此，可以理解的是，本發(fā)明的范圍包括所有在上述說明書中以及為所附權(quán)利要求書定義的替代性實施方案和變化，而且本發(fā)明不僅限于實施例中所述的具體實施方案。權(quán)利要求1.一種分離蛋白，其包含N-端氨基酸和C-端氨基酸，其中，所述蛋白選自于以下組中(a)帶有N-端胱氨酸的蛋白，在該胱氨酸上懸掛有至少一個疏水性基團；(b)帶有N-端氨基酸的蛋白，該氨基酸不是懸掛有至少一個疏水性基團的胱氨酸；以及(c)帶有至少一個取代N-端氨基酸的疏水性基團的蛋白。2.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，所述疏水性基團是至少包含一個疏水性氨基酸的肽。3.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，所述疏水性基團是脂質(zhì)。4.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白進一步包含替代或懸掛于C-端氨基酸的疏水性基團。5.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白是細胞外信號蛋白。6.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，所述N-端氨基酸是胱氨酸的官能衍生物。7.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白在N-端氨基酸和C-端氨基酸處都被改性。8.如權(quán)利要求4或7所述的蛋白，其中，所述蛋白具有取代或懸掛于至少一個氨基酸上的疏水性基團，該氨基酸在N-端和C-端氨基酸中間。9.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白具有取代或懸掛于至少一個氨基酸上的疏水性基團，該氨基酸在N-端和C-端氨基酸中間。10.如權(quán)利要求3所述的蛋白，其中，所述脂質(zhì)基團是選自于具有2-24個碳原子的飽和及不飽和脂肪酸的脂肪酸。11.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白是得自于脊椎動物的hedgehog蛋白。12.如權(quán)利要求11所述的蛋白，其中，所述hedgehog得自于人或者鼠。13.如權(quán)利要求11所述的蛋白，其中，所述脊椎動物hedgehog選自于以下組中Sonic、Indian和Deserthedgehog。14.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其進一步包括與疏水性基團相接觸的小泡。15.如權(quán)利要求14所述的蛋白，其中，所述小泡選自于以下組中細胞膜、微團和脂質(zhì)體。16.如權(quán)利要求11所述的蛋白，其中，所述蛋白具有根據(jù)SEQIDNOS1-4任意一個的氨基酸序列。17.如權(quán)利要求13所述的蛋白，其中，與野生型hedgehog蛋白相比，所述hedgehog蛋白由其C-端缺失1-10個氨基酸。18.如權(quán)利要求16所述的蛋白，其中，所述蛋白中至少60％的氨基酸與Sonic、Indian和Deserthedgehog相同。19.A-Cys-[Sp]-B-[Sp]-X形式的分離蛋白，其中A是疏水性基團，Cys是胱氨酸或其官能衍生物，[Sp]是任選的間隔肽序列，B是包括多個氨基酸、以及任選其他的間隔肽序列的蛋白；以及X是連接在蛋白B上的任選的其他疏水性基團。20.如權(quán)利要求19所述的分離蛋白，其中，所述分離蛋白是hedgehog蛋白。21.如權(quán)利要求20所述的分離蛋白，其中，如果X存在，則其是膽固醇。22.如權(quán)利要求19所述的分離蛋白，其中，蛋白B在至少一個其他氨基酸處被至少一個疏水性基團改性。23.如權(quán)利要求19所述的分離蛋白，其中，A-Cys連接是通過胱氨酸的氨基。24.如權(quán)利要求19所述的分離蛋白，其進一步包括與其相接觸的小泡。25.如權(quán)利要求24所述的分離蛋白，其中，所述與其相接觸的小泡選自于以下組中細胞膜、微團和脂質(zhì)體。26.連接有多個分子的小泡，其中所述多個分子中至少兩個具有如權(quán)利要求19所述的形式。27.如權(quán)利要求26所述的小泡，其中，所述小泡選自于以下組中細胞膜、脂質(zhì)體和微團。28.具有C-端氨基酸和N-端硫脯氨酸基團的分離蛋白，其中，所述基團是通過醛與所述蛋白的N-端胱氨酸的反應(yīng)而形成的。29.具有C-端氨基酸和N-端酰胺基團的分離蛋白，其中，所述基團是通過脂肪酸硫酯與所述蛋白的N-端胱氨酸的反應(yīng)而形成的。30.具有C-端氨基酸和N-端馬來酰亞胺基團的分離蛋白，其中，所述N-端馬來酰亞胺基團是通過馬來酰亞胺基團與所述蛋白的N-端胱氨酸的反應(yīng)而形成的。31.如權(quán)利要求28、29或30所述的分離蛋白，其中，所述蛋白的C-端氨基酸用疏水性基團改性。32.如權(quán)利要求31所述的分離蛋白，其中，所述蛋白是hedgehog蛋白。33.如權(quán)利要求32所述的分離蛋白，其中，所述C-端疏水性基團是膽固醇。34.產(chǎn)生多價蛋白復(fù)合物的方法，其包括以下步驟在小泡存在下將疏水性基團連接在蛋白的N-端胱氨酸、或者N-端胱氨酸的官能等價物上。35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述連接步驟包括連接選自于具有2-24個碳原子的飽和及不飽和脂肪酸中的脂質(zhì)基團。36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述蛋白是hedgehog蛋白。37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述hedgehog選自于以下組中Sonic、Indian和Deserthedgehog。38.如權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述hedgehog具有根據(jù)SEQIDNOS1-4任意一個的氨基酸序列。39.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述連接步驟包括與選自于細胞膜、脂質(zhì)體和微團中的小泡連接。40.改變蛋白的物理-化學(xué)性質(zhì)的方法，其包括在所述蛋白的N-端胱氨酸或者N-端胱氨酸的官能等價物上引入至少一個疏水性基團。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其進一步包括使疏水性基團與小泡相接觸。42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述疏水性基團是脂質(zhì)基團或者是疏水性蛋白，而所述脂質(zhì)基團選自于具有2-24個碳原子的飽和及不飽和脂肪酸。43.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述蛋白是hedgehog蛋白。44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述hedgehog蛋白選自于以下組中Sonic、Indian和Deserthedgehog。45.如權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述hedgehog具有根據(jù)SEQIDNOS1-4任意-個的氨基酸序列。46.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述接觸步驟包括與選自于細胞膜、脂質(zhì)體和微團中的小泡相接觸。47.根據(jù)如權(quán)利要求34所述的方法制備的蛋白復(fù)合物。48.根據(jù)如權(quán)利要求40所述的方法制備的改性蛋白。49.如權(quán)利要求47所述的復(fù)合物，其中，所述蛋白選自于以下組中凝溶膠蛋白、干擾素、白介素、腫瘤壞死因子、單細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、紅細胞生成素、血小板衍生的生長因子、生長激素和胰島素。50.改性具有生物活性并包含N-端胱氨酸的蛋白的方法，其包括使N-端胱氨酸與脂肪酸硫酯反應(yīng)形成酰胺，其中所述改性增加了所述蛋白的生物活性。51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述蛋白是hedgehog蛋白。52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中，所述hedgehog蛋白選自于以下組中Sonic、Indian、Deserthedgehog、以及它們的官能變體。53.改性具有生物活性并包含N-端胱氨酸的蛋白的方法，其包括使N-端胱氨酸與馬來酰亞胺基團反應(yīng)，其中所述改性增加了所述蛋白的生物活性。54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中，所述蛋白是hedgehog蛋白。55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中，所述hedgehog蛋白選自于以下組中Sonic、Indian、Deserthedgehog、以及它們的官能變體。56.改性具有生物活性的蛋白的方法，其包括在所述蛋白上懸掛疏水性肽。57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述疏水性肽懸掛在選自于以下組中的蛋白的氨基酸上N-端氨基酸、C-端氨基酸、在N-端氨基酸和C-端氨基酸之間的氨基酸、以及上述氨基酸的混合物。58.如權(quán)利要求69所述的方法，其中，所述蛋白是hedgehog蛋白。59.如權(quán)利要求71所述的方法，其中，所述hedgehog蛋白選自于以下組中Sonic、Indian和Deserthedgehog。60.如權(quán)利要求1或20之一所述的蛋白的治療用途，其包括向宿主給藥所述蛋白。61.治療患者中神經(jīng)疾病的方法，其包括向所述患者給藥如權(quán)利要求1或20之一所述的蛋白。62.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白是細胞外信號蛋白。63.如權(quán)利要求57所述的方法，其中，所述懸掛步驟包括用至少一個疏水性氨基酸至少替換蛋白的N-端氨基酸。64.如權(quán)利要求63所述的方法，其中，所述至少一個疏水性氨基酸是多個異亮氨酸殘基。65.如權(quán)利要求63所述的方法，其進一步包括化學(xué)改性至少一個異亮氨酸殘基。66.具有C-端氨基酸和N-端乙酰胺基團的分離蛋白，所述基團是通過經(jīng)取代的乙酰胺與蛋白的N-端胱氨酸的反應(yīng)而形成的。67.具有C-端氨基酸和N-端硫代嗎啉基團的分離蛋白，所述基團是通過鹵代酮基與蛋白的N-端胱氨酸的反應(yīng)而形成的。68.改性具有生物活性并包含N-端胱氨酸的蛋白的方法，其包括使N-端胱氨酸與經(jīng)取代的乙酰胺基團反應(yīng)，其中所述改性增加了所述蛋白的生物活性。69.如權(quán)利要求68所述的方法，其中，所述蛋白是hedgehog蛋白。70.如權(quán)利要求69所述的方法，其中，所述hedgehog蛋白選自于以下組中Sonic、Indian、Deserthedgehog、以及它們的官能變體。71.改性具有生物活性并包含N-端胱氨酸的蛋白的方法，其包括使N-端胱氨酸與鹵代酮基反應(yīng)，其中所述改性增加了所述蛋白的生物活性。72.如權(quán)利要求71所述的方法，其中，所述蛋白是hedgehog蛋白。73.如權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述hedgehog蛋白選自于以下組中Sonic、Indian、Deserthedgehog、以及它們的官能變體。74.用一個或多個親脂性基團改性的hedgehog多肽，其條件是，如果所述hedgehog多肽是hedgehog蛋白的成熟N-端蛋白水解片段，則所述親脂性基團不是在C-端殘基處的固醇。75.在內(nèi)部氨基酸殘基處用一個或多個親脂性基團改性的hedgehog多肽。76.用一個或多個親脂性芳香烴改性的hedgehog多肽。77.如權(quán)利要求74-76之一所述的hedgehog多肽，該多肽是經(jīng)純制的蛋白制服劑。78.如權(quán)利要求74-76之一所述的hedgehog多肽，該多肽是藥物制劑。79.如權(quán)利要求74或75所述的hedgehog多肽，其中，所述親脂性基團選自于以下組中脂肪酸、脂質(zhì)、酯、醇、籠狀結(jié)構(gòu)、以及芳香烴。80.如權(quán)利要求76或79所述的hedgehog多肽，其中，所述芳香烴選自于以下組中苯、北、菲、蒽、萘、芘、屈和并四苯。81.如權(quán)利要求80所述的hedgehog多肽，其中，所述芳香烴是芘。82.如權(quán)利要求74或75所述的hedgehog多肽，其中，所述親脂性基團選自于以下組中類異戊二烯、萜和多脂環(huán)烴。83.如權(quán)利要求82所述的hedgehog多肽，其中，所述親脂性基團選自于以下組中金剛烷、富勒烯、維生素、聚乙二醇、寡聚乙二醇、(C1-C18)烷基磷酸二酯、-OCH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-烷基84.如權(quán)利要求83所述的hedgehog多肽，其中，所述親脂性基團選自于以下組中1-或2-金剛烷基乙?；?、3-甲基金剛烷-1-基乙?；?、3-甲基-3-溴-1-金剛烷基乙?；?-萘烷乙?；⒄聊X乙?；⑤ㄍ橐阴；?、降金剛烷基乙酰基、降冰片烷乙酰基、二環(huán)[2．2．2．]-辛-5-烯乙酰基、1-甲氧基二環(huán)[2．2．2]-辛-5-烯-2-羰基、cis-5-降冰片烯-內(nèi)-2，3-二羰基、5-降冰片烯-2-基乙?；?、(1R)-(-)-桃金娘烯烷乙?；?、2-降冰片烷乙?；?、抗-3-氧-三環(huán)[2．2．1．0&lt;2，6&gt;]-庚烷-7-羰基、癸?；?、十二烷?；?、十二烷烯酰基、十四烷二烯酰基、癸炔酰基或十二炔?；?。85.如權(quán)利要求74-76之一所述的hedgehog多肽，其中，相對于未經(jīng)改性的hedgehog多肽，所述親脂性基團增強所述多肽的生物活性。86.改變應(yīng)答hedgehog信號之細胞的生長狀態(tài)的方法，其包括使所述細胞與如權(quán)利要求74-76之一所述的經(jīng)親脂性改性的hedgehog多肽相接觸。全文摘要本發(fā)明涉及經(jīng)疏水性改性的蛋白及其制備方法。疏水性基團連接在蛋白的表面氨基酸殘基上。疏水性基團可以是脂質(zhì)或肽?；蛘?所述蛋白可通過在蛋白上懸掛疏水性結(jié)構(gòu)的各種活性反應(yīng)來衍生化,優(yōu)選的蛋白是哺乳動物的,并選自于以下組中:Sonic、Indian和Deserthedgehog。疏水性基團可用作方便的連接基團,在其上連接諸如細胞膜、脂質(zhì)體或微團的小泡。文檔編號A61K38/17GK1294595SQ98813447公開日2001年5月9日申請日期1998年12月3日優(yōu)先權(quán)日1997年12月3日發(fā)明者R·布萊克·佩平斯基,達倫·P·貝克,聞定一,凱文·P·威廉斯,埃倫·A·加伯,弗雷德里克·R·泰勒,阿方斯·加爾德斯,杰弗里·波特申請人:生物基因公司,昂托基尼公司