一種雞油菌的dna條形碼標準基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及物種鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種雞油菌的DNA條形碼標準基因及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞油菌復合種(SkwiAsreUiAs·ciAariiA?speciescomplex(CCSC)是全球最重要 的野生食用菌之一，是一種食藥兼用的珍稀物種，為全球六大菌根食用菌之一。在云南又 名黃絲菌、黃花蘑、黃菌、黃食菌、杏菌、蛋黃菌、雞蛋黃、伏菌子等。全球雞油菌類群的產(chǎn)值 每年超過10億美元。云南是雞油菌的一個重要產(chǎn)地，然而在需求的促進下，即使在雞油菌 收獲旺季，新鮮的雞油菌子實體價格也高達250元/kg。近年來由于生境破壞嚴重，野生菌 的過度采摘現(xiàn)象越來越嚴重，人工培育技術(shù)尚未建立，導致市場供應(yīng)量降低，雞油菌市場上 不良商販以次充好、以假充真的現(xiàn)象屢見不鮮。另一方面，由于對雞油菌資源缺乏系統(tǒng)的認 知，國內(nèi)外市場銷售種類魚目混雜，優(yōu)劣不等，導致低價出口，實際價值未能真實體現(xiàn)。不僅 如此，由于公眾缺乏對雞油菌的鑒別能力，食用毒蘑菇導致死亡的事件時有發(fā)生。由于形態(tài) 結(jié)構(gòu)極為相近，且雞油菌子實體顏色變化上具有很強的連續(xù)性，因此僅依靠形態(tài)進行的物 種劃分具有了較強的人為性。目前，暫以雞油菌復合種（CCSC)來定義那些形態(tài)上難以區(qū)分 的物種，CCSC包含以下的 21 個種：CCtewi/iiArix,C C. ferruginascens, C. ame thys teus, C. lewisii，C· lateritius，C· confluens，C. spectaculus，C. roseocanus，C. flavus，C. phasmatis，C· Isabel linus, C. tomentosus，C. avellaneus，C. tabernensis，C. appalachiensis，C. decolorans，C· tere/Lsis, 和eiAariiAs。其中 這個種就是我們常吃的 雞油菌，具有較高的食用、藥用價值以及經(jīng)濟價值，并在維持和保護森林生態(tài)多樣性中具有 重要作用。但由于雞油菌復合種外部形態(tài)特征變異較大，而可用的顯微特征不多，這對區(qū)分 不同的種帶來一定的困難，尤其要將CciAarii/s與復合種內(nèi)另外二十個近緣種區(qū)分開來 更加困難。因此，急需建立其分子鑒定方法，通過形態(tài)型劃分與分子數(shù)據(jù)分析相結(jié)合的方法 來解決其鑒別和分類問題，并通過這些分子數(shù)據(jù)研究其遺傳多樣性，為其種質(zhì)資源的保護 和利用提供科學依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為克服形態(tài)學鑒定雞油菌存在的缺陷，本發(fā)明提供了雞油菌分子鑒定的標準基因 序列及鑒定方法，可以快速準確地將該物種從易混淆物種或復合種中鑒定出來，為雞油菌 的種質(zhì)資源挖掘、保護和利用提供有力的研究工具。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種雞油菌的DNA條形碼標準基因，所述DNA條形碼標準基因序列SEQIDNO. 1 :GAGAGGAGCGACTAAGGTGCACCTCACTGCACCCATGTCTATACATCACCTCTCTGCTTGCTTATAGAATT TATTATGTCTGGCGTGGTTCACTTGCGCCATCCGTCTATCATCCACCATCATGGTCATTGCCCATATACTGACTAC TCATTTCTCTATGTTACCGTGGTCGAAAACTCGCAATAGTCGGATCATGCTTTCATTGAACGTCTCAAACATATACG TGATGTCAAGGTTCGAATGGCAAAGGTCCACGACCACTGCAAGGGCAAGATGATTTGTGACGCCACCGAGCCGGAGC TTGACGGTGATGGCCAGCCTTTGCCAGTTCTGGATGCGTTAACAAAGATTGGTTGTGGTCACGTTCAACCCTCGATC CGTAAAGAAGGTTTGAAATTATTTATGGTGTATAAGAAGTCAAAAGATGAGGATGAGCAGGTGTGTGCCCTGCCTCC TTTTTTTTCAAGTATGATCGACCTGTGTTGCAGGACATGCGATTGGCCTTGCCAGACAAGCGCCTGTTCACGGCTTT GGAGGTCTACAACAACTTGCGCAAGATATCCGATGAACATCTTGAGCTTATGGGGTTATCTGTGGAATATGCTCGAC CTGAATGGATGATACTTACTG〇
[0005] 應(yīng)用所述的標準基因進行分子鑒定的方法，包括以下4個步驟： (1)從樣品組織中分離提取基因組DNA; ⑵以步驟（1)所提取的基因組DNA為模板，用雞油菌RPB1特異性引物，進行聚合酶 鏈式反應(yīng)； (3) 對步驟（2)擴增得到的DNA產(chǎn)物進行測序； (4) 將測序結(jié)果進行手工拼接，與所述基因序列RPB1的進行同源性比對，若同源性在 99%以上，即可將該樣品鑒定為雞油菌（(SkwiAareWiAs·ciAariiA?)。
[0006] 進一步，所述RPB1特異性引物序列為： 正向引物RPB1-S5' -TTTGGGCGGTGAGGACTA-3'， 反向引物RPB1-A5'-GTGGGACGGGTAAGACAG-3' ； 進一步，所述聚合酶鏈式反應(yīng)中，其擴增條件為95°C預(yù)變性3min，接下來94°C變性 30s，50°C退火1min，72°C延伸1. 5min，一共進行30-35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0007] (1)根據(jù)DNA條形碼技術(shù)原理，采用PCR擴增方法，確保條帶的純度及可靠性。測 序結(jié)果通過手工校對、序列拼接，并確保所得序列為標準序列。從采集的雞油菌樣品提取基 因組DNA，利用引物進行聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)擴增出樣品的RPB1基因，將擴增產(chǎn)物測序后 分析比對，優(yōu)選SEQIDNO. 1引物序列擴增樣品的RPB1基因序列片段作為標準基因。為了 實現(xiàn)上述目的，一種用于雞油菌分子鑒定標準檢測基因如下所述的基因序列SEQIDNO. 1 : GAGAGGAGCGACTAAGGTGCACCTCACTGCACCCATGTCTATACATCACCTCTCTGCTTGCTTATAGAATT TATTATGTCTGGCGTGGTTCACTTGCGCCATCCGTCTATCATCCACCATCATGGTCATTGCCCATATACTGACTAC TCATTTCTCTATGTTACCGTGGTCGAAAACTCGCAATAGTCGGATCATGCTTTCATTGAACGTCTCAAACATATACG TGATGTCAAGGTTCGAATGGCAAAGGTCCACGACCACTGCAAGGGCAAGATGATTTGTGACGCCACCGAGCCGGAGC TTGACGGTGATGGCCAGCCTTTGCCAGTTCTGGATGCGTTAACAAAGATTGGTTGTGGTCACGTTCAACCCTCGATC CGTAAAGAAGGTTTGAAATTATTTATGGTGTATAAGAAGTCAAAAGATGAGGATGAGCAGGTGTGTGCCCTGCCTCC TTTTTTTTCAAGTATGATCGACCTGTGTTGCAGGACATGCGATTGGCCTTGCCAGACAAGCGCCTGTTCACGGCTTT GGAGGTCTACAACAACTTGCGCAAGATATCCGATGAACATCTTGAGCTTATGGGGTTATCTGTGGAATATGCTCGAC CTGAATGGATGATACTTACTG。
[0008] (2)樣品的鑒別：通過將待鑒別的樣品序列與標準基因進行比對，基于同源性和基 于聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設(shè)立鑒定規(guī)則來鑒別物種，獲得序列間的相似性，相似度最高 或匹配度最高或遺傳距離最近的對應(yīng)物種即為待鑒別的物種；具體如下： a.基于同源性鑒定規(guī)則來鑒別物種 根據(jù)測序結(jié)果，如果與所述基因序列SEQIDNO. 1的同源性在99%以上，即可判斷所述 的待測樣品為雞油菌（CciAarii/6·)。
[0009] b.基于聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設(shè)立鑒定規(guī)則來鑒別物種 將標準基因序列和待