dhF :5,-GGGGTACCATGATCATAGGGGTTCCT-3，（ΚρηI)
[0072] PBsadhR :5'-CCGCTCGAGTTAAGCACCCGCCACAGATG-3'（Xho I)
[0073] PScvdhF :5'-GGAATTCCATATGGTGACCGACGTAAACGG-3'（Nde I)
[0074] PScvdhR :5'-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3'（Xho I)
[0075] [3]利用枯草芽孢桿菌及天藍(lán)色鏈霉菌DNA作為模板做PCR擴(kuò)增得到基因。PCR 擴(kuò)增體系：模板 2yL，上下游引物各 0· 5yL，dNTPMix4yL，10XExTaqBuffer5yL，滅 菌ddH20 37yL，ExTaqDNA聚合酶lyL。PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性，5min，一個(gè)循環(huán)；94°C 變性，lmin，56°C退火，lmin，72°C延伸，lmin3〇8,30個(gè)循環(huán)；72°(：，1〇1^11，一個(gè)循環(huán)；15°(：， lOmin，一個(gè)循環(huán)。采用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的 濃度?；厥债a(chǎn)物存放在1. 5mL的離心管中，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0076] [4]構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-Bsadh/pMD18-T-Scvdh，導(dǎo)入感受態(tài)E.coliJM109。PCR 膠回收產(chǎn)物連接克隆載體PMD18-T，其中連接體系中連接緩沖液加酶5μL，基因4. 8μL， PMD18-T0. 2μL，16°C過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coilJM109,轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[6]，轉(zhuǎn) 化產(chǎn)物涂布含氨芐霉素的LB平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取菌落到10mL液體LB培養(yǎng)基中， 37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pMD18-T-Ppglcdh/pMD18-T-Bsadh/pMD18-T-Scvdh， 經(jīng)酶切驗(yàn)證連接成功后，將菌液加入甘油于_70°C冰箱保藏。
[0077] [5]將實(shí)施例[3]中提取的質(zhì)粒pMD18-T_fdh和表達(dá)載體pET-duet分別用 BamHI和SalI進(jìn)行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行連接。將連接好的重組質(zhì)粒 pET-duet-fdh轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coliBL21，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[6]，用氨芐霉素抗性平板 篩選陽(yáng)性克隆。37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后保藏菌種，-40°C冰箱保藏 備用。
[0078] [6]將[4]中提取的質(zhì)粒pMD18-T_Bsadh和表達(dá)載體pET-duet-fdh分別用 ΚρηI和XhoI進(jìn)行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行連接。將[4]中提取的質(zhì)粒 pMD18-T-Scvdh和表達(dá)載體pET-duet-fdh分別用NdeI和XhoI進(jìn)行雙酶切，利用凝膠回收 試劑盒回收后進(jìn)行連接。將連接好的重組質(zhì)粒pET-duet-fdh+Bsadh/pET-duet-fdh+Scvdh 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coliBL21，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[6]，用氨芐霉素抗性平板篩選陽(yáng)性克隆。 37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后保藏菌種，_40°C冰箱保藏備用。
[0079] 實(shí)施例5:重組質(zhì)粒pET-28a-Ecltd/pET-28a_Seltd的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 [0080] [1]以大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)（氏）菌的基因組DNA作為模板。
[0081] [2]根據(jù)大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)（氏）菌的L-蘇氨酸脫氨酶基因序列以及pET_28a 質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)ltd基因引物。
[0082] PEcltdF :5'-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3'（BamH I)
[0083] PEcltdR :5'-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3'（Hind III)
[0084]PSeltdF:5'-ACCGGGATCCATGGCGGAATCTCAACCTCT-3'（BamH I)
[0085] PSeltdR :5'-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAGAAAGAACC-3'（Hind III)
[0086] [3]利用大腸桿菌及鼠傷寒沙門(mén)（氏）菌DNA作為模板做PCR擴(kuò)增得到基因。PCR 擴(kuò)增體系：模板 2yL，上下游引物各 0.5yL，dNTPMix4yL，10XExTaqBuffer5yL，滅 菌ddH20 37yL，ExTaqDNA聚合酶lyL。PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性，5min，一個(gè)循環(huán)；94°C 變性，lmin，56°C退火，lmin，72°C延伸，lmin3〇8,30個(gè)循環(huán)；72°(：，1〇1^11，一個(gè)循環(huán)；15°(：，lOmin，一個(gè)循環(huán)。采用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的 濃度。回收產(chǎn)物存放在1. 5mL的離心管中，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0087] [4]構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-Ecltd/pMD18-T-Seltd，導(dǎo)入感受態(tài)E.coliJM109。 PCR膠回收產(chǎn)物連接克隆載體pMD18-T，其中連接體系中連接緩沖液加酶5μL，基因 4. 8yL，pMD18-T0. 2yL，16°C過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coilJM109,轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施 例[6]，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取菌落到10mL液體LB 培養(yǎng)基中，37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pMD18-T-Ecltd/pMD18-T-Seltd，經(jīng)酶切 驗(yàn)證連接成功后，將菌液加入甘油于_70°C冰箱保藏。
[0088] [5]將[4]中提取的質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-28a分別用BamHI和HindIII進(jìn)行 雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行連接。將連接好的重組質(zhì)粒pET-28a-Ecltd/ pET-28a-Seltd轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coliBL21，轉(zhuǎn)化方法參照實(shí)施例[6]，用卡那霉素抗性平 板篩選陽(yáng)性克隆。37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證正確后保藏菌種，-40°C冰箱保 減備用。
[0089] 實(shí)施例6 :大腸桿菌感受態(tài)的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
[0090] [1]大腸桿菌感受態(tài)的制備。將單克隆大腸桿菌于10mlLB培養(yǎng)基中活化，之后 轉(zhuǎn)接于37°C振蕩培養(yǎng)至0D_0. 35即可制備感受態(tài)；將培養(yǎng)好的菌液置于冰水中，輕輕搖晃 使菌液迅速冷卻約lOmin;準(zhǔn)備滅好菌的1. 5ml離心管若干個(gè)，分裝菌液于管中，每管裝菌 量1. 2ml，將離心管放置于冰中；菌液離心8000r/min10-20s，冰水中靜置2min，棄上清，加 入預(yù)冷好的〇. 1MCaCl2400μL，輕輕吹吸懸浮液，放入冰中15min(該步驟重復(fù)2-3次）；最 后，每管菌液離心棄上清后加入預(yù)冷好的0. 1MCaCl280μL，輕輕吹吸懸浮菌液放入冰中。
[0091] [2]質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。取[1]制備好的感受態(tài)細(xì)胞，加入需要轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒，輕輕反復(fù)吹 吸，并在冰中放置45min;將離心管放入42°C水浴鍋準(zhǔn)確放置90s，然后取出迅速放入冰中 5min;加入LB培養(yǎng)基800μL，輕輕混合，37°C搖床培養(yǎng)1-1. 5h;菌體離心2min，棄大部分上 清，再重新吹吸懸浮，取200μL于目標(biāo)抗性平板，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出之 后提質(zhì)粒驗(yàn)證。
[0092] 實(shí)施例7 :重組菌的發(fā)酵培養(yǎng)基
[0093] [1]LB基（g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl10。
[0094] [2]TB基（g/L):甘油 4,胰蛋白胨 12,酵母提取物 24,Κ2ΗΡ0412· 5,ΚΗ2Ρ042· 3， MgS040 . 2,pH7· 0-7. 2。
[0095] [3]TY基（g/L):葡萄糖 10,胰蛋白胨 10,酵母提取物 5,NaCl3,K2HP046,KH2P043， 檸檬酸鈉 1，MgS040 . 2,pH7· 0-7. 2。
[0096] [4]TYG基（g/L):甘油10,胰蛋白胨10,酵母提取物5,Κ2ΗΡ046,ΚΗ2Ρ043,檸檬酸鈉 1，MgS040 . 2,pH7. 0-7. 2。
[0097] [5]6?基&/1):葡萄糖30，酵母提取物5，1(2即046，腿 2?043，檸檬酸鈉1，1%3040 . 2， pH7. 0-7. 2 〇
[0098] 實(shí)施例8 :串聯(lián)甲酸脫氫酶及L-亮氨酸脫氫酶重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)α-氨基丁酸
[0099] [1]將重組菌pET-28a-Ecltd/BL21和串聯(lián)有L-亮氨酸脫氫酶的 pET-28a-fdh+Bc1dh/BL21利用LB培養(yǎng)基活化，37 °C、160r/min培養(yǎng)過(guò)夜后分別轉(zhuǎn)接于 100mlTB基、TY基、TYG基及GP基中。接種量1%，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速160r/min。 培養(yǎng)至〇D6。。約0. 6~0. 8時(shí)加入終濃度為lmmol/L的IPTG，置于16°C搖床24h誘導(dǎo)表 達(dá)。進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，取不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的菌液，4°C，8000r/min離心lOmin收 集菌體，用100mLpH7. 0的50mMPB緩沖液洗滌二次，分別將pET-28a-Ecltd/BL21和 pET-28a-fdh+Bcldh/BL21兩種重組大腸桿菌共同重懸于100mL的50mMPB緩沖液中。向該 體系中投入〇. 8ML-蘇氨酸和0. 8M甲酸銨及0. 1% (v/v)tween-80,置30°C搖床中繼續(xù)培 養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中每隔〇. 5h加入20%甲酸或5M氨水以保持反應(yīng)液pH為6. 0-8. 0。分不同時(shí) 間取樣，離心并用0. 22μm濾膜過(guò)濾后經(jīng)HPLC分析。
[0100] HPLC分析條件：在EP管中依次加入轉(zhuǎn)化液樣品200μL，衍生劑400μL(取10mg 鄰苯二甲醛+〇.5ml無(wú)水乙醇，再加入2mlpH9. 5的0.1Μ硼砂緩沖液及50μL2-巰基 乙醇），混勻后等待2分鐘加入400μL0. 1ΜΚΗ2Ρ04緩沖液，嚴(yán)格控制時(shí)間和試劑添加量，