迷迭香體胚發(fā)生再生體系建立方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及以迷迭香成熟胚為材料建立再生體系的方法，包括三個培養(yǎng)階段：(1)成熟胚剝離后培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織(2)愈傷組織繼代培養(yǎng)(3)愈傷組織中體細(xì)胞胚的發(fā)生和胚狀體發(fā)育成植株。在繼代培養(yǎng)中采用分步降低2，4-二氯苯氧乙酸濃度的方法，使體細(xì)胞胚的發(fā)生率高達(dá)63％，可做為迷迭香遺傳轉(zhuǎn)化和快繁技術(shù)體系。
【專利說明】迷迭香體胚發(fā)生再生體系建立方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及迷迭香離體培養(yǎng)再生體系建立的方法。具體講以迷迭香種子成熟胚為 外植體，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑建立再生體系的方法。屬于植物細(xì)胞工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 迷迭香（Rosmarinus officinalis)又名艾菊，唇形科迷迭香屬常綠灌木。有清涼 氣味和甜樟腦的氣息，還有提高和加強(qiáng)記憶功能。主要含有酚、酸、酮、萜等化合物，是目前 公認(rèn)高效抗氧化植物之一?？捎米飨懔险{(diào)味品、香水、洗發(fā)露原料，在保健飲料、口服液、化 妝品等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。迷迭香原產(chǎn)歐洲及地中海沿岸地區(qū)，現(xiàn)以法國、西班牙、意 大利、南斯拉夫、突尼斯、摩洛哥等國栽培較多，我國于上世紀(jì)80年代引入。迷迭香因種子 發(fā)育不良，種子萌發(fā)率極低，通常采用扦插育苗。目前，國內(nèi)外對迷迭香組織培養(yǎng)的研究較 少，通過體胚發(fā)生途徑再生體系建立未見報道。
[0003] 建立高頻、穩(wěn)定的植株再生體系是利用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行品種改良的前提。植株 再生體系是外源基因的良好受體，同時也是體細(xì)胞融合的基礎(chǔ)。深入研究迷迭香體細(xì)胞胚 的發(fā)生還將為迷迭香優(yōu)良無性系的繁殖和突變體篩選等研究奠定基礎(chǔ)，為細(xì)胞培養(yǎng)、原生 質(zhì)體培養(yǎng)生物制藥提供技術(shù)支撐。迷迭香高頻、穩(wěn)定再生體系的建立成為生物技術(shù)育種和 生物制藥的關(guān)鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是建立迷迭香的高頻再生體系。
[0005] 本發(fā)明是以迷迭香種子成熟胚為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，以此建立迷迭香再生體系的方 法。
[0006] 本發(fā)明通過離體培養(yǎng)迷迭香種子成熟胚建立了的再生體系，所獲得的再生植株性 狀均一、穩(wěn)定、效率高、易于遺傳工程操作。
[0007] 本發(fā)明的培養(yǎng)方法包括三個培養(yǎng)階段：（1)成熟胚切塊培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織（2)愈 傷組織繼代培養(yǎng)（3)愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚和胚狀體發(fā)育成植株，培養(yǎng)基中均含有蔗糖 30g/L，瓊脂7. Og/L，培養(yǎng)溫度18?22°C，光暗周期16h/8h，光強(qiáng)2500?3000勒克斯，相對 濕度70 % -80 %，每培養(yǎng)20d更換一次新鮮培養(yǎng)基。
[0008] 本發(fā)明三個階段的基本培養(yǎng)基是改良B5培養(yǎng)基（表一），在第（1)階段培 養(yǎng)中所用激素為〇. 5-1. 5mg/L6-芐基氨基腺嘌呤（6-BA)，1000-1500mg/L水解乳蛋 白（LH)，4.0-8.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D)，在第⑵階段的培養(yǎng)基中所用激 素為0? 01-0. 05mg/L2,4-D，0? 02-1. 0mg/L6-BA，在第（3)階段的培養(yǎng)基中所用激素為 0? 1-1. 0mg/L6-BA、0. l-3mg/L 奈乙酸 NAA、100-1000mg/L LH、0. 1-10. lmg/L 赤霉酸（AC)。
[0009] 本發(fā)明優(yōu)選的方法包括以下步驟（1)成熟胚切塊接種于添加4.0-5. 0mg/L2， 4-二氯苯氧乙酸、0.5-2.〇1^/16-芐基氨基腺嘌呤（6-84)和120〇11^/1水解乳蛋白（1^) 的培養(yǎng)基上；（2)誘導(dǎo)得到的愈傷組織第一次繼代培養(yǎng)于0. 4-0. 8mg/L2,4-二氯苯氧乙 酸、0. 5-1. 0mg/L6-芐基氨基腺嘌呤的培養(yǎng)基上；第二次繼代培養(yǎng)于0. 5-1. 0mg/L2,4-二 氯苯氧乙酸、0. 1-0. 5mg/L6-芐基氨基腺嘌呤的培養(yǎng)基上；第三次繼代培養(yǎng)于0. 1-0. 4mg/ L2,4-二氯苯氧乙酸、0.5-1. 5mg/L6-芐基氨基腺嘌呤的培養(yǎng)基上（3)繼代的愈傷組織在 400-600mg/L水解乳蛋白（LH)的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚并發(fā)育成植株。
[0010] 本發(fā)明方法的優(yōu)點在于
[0011] 1.此方法建立的再生體系，再生頻率達(dá)到63%，為高頻再生體系。
[0012] 2.此方法建立的再生體系，植株發(fā)育正常、穩(wěn)定，是良好的育種平臺。

【具體實施方式】
[0013] 在下面的實施例中進(jìn)一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
[0014] 實施例1
[0015] 本試驗采用由美國引進(jìn)的迷迭香種子，將迷迭香種子用室溫下的自來水浸泡 10?15小時，然后用70 %酒精表面滅菌2分鐘，無菌水沖洗2遍，接著用0. 1 %氯化汞 (HgC12)表面滅菌10分鐘，無菌水沖洗5遍，用鑷子和解剖刀剖出胚接種在含6-BA1. 3mg/ L，2,4-D4. 5mg/L，1200mg/L水解乳蛋白的改良B5培養(yǎng)基（表1)上。培養(yǎng)基中均含有蔗糖 30g/L，瓊脂7. Og/L。用lmol/L NaOH或HCl調(diào)pH值為5. 8?6. 2,高壓蒸汽滅菌20min，培 養(yǎng)溫度18?22°C，光暗周期16h/8h，光強(qiáng)2500?30001x，相對濕度70% -80%，每培養(yǎng)20 天更換新鮮培養(yǎng)基。5?7天開始出現(xiàn)愈傷，12天后愈傷快速生長。在附加6-BA1. 2mg/L，2， 4-D4. Omg/L和1500mg/L水解乳蛋白培養(yǎng)基愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)95 %。誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織， 第一次繼代培養(yǎng)基所用激素為2,4-D0. 5mg/L，6-BA0. 8mg/L，第二次繼代為2,4-D0. 8mg/L， 6-BAO. 3mg/L，第三次繼代為2,4-D0. 2mg/L，6-BA0. 6mg/L。經(jīng)過三次繼代愈傷組織為兩類， 15%為生長較慢的淡黃色膠狀粘性愈傷組織，85%為生長較快的黃綠色無粘性、顆粒狀松 散的愈傷組織，鏡檢為球形、細(xì)胞質(zhì)較濃的胚性愈傷組織。
[0016] 將繼代獲得的胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)到不加生長調(diào)節(jié)劑，附加600m/L水解乳蛋白的B5 培養(yǎng)基上，1月以后，觀測到體細(xì)胞胚的發(fā)生，發(fā)生率達(dá)63%。在附加600mg/L水解乳蛋白 的B5培養(yǎng)基上，愈傷組織經(jīng)繼代后能不斷生長，且不斷產(chǎn)生胚狀體，繼代8次后仍保持胚狀 體發(fā)生能力，從最初分化的20塊愈傷組織共產(chǎn)生約8600個胚狀體，平均每塊430個。成熟 胚狀體在相同培養(yǎng)基中萌發(fā)為具根、莖、葉結(jié)構(gòu)的完整小苗，成苗率63%。
[0017] 實施例2
[0018] 培養(yǎng)程序均按實施例1進(jìn)行，所不同之處在于第一階段在附加6-BA4. 5mg/L，2， 4-D4. 3mg/L 和 700mg/L，第二階段第一次繼代 2,4-DO. 8mg/L，6-BA 為 0? 9mg/L，第二次繼代 為 2,4-DO. 9mg/L，6-BA 為 0? 4mg/L，第三次繼代為 2,4-DO. 2mg/L，6-BA 為 0? 8mg/L，第三階 段將繼代獲得的胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)到不加生長調(diào)節(jié)劑，附加600mg/L水解乳蛋白的B5培養(yǎng) 基上進(jìn)行。
[0019] 表一：B5基本培養(yǎng)基（Gamborg等，1968)和改良培養(yǎng)基成分
[0020]

【權(quán)利要求】
1. 一種迷迭香體胚發(fā)生再生體系建立方法，其特征在于以迷迭香成熟胚為外植體進(jìn)行 培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述方法包括三個培養(yǎng)階段：（1)成熟胚切塊 培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織（2)愈傷組織繼代培養(yǎng)（3)愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚和胚狀體發(fā)育成植 株，培養(yǎng)基中均含有蔗糖30g/L，瓊脂7. Og/L，培養(yǎng)溫度18?22°C，光暗周期16h/8h，光強(qiáng) 2500?3000勒克斯，相對濕度70% -80%，每培養(yǎng)20d更換一次新鮮培養(yǎng)基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于本發(fā)明三個階段的基本培養(yǎng)基是改良B5培養(yǎng) 基，在第（1)階段培養(yǎng)中所用激素為0. 5-1. 5mg/16-芐基氨基腺嘌呤（6-BA)，1000-1500mg/ 1水解乳蛋白0^)，4.〇-8.〇11^/12,4-二氯苯氧乙酸（2,4-〇)，在第（2)階段的培養(yǎng)基中所 用激素為〇? 01-0. 05mg/12,4-D，0. 02-1. Omg/16-BA，在第（3)階段的培養(yǎng)基中所用激素為 0? 1-1. 0mg/16-BA、0. l-3mg/l 奈乙酸 NAA、100-1000mg/l LH、0. 1-10. lmg/1 赤霉酸（AC)。
【文檔編號】A01H4/00GK104335896SQ201310313914
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月25日
【發(fā)明者】楊學(xué)軍, 曾揚騰, 閆勇義 申請人:張家港芳香生物科技有限公司