專利名稱:真菌疏水蛋白在生物芯片中的應用的制作方法
真菌 蛋白在生物芯片中的自技術領域:
本發(fā)明涉及一種新型天然生物材料的應用技術,特別涉及真菌疏水蛋白在生物芯片 中的細技術。背景技術:
1986年,Rosenberg和Kjelleberg小組在石開究細菌與寄主吸附機理時首先提出了 疏水蛋白這一概念,意指微生物細胞表面的ffiBT疏冰物質(zhì)(Wi呈,真菌疏冰蛋白的研,展, 微生物對艮,2001,4:518-521)。隨后,荷蘭Wessels研究小纟fl^裂鵬疏水蛋白SC系列進行了深 入研究,為疏水蛋白的研究方法開辟了新的思路(HAB. Wostea hterfacial Self-Assembly of a Fungal Hydrophobin into a Hydrophobic Rodlet Layer, PLANT CELL, 1993; 5: 1567), /Alttef"JC蛋白的研究 工作廣泛開展。真菌疏冰蛋白約含有100個氨基酸,針量大小為"10431/爾頓^£右,是一種分泌型的小分 子量蛋白質(zhì),可以在兩相界面M過自我裝配形成蛋白膜,改變介質(zhì)表面的性質(zhì)。疏水蛋白單體 具有八個位置相對保守的半胱氨酸位點,其中第二和第三個、第六和第七個半胱氨酸總是連 在一起, 一級結構可以表示如下X2-38~C~X5-9~C~C~Xi 1-39~"C~~X8-23~C~X5-9~C~C~~Xg-i8~~C—X2-i3根據(jù)7]C源性圖譜及裝配成的兩性蛋白膜的溶解性,征,疏水蛋白可以分為兩券I型和II型,i型疏冰蛋白膜具有高度的不溶解性,即f贓i(xrc水浴時ifc 隹溶解于2%SDS,僅在過氧甲酸和三氟乙酸等極少數(shù)有機輸i」中解聚,以裂褶菌(&fec;p;^"w cowww"e)中的SC3和雙f鵬 菇"gar^to/wmy)中的ABH1為代表;n型疏水蛋白膜則可以在很多溶劑中溶解,如可以溶 解于2%SDS和60%乙醇等,以瑞氏木霉(7Hcto&mra we犯z')中的HFBI及荷蘭榆樹病菌 (C^H'o加wa w/ra')中的ceratoulmin (CU)為代表。I型疏水蛋白不僅在子囊菌和擔子菌中廣泛存在,也有可能在接合菌中存在,而n型疏水蛋白僅在子囊菌中M^現(xiàn)。真菌疏冰蛋白具有在兩相界面處自我裝配 的,'14^,這使它含有很多潛在的應用價值。 例如,在食品制3t^Jl,疏冰蛋白可改善食品對抗相變能力在不通氣狀態(tài)下形成穩(wěn)定泡沫;在果 蔬保鮮方面,疏水蛋白可以在果蔬表面形成一層防腐保食徵膜,這層 不僅可以防止多種微生物對果蔬的侵害,由于!鵬本身狄食用真菌中提取出來的,因此可以直體用,不用除去,甚 為方便,彌補了保鮮 !^^技術的缺陷;在日用產(chǎn)品中,疏水蛋白可M自我裝配而將面部的 油月誇^7K的成他S^,再用7lC凊洗將其除去,也可以作為做頭發(fā)的天然膜,1撥部維持 清潔并保持一定水分;在固定化方面,疏水蛋白可以將蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)固定于各種類型的 介質(zhì)表面,例如,船K蛋白可以4敏脾固的固定在生物芯片的基片表面。發(fā)明內(nèi)容1本發(fā)明目的是,推出一種新型天然表面膜材料,應用于生物芯片的蛋白質(zhì)固定 化技術方面。II型真菌疏水蛋白瑞氏木霉疏i7K蛋白HFBI和I型真菌疏水蛋白灰樹花SfeK蛋白HGFI, iia X射線光電子魁普、f數(shù)蟲角及固定化能力的測定,證明其可以自鄉(xiāng)配形成蛋白膜包被于普通玻 璃等材料的表面,并t灘非特異性的將目的蛋白固定在芯片介質(zhì)上,與常規(guī)的基片處理相比,具 有操作簡便、包被均勻,點。本發(fā)明所述真菌疏水蛋白在生物芯片中的應用,利用真菌i^水蛋白具有在兩相界面處自我裝配^I莫的特殊'I4M,將真菌疏itK蛋白(包括含有真菌疏u7K蛋白成分或ii31真菌疏冰蛋白改告的材 料)自我裝配形成蛋白膜包被于芯片介M+才料的表面制成生物芯片,并旨,效的、非特異性的 與其它蛋白質(zhì)類生物大肝結合,應用于生物芯片的基片處理中。 所述的真菌疏水蛋白包括i型真菌疏水蛋白和n型真菌^[水蛋白。阮逸的I型真菌疏水蛋白為灰樹^E7乂蛋白HGFI。 戶/M的II型真菌^7jC蛋白為瑞氏木霉i^7jC蛋白HFBI。 在本發(fā)明的應用中,芯片介J^W料為普通玻璃、云母或PDMS。在本發(fā)明的應用中,真菌疏水蛋白包被于芯片介,料表面的處理方法為將疏水蛋白溶、液覆蓋芯片介mt才料表面上,平均^F方M^if冰蛋白的M量需大于0.01ng,掠干后真菌疏l7K蛋白即包被于芯片介Mt才料表面。真菌疏L7K蛋白固定化 媒的檢測方法為將包被i^K蛋白的芯片介i^才料進行微印記處理,固趙敏體,封閉后,力口入熒光稱己的:MD 鳥抗體顯色,艦熒光弓雖判斷雞抗體的固定情況。本發(fā)明的優(yōu)點和積極鄉(xiāng)本發(fā)明真菌疏水蛋白可以在兩相界面自^^SB,形成約10納米厚的兩性蛋白膜,其 效率 非常高,形成的兩性蛋白膜約10nm厚,竊克的疏冰蛋白足以形成一平方米大小的膜,驗于 物質(zhì)的表面。艦實^t現(xiàn),疏冰蛋白可以在兩相界面處自我裝配形成兩性蛋白膜,包被于PDMS、 普通玻璃、云,面,改變介質(zhì)表面的性質(zhì),同時疏水蛋白膜的另1面?zhèn)},效的、3粥異性 的與其它蛋白質(zhì)等生物大肝結合,{頓方便,翻于生物芯片的基片處理中。
1圖1是瑞氏木霉疏i7jC蛋白HFBI產(chǎn)品在PDMS表面 的撤蟲角測定圖;圖2是瑞氏木霉疏L7jC蛋白HFBI產(chǎn)品在普通玻諒表面 的撤蟲角測定圖;圖3是瑞氏木霉i^K蛋白HFBI產(chǎn)品在云母表面 的撤蟲角領啶圖;圖l、 2、 3中A^經(jīng)處理的介質(zhì),B是具有真菌疏L7jC蛋白j^的介質(zhì);圖4是瑞氏木霉疏L/K蛋白HFBI產(chǎn)品的固定化效果檢測圖;圖5是灰樹^7K蛋白HGFI的聚丙烯mr資鵬電泳檢測圖;圖6是灰樹 S^水蛋白HGFI的飛行質(zhì)譜檢測圖;圖7是灰樹^[水蛋白HGFI在PDMS表面成膜的接觸角測定圖;圖8是灰樹花疏水蛋白HGFI在普通自表面 的撤蟲角測定圖;圖9是灰樹ffifL水蛋白HGFI在云母表面成膜的接觸角測定圖;圖7、 8、 9中A是未經(jīng)處理的介質(zhì),8是具有真菌疏冰蛋白 的介質(zhì);圖10是灰樹ffi^水蛋白HGFI的固定化效果檢測圖。具體實Jfe^實施例i:瑞氏木霉n型真菌疏水蛋白在介質(zhì)表面成膜的f數(shù)蟲角檢測實驗材料為瑞氏木霉發(fā)酵菌絲中抽提得到的疏水蛋白HFBI產(chǎn)品,其中疏PK蛋白HFBI的含量 為19.5%, HFBI占總蛋白含量的98。^以上,產(chǎn)品中其它雜質(zhì)為灰份及無機鹽KC1等。將疏冰蛋白HFBI產(chǎn)品分別gM在PDMS膜、普通玻諒、云母的表面上,平均,方MM 水蛋白HFBI的鶴量需大于0.01ng,氮氣吹干后,fflii^fclC多次清,晾干,進行疏冰角的測 量,確定疏水蛋白HFBI的,能力。從圖1一3中可以看出,疏水蛋白產(chǎn)品包被的介質(zhì),其接觸角有明顯的變化,其中以疏l7K性的 PDMS 蝶最為明顯,疏水蛋白HFBI產(chǎn)品可以使PDMS膜的接觸角由原來的123.9°斷氐至51.0° (圖l),將普通玻璃的接觸角由原來的45.9°斷氐至13.9° (圖2),將云母的撤蟲角由原來的0。升 高至11.9° (圖3),說明疏水蛋白可以在SH種物質(zhì)表面皿,改變其原有的表面'M。 實施例2:瑞氏木霉n型真菌疏水蛋白HFBI的固定化效果檢測實驗材料為瑞氏木霉發(fā)酵菌絲中抽提得到的疏水蛋白HFBI產(chǎn)品,其中疏水蛋白HFBI的含量 為19.5%, HFBI占總蛋白含量的98X以上,產(chǎn)品中其它雜質(zhì)為灰份及無機鹽KC1等。將疏水蛋白HFBI產(chǎn)品SM在普通玻璃的表面上,平均^F方M^^ZK蛋白HFBI的覆蓋量需 大于0.01ng,氮氣吹干后,將IgG雞抗體艦微印記的方法點在表面,經(jīng)果BSA封閉后,用PBS 緩沖液洗滌,結合FITC熒光標記的MS敏體,艦熒光檢測,可以看到II型疏冰蛋白HFBI可 以將IgG雞抗體高效的固定在普通M的表面(圖4)。 實施例3:灰樹花真菌疏冰蛋白HGFI的提取將平EILi:歸的灰樹花菌絲切碎,艦2XSDS沸水浴除去菌絲表面的雜蛋白,Mil氯仿/甲醇除去 菌絲表面的酯類物質(zhì),冷凍千燥后,ilii三氟乙酸抽提灰樹花I型疏水蛋白HGFI,并用60%的乙 醇和超^7jC進行純化,得到I頓較高的灰樹花I型疏水蛋白HGFI,聚丙烯^f安 疑膠電泳(圖5) 可以看到一條8-9kDa的單帶,飛行質(zhì)譜(圖6,灰WKif冰蛋白HGFI的FT-ICR-MS檢測,"+"前 的數(shù)字為結合的質(zhì)子數(shù),HGF5+的峰值為1607.15,則成熟的HGFI ^ 量為(1607.15_l)x5=8030. 75 ± 0.03 Da)顯示其好量為8. lkDa,離很高。纟敏BCA試劑盒進行總蛋白定量,蛋白占總物 質(zhì)含量的60%以上。實施例4:灰樹花I型真菌疏水蛋白在介質(zhì)表面成膜的接觸角檢測實驗材料為實施例4中提取的灰樹花I型 feK蛋白HGFI。將灰樹花疏L7K蛋白HGFI分別覆蓋 在PDMS膜、普通玻蹢、云母的表面上,平均軒方jMM7JC蛋白HFBI的鶴量需大于0.01ng,氮氣吹干后,Mil^7K多次清洗后晾干,進行i^7K角的領懂,確定^7K蛋白HFBI的鵬能力。 從圖7—9中可以看出,疏水蛋白產(chǎn)品包被的介質(zhì),其撤蟲角均有一定的變化,i^K蛋白HGFI 可以使PDMS膜的撤蟲角由原來的123.9°降低至104.5°(圖7),將普通鵬的接觸角由原來的25.7° 升高至30.6° (圖8),將云母的撤蟲角由原來的0。升高至17.9。(圖9),說明疏冰蛋白可以在^H 種物質(zhì)表面鵬,改變其原有的表面'頓。 實施例5:灰樹花I型真菌疏《蛋白的固定化^m檢測實驗材料為實施例4中提取的灰樹花I型i^7jC蛋白HGFI。將灰樹花I型疏冰蛋白HGFI覆蓋 在普通玻諒的表面上,平均軒方厘^T冰蛋白HFBI的髓量需大于0.01ng,氮氣吹干后,將 IgG雞抗體ilil微印記的方法點在表面,經(jīng)果BSA封閉后,用PBS緩沖液洗滌,結合FITC熒光標 記的,敏體,皿熒光檢測,可以看到II型疏冰蛋白HFBI可以將IgG 7敏體高效的固定在 普通玻璃的表面(圖io)。
權利要求
1、一種真菌疏水蛋白在生物芯片中的應用,其特征在于,利用真菌疏水蛋白具有在兩相界面處自我裝配成膜的特殊性質(zhì),將真菌疏水蛋白、以及含有真菌疏水蛋白成分或通過真菌疏水蛋白改造的材料自我裝配形成蛋白膜包被于芯片介質(zhì)材料的表面制成生物芯片,并能夠有效的、非特異性的與其它蛋白質(zhì)類生物大分子結合,應用于生物芯片的基片處理中。
2、 根據(jù)權利要求i所述的應用,其特征在于所述的真菌疏水蛋白包括i型真菌疏L7jc蛋白和n型真菌疏L/K蛋白。
3、 根據(jù)^l利要求2戶腿的應用,,征在于阮悉的I型真菌疏水蛋白為灰樹 水蛋白HGFI。
4、 根據(jù)權利要求2所述的應用,其特征在于戶腐的n型真菌疏水蛋白為瑞氏木霉疏水蛋白 HFBI。
5、 根據(jù)權利要求M中任一項戶脫的鵬,辦征在于芯片介Mt賴斗為普通玻璃、魂或PDMS。
6、 根據(jù)權利要求14中任一項所逸的應用,其特征在于真菌疏冰蛋白包被于芯片介Mt才料表 面的處理方法為將疏水蛋白溶液SM在芯片介質(zhì)材料的表面上,平均OT方厘M[水蛋白的覆 蓋量需大于0. Olng, B京干后真菌疏i7JC蛋白即包被于芯片介J^料的表面。
7、 根據(jù)權利要求14中任一項戶/M的應用,其特征在于真菌疏u7jC蛋白固定化效果的檢測方法 為將包被疏冰蛋白的芯片介M^料進行微印記處理,固定X敏體,封閉后,力口入熒光標記的兔 撤敏體顯色,艦熒光3艘判斷雞抗體的固定瞎況。
全文摘要
真菌疏水蛋白在生物芯片中的應用。疏水蛋白是由絲狀真菌在特定時期分泌的一類小分子量、疏水性蛋白質(zhì),能在兩相界面處自我裝配形成兩性蛋白膜,利用真菌疏水蛋白的這種特性,將真菌疏水蛋白(包括含有真菌疏水蛋白成分或通過真菌疏水蛋白改造的材料)自我裝配形成蛋白膜,吸附、聚集于玻璃、云母、PDMS等芯片介質(zhì)材料的表面,使之能夠有效的、非特異性的與其它蛋白質(zhì)類生物大分子結合,應用于生物芯片的基片處理。通過X射線光電子能譜、接觸角及固定化能力的測定,證明其能夠非特異性的將目的蛋白固定在芯片介質(zhì)上,與常規(guī)的基片處理相比,具有操作簡便、包被均勻等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/48GK101216485SQ200810052098
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月18日 優(yōu)先權日2008年1月18日
發(fā)明者喬明強, 雷 于, 強 張, 徐海津, 王澤方 申請人:喬明強