一種蛋白質(zhì)樣品結(jié)晶篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白質(zhì)樣品結(jié)晶篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)結(jié)晶是蛋白質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程，它不僅為蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)與功能等的研究提供了適宜的樣品，例如制備供X-射線衍射分析用的樣品，而且為較高純度的蛋白質(zhì)的獲得和應(yīng)用創(chuàng)造了條件。
[0003]影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的因素很多，主要有蛋白質(zhì)的純度和濃度、結(jié)晶溫度、結(jié)晶時間、PH值、鹽離子濃度、金屬離子等，結(jié)晶條件的篩選無規(guī)律可循，需要對結(jié)晶條件進(jìn)行大量的不斷的嘗試和摸索，并且一種成功的結(jié)晶條件一般只對幾種甚至一種蛋白質(zhì)有效，因此篩選蛋白質(zhì)結(jié)晶條件，尤其是篩選能夠滿足X-射線衍射分析用的高質(zhì)量晶體的結(jié)晶條件相當(dāng)困難。
[0004]微流控技術(shù)是現(xiàn)今國際高新科技前沿領(lǐng)域之一，在蛋白質(zhì)結(jié)晶及其篩選研究中的應(yīng)用取得了快速發(fā)展，已逐漸成為蛋白質(zhì)結(jié)晶微型化研究最有潛力的發(fā)展方向之一。它采用微機(jī)電技術(shù)加工出具有微米尺度通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的芯片，通過對芯片中皮升至納升級微流體的操縱和控制，實現(xiàn)生物醫(yī)學(xué)和化學(xué)實驗室的集成化分析檢測功能?；瑒有酒?SlipChip)技術(shù)就是微流控技術(shù)的一種，由具有微結(jié)構(gòu)的上下兩塊基片組成，下層基片加工蛋白質(zhì)樣品引入通道和用于儲存待篩選沉淀劑的微腔，上層基片加工待篩選沉淀劑的引入通道和用于儲存蛋白質(zhì)樣品的微腔，實驗中通過上下基片相互滑動的方法，使上層基片各微腔中的蛋白質(zhì)溶液分別與下層基片中各微腔內(nèi)的沉淀劑接觸，形成很多個密閉的結(jié)晶反應(yīng)室。
[0005]但是現(xiàn)有的滑動芯片未見圓形，不易固定和操作；未能實現(xiàn)同時進(jìn)行多參數(shù)的系統(tǒng)性結(jié)晶條件篩選；且未有滑動芯片提及可以實現(xiàn)原位結(jié)晶條件的優(yōu)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供了蛋白質(zhì)樣品結(jié)晶篩選方法，該篩選方法操作簡便，可實現(xiàn)多個參數(shù)組合進(jìn)行篩選，有效地實現(xiàn)了批量篩選過程，大大降低了試驗操作強度，而且節(jié)約了樣品和試劑的消耗量，降低了實驗成本。
[0007]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0008]—種蛋白質(zhì)樣品結(jié)晶篩選方法，其特征在于:該篩選方法采用玻璃材質(zhì)的篩選器，
[0009]所述篩選器包括相互貼合的下底板和上轉(zhuǎn)板，上轉(zhuǎn)板呈圓形，可繞圓心作包括指定三個角度的旋轉(zhuǎn)，在下底板的上貼合面上開設(shè)各種開口向下的凹槽流道、微腔，在上轉(zhuǎn)板的下貼合面上開設(shè)各種開口向上的凹槽流道、微腔，以及一些進(jìn)、出口通孔，所述的凹槽流道、微腔可由化學(xué)蝕刻方式開設(shè)，且均為微米級；
[0010]所述上轉(zhuǎn)板旋轉(zhuǎn)三個角度之一，起始點凹槽位置:
[0011]所述下底板和上轉(zhuǎn)板上開設(shè)的凹槽流道、微腔，以圓心為中心，呈幅射狀排列L個形狀相同的扇形單元，每個扇形單元由中心向周邊分割為M個徑向小單元，每個徑向小單元又由N個微單元組成；優(yōu)選的，所述L = 8?15、M = 4?8、N = 4?8。
[0012]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述L為10。
[0013]所述扇形單元的左右兩側(cè)分別開設(shè)從圓心向圓周走向的蛋白質(zhì)進(jìn)樣通道和從圓周至圓心的沉淀劑進(jìn)樣通道。所述通道俯視呈首尾相接的S字形，分別有與周向方向一致MXN個橫式的蛋白質(zhì)微腔和沉淀劑微腔，每對蛋白質(zhì)微腔和沉淀劑微腔位于同一直徑處，交替在微腔左右兩側(cè)有與徑向方向一致的引入流道。
[0014]將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)樣口設(shè)于圓心處，將蛋白質(zhì)樣品出樣口設(shè)于圓周邊；另一側(cè)通道的沉淀劑進(jìn)樣口進(jìn)口位設(shè)于圓周邊，沉淀劑出樣口位于圓心處；兩個進(jìn)口和兩個出口均位于上轉(zhuǎn)板且為通孔；當(dāng)一側(cè)通道的微腔位于下底板上，則該微腔兩側(cè)的引入流道位于上轉(zhuǎn)板上，在該位置上、下板上的凹槽相互流通；此時，另一側(cè)通道的微腔位于上轉(zhuǎn)板上，該微腔兩側(cè)的引入流道位于下底板上，上、下板上的凹槽也相互流通，構(gòu)成蛋白質(zhì)進(jìn)樣通道和沉淀劑進(jìn)樣通道；
[0015]每個扇形單元中的蛋白質(zhì)微腔隨所處位置半徑增大體積不變，但徑向?qū)挾茸冃?、弧長變長；各徑向小單元的沉淀劑微腔隨所處位置半徑增大按一定關(guān)系變大；
[0016]所述上轉(zhuǎn)板旋轉(zhuǎn)三個角度之二，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)進(jìn)入滑動控制點凹槽1:
[0017]所述扇形單元兩側(cè)通道的微腔與引入流道錯位，凹槽相互阻斷，此時，各組的蛋白質(zhì)微腔和沉淀劑微腔在弧長上有部分重合形成密閉的結(jié)晶反應(yīng)腔；
[0018]在此位置，選擇部分相鄰兩個結(jié)晶反應(yīng)腔為一組，在該組兩結(jié)晶反應(yīng)腔之間的下底板上開設(shè)徑向的蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)通道，所述蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)通道徑向兩端與兩結(jié)晶反應(yīng)腔之間留有h距離，相鄰兩結(jié)晶反應(yīng)腔位于上轉(zhuǎn)板的微腔，在位于蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)通道的旋轉(zhuǎn)上游位置各相向伸出一段銜接流道，銜接流道的長度大于等于h，在位于兩銜接流道之間開設(shè)蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)孔，該孔為通孔，通孔外表備有密封蓋；
[0019]所述上轉(zhuǎn)板旋轉(zhuǎn)三個角度之三，如發(fā)現(xiàn)微腔中存在蛋白質(zhì)沉淀或微晶體，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)進(jìn)入滑動控制點凹槽I1:
[0020]兩銜接流道與蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)通道徑向接通，所述蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)孔位于蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)通道的上方。
[0021]其篩選方法分為:
[0022](A)、將上轉(zhuǎn)板旋轉(zhuǎn)至起始點凹槽位置，固定下底板和上轉(zhuǎn)板，形成蛋白質(zhì)樣品溶液引入通路和沉淀劑溶液引入通路；向蛋白質(zhì)樣品進(jìn)樣口注入蛋白質(zhì)樣品溶液，向沉淀劑進(jìn)樣口注入沉淀劑溶液，使得各通路充滿溶液；
[0023]在沉淀劑篩選實驗中，蛋白質(zhì)樣品進(jìn)樣口只注入一種蛋白質(zhì)樣品溶液，不同的沉淀劑進(jìn)樣口可注入不同的沉淀劑溶液，形成多因素交叉篩選；
[0024](B)、將上轉(zhuǎn)板旋轉(zhuǎn)至起凹槽I位置，固定下底板和上轉(zhuǎn)板，微腔與引入流道錯位，儲存蛋白質(zhì)樣品的微腔與儲存沉淀劑的微腔相連，形成若干個適合結(jié)晶的密閉反應(yīng)腔，反應(yīng)腔內(nèi)進(jìn)行結(jié)晶反應(yīng)；
[0025]各反應(yīng)腔中分別具有不同的結(jié)晶條件，包括沉淀劑種類、蛋白質(zhì)樣品與沉淀劑比例(即蛋白質(zhì)樣品的濃度)和結(jié)晶速率，間隔一定時間后對芯片中各結(jié)晶反應(yīng)腔內(nèi)的結(jié)晶情況進(jìn)行觀察，確認(rèn)是否有結(jié)晶出現(xiàn)，以此篩選結(jié)晶條件或決定是否要對結(jié)晶條件進(jìn)行一步優(yōu)化。
[0026]由于蛋白質(zhì)水溶液化學(xué)勢高于沉淀劑的化學(xué)勢，蛋白質(zhì)樣品溶液中的水分子進(jìn)入沉淀劑，實現(xiàn)蛋白質(zhì)樣品溶液達(dá)到過飽和狀態(tài)，使得蛋白質(zhì)樣品從溶液中逐漸析出，形成晶體。而蛋白質(zhì)樣品與沉淀劑接觸通道長度直接影響了蛋白質(zhì)樣品溶液達(dá)到過飽和的速率，即影響了晶體形成的速率，此速率較大程度影響著晶體形成的概率及其質(zhì)量。
[0027](C)、確認(rèn)反應(yīng)腔中是否有結(jié)晶出現(xiàn)，如出現(xiàn)結(jié)晶，則篩選結(jié)果完成；如步驟⑶中的某個反應(yīng)腔中出現(xiàn)沉淀或具有多個微小的晶體，需重新結(jié)晶，繼續(xù)轉(zhuǎn)動上轉(zhuǎn)板。
[0028](D)、將上轉(zhuǎn)板旋轉(zhuǎn)至起凹槽II位置，固定下底板和上轉(zhuǎn)板，蛋白質(zhì)樣品濃度調(diào)節(jié)孔、蛋白質(zhì)樣品濃度調(diào)節(jié)通道與結(jié)晶反應(yīng)腔接通；向蛋白質(zhì)樣品濃度調(diào)節(jié)孔中加入超純水，以密封蓋密封蛋白質(zhì)樣品濃度調(diào)節(jié)孔，超純水的化學(xué)勢偏高，超純水?dāng)U散至結(jié)晶反應(yīng)腔中，沉淀或微晶體全部溶解；
[0029](E)、將上轉(zhuǎn)板旋轉(zhuǎn)至起凹槽I位置，固定下底板和上轉(zhuǎn)板，使結(jié)晶反應(yīng)腔與蛋白質(zhì)樣品濃度調(diào)節(jié)通道分離，結(jié)晶反應(yīng)腔再次呈密閉狀態(tài)，結(jié)晶反應(yīng)腔中進(jìn)行結(jié)晶反應(yīng)。
[0030](F)、確認(rèn)反應(yīng)腔中是否有結(jié)晶出現(xiàn)，如出現(xiàn)結(jié)晶，則篩選結(jié)果完成；如步驟(E)中的某個反應(yīng)腔中出現(xiàn)沉淀或具有多個微小的晶體，需重新結(jié)晶，重復(fù)步驟(D)和(F)。
[0031]由于超純水的擴(kuò)散，在結(jié)晶反應(yīng)腔中，整個反應(yīng)體系的溶液濃度降低，使得蛋白質(zhì)樣品溶液趨于過飽和狀態(tài)的進(jìn)程放慢，即蛋白質(zhì)結(jié)晶速率進(jìn)程變慢，讓獲得更大體積且晶形更加完整的蛋白質(zhì)晶體成為可能。
[0032]所述扇形單元中M個徑向小單元沉淀劑微腔的容積之比為一等比數(shù)列。優(yōu)選的，所述M為5，5個沉淀劑微腔的容積之比，隨所處位置半徑變小依次為4:2:1:0.5:0.25。
[0033]所述所述蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)的反應(yīng)溫度為4°C或25°C。
[0034]所述固定下底板和上轉(zhuǎn)板的方法為，在上轉(zhuǎn)板的上方配置轉(zhuǎn)動環(huán)，所述轉(zhuǎn)動環(huán)為在一圓環(huán)上固定四根垂直圓環(huán)面的細(xì)針，在上轉(zhuǎn)板上開設(shè)相應(yīng)的針孔，