鹵蕨離體再生體系建立的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種以孢子囊群為外植體的鹵蕨離體再生體系建立的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]
鹵蕨{Acrostichum auream L.)為??蕨科??蕨屬植物，分布于亞洲、非洲、美洲、大洋洲熱帶及亞熱帶地區(qū)。常生長(zhǎng)于海邊潮灘紅樹植物內(nèi)緣或潮汐能至的堤岸邊，是沿海灘涂的重要標(biāo)志種。
[0003]鹵蕨具較高的觀賞價(jià)值。植株高大挺拔，可達(dá)2m。根狀莖直立，頂端密被褐棕色的闊披針形鱗片。葉厚革質(zhì)，簇生；基數(shù)一回羽狀復(fù)葉，羽片多達(dá)30對(duì)，葉柄長(zhǎng)30~60cm，粗可達(dá)2cm;葉片長(zhǎng)60~140 cm，寬30~60 cm ;葉脈網(wǎng)狀，兩面可見(jiàn)。孢子囊滿布能上部能育羽片下面。鹵蕨作為園藝物種栽培具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?br>[0004]鹵蕨的藥用價(jià)值也很高。在民間鹵蕨作為治療創(chuàng)傷、止血、風(fēng)濕、蠕蟲感染、便秘、象皮病等的傳統(tǒng)草藥。鹵蕨不僅具有良好的抗菌能力，而且具有很高的抗腫瘤活性。戴好富等(中國(guó)海洋藥物雜志，2005，24(6):44-46)發(fā)現(xiàn)鹵蕨的醋酸乙酯提取物活性較強(qiáng)，IC50達(dá)6.3yg/ml，抑制了 HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。鐘曉等(廣西師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)2012，29(3): 41-45)發(fā)現(xiàn)鹵蕨的主要化學(xué)成分為留體類、三萜類、黃酮類、苷類、單糖、氨基酸及硫酸酯類的化合物。這些化合物都具有一定的抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等生物活性。這些研究表明鹵蕨是開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物和新型的抗菌藥物的好材料。
[0005]鹵蕨可在紅樹林生態(tài)恢復(fù)中可以發(fā)揮重要作用。在20世紀(jì)50~90年代，中國(guó)紅樹林面積銳減68.7%，現(xiàn)存林分中80%以上為退化次生林，立地環(huán)境惡化。目前用于紅樹林恢復(fù)的植物均是通過(guò)種子繁殖和胎生苗繁殖獲得，作為真紅樹林植物中唯一的蕨類植物類群鹵蕨屬(Acrost1hmi)的運(yùn)用很少見(jiàn)，這與鹵蕨的種苗生產(chǎn)技術(shù)瓶頸有關(guān)，目前，尚未見(jiàn)有鹵蕨離體再生體系建立方法的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的在于提供一種建立鹵蕨離體再生體系的方法，即以鹵蕨的成熟孢子囊群為外植體，經(jīng)過(guò)外植體表面消毒、孢子無(wú)菌萌發(fā)、原葉體增殖、孢子體誘導(dǎo)、煉苗及移栽等步驟，建立鹵蕨離體再生體系，實(shí)現(xiàn)鹵蕨的快速繁殖目的。
[0007]本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。齒蕨{Acrostichum auream L.)離體再生體系建立的方法，包括以下順序步驟:
(1)外植體采集與表面消毒:剪取鹵蕨孢子葉，進(jìn)行表面消毒。
[0008](2)孢子無(wú)菌萌發(fā):分離孢子葉上的孢子囊群，將其接種于孢子萌發(fā)無(wú)菌培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。孢子萌發(fā)無(wú)菌培養(yǎng)基配方為:1/4MS基本培養(yǎng)基+ 0~20g/L蔗糖+6-芐氨基嘌呤(6-BA) 0.2mg/L + 瓊脂 7g/L。
[0009](3)原葉體增殖培養(yǎng):將步驟(2)得到的原葉體剪接到原葉體增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行原葉體增殖培養(yǎng)。每50d更換一次原葉體增殖培養(yǎng)基。原葉體增殖培養(yǎng)基配方為:1/4MS基本培養(yǎng)基+ 15g/L蔗糖+ 6-BA 0-0.6mg/L +2，4 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.lmg/L+瓊脂7g/L0
[0010](4)孢子體的誘導(dǎo):將步驟(3)形成的原葉體粉碎轉(zhuǎn)接，誘導(dǎo)產(chǎn)生幼孢子體。孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:1/4MS基本培養(yǎng)基+赤霉素(GA3) 0-1.2mg/L +5g/L蔗糖+瓊脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。
[0011](5)生根培養(yǎng)與煉苗:將步驟(4)誘導(dǎo)的幼孢子體分離出來(lái)，轉(zhuǎn)接誘導(dǎo)幼孢子體(幼苗)生根。培養(yǎng)基配方為:1/4MS基本培養(yǎng)基+15g/L蔗糖+2，4-D 0.05mg/L或奈乙酸(NAA) 0.05mg/L+瓊脂7g/L。發(fā)現(xiàn)不定根根尖突出后，隨即在培養(yǎng)室內(nèi)松開(kāi)、虛掩瓶蓋，煉苗 10do
[0012](6)移栽:取出步驟(5)的幼苗，洗去根部附著的凝膠培養(yǎng)基，將幼苗移栽入經(jīng)高溫滅菌的基質(zhì)中。定期澆水，覆蓋薄膜，保持相對(duì)濕度90%以上。
[0013]上述1/4MS 基本培養(yǎng)基配方為:NH4N03 4 1 2.5mg/L、KN03 4 7 5mg/L、KH2P04 1 00mg/L、MgS04.7H20 92.5mg/L、CaCl2.2H20 110mg/L、KI 0.83 mg/L、H3B03 6.2 mg/L、MnS04.4H2022.3 mg/L、ZnS04.7H20 8.6 mg/L、Na2Mo04.2HZ0 0.25 mg/L、CuS04.5H20 0.025 mg/L、CoCl2.6H20 0.025 mg/L、FeS04.7H20 6.95mg/L、Na2_EDTA.2H20 9.325 mg/L。瓊脂培養(yǎng)基pH值均調(diào)節(jié)至5.8。
[0014]上述培養(yǎng)條件均為:12h光照+12h黑暗，光照強(qiáng)度2500Lx，25±2° C。
[0015]上述步驟(1)中表面消毒條件優(yōu)選如下:先用70%的酒精浸泡20s，棄酒精，加入0.1% 升汞(HgCl2)消毒 2.5min。
[0016]上述步驟(2)孢子無(wú)菌萌發(fā)培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:1/4MS基本培養(yǎng)基+10g/L蔗糖+6-BA 0.2mg/L + 瓊脂 7g/L
上述步驟(3)原葉體增殖培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:1/4MS基本培養(yǎng)基+ 15g/L蔗糖+6-BA0.6mg/L +2，4-D 0.lmg/L+ 瓊脂 7g/L。
[0017]上述步驟(4)孢子體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:1/4MS基本培養(yǎng)基+ GA3 0.8mg/L+5g/L蔗糖+瓊脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。接種方式優(yōu)先為碎片狀接種。
[0018]上述步驟(5)幼苗生根培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:1/4MS基本培養(yǎng)基+15g/L蔗糖+2，4-D0.05mg/L+瓊脂 7g/L0
[0019]本發(fā)明首次建立了鹵蕨離體再生體系的方法，填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)空白；使用本發(fā)明的快速繁殖的方法，可實(shí)現(xiàn)高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，可在短時(shí)期內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)的鹵蕨幼苗，為園藝生產(chǎn)、中藥栽培及熱帶沿海紅樹林生態(tài)修復(fù)提供的可靠的技術(shù)保障。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1鹵蕨原葉體增殖效果圖。
[0021]圖2鹵蕨孢子體誘導(dǎo)效果圖。
[0022]圖3鹵蕨移栽效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]準(zhǔn)備1/4MS 基本培養(yǎng)基，其配方為:NH4N03 4 1 2.5mg/L、KN03 4 7 5mg/L、ΚΗ2Ρ04100mg/L、MgS04.7H20 92.5mg/L、CaCl2.2H20 110mg/L、KI 0.83 mg/L、H3B03 6.2 mg/L、MnS04.4H20 22.3 mg/L、ZnS04.7H20 8.6 mg/L、Na2Mo04.2HzO 0.25 mg/L、CuS04.5H200.025 mg/L、CoCl2.6H20 0.025 mg/L、FeS04.7H20 6.95mg/L、Na2_EDTA.2HzO 9.325 mg/Lo瓊脂培養(yǎng)基pH值均調(diào)節(jié)至5.8。
[0024]鹵蕨離體培養(yǎng)體系建立的方法，包括如下步驟:
(1)外植體采集與表面消毒處理:剪取鹵蕨成熟孢子葉于自封袋中帶回，葉背面孢子囊群為深褐色，及時(shí)處理新鮮材料。孢子葉表面消毒:孢子葉橫向裁剪為lX3~4cm的條帶狀小片段，置100ml廣口瓶中，飽和洗衣粉溶液浸泡，加入1滴吐溫-80，蓋瓶蓋，浸洗20min，期間每3~5min輕輕旋搖瓶體數(shù)次；自來(lái)水緩緩沖洗孢子葉lOmin ;在超凈工作臺(tái)上，棄瓶?jī)?nèi)自來(lái)水，加入70%的酒精浸泡20s，棄酒精，加入0.1%取(:12消毒2.5min，再以無(wú)菌水沖洗5次，備用。
[0025](2)孢子無(wú)菌萌發(fā):用解剖刀刮取孢子葉上的孢子囊群，將其分散接種于孢子無(wú)菌萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。孢子無(wú)菌萌發(fā)培養(yǎng)基配方為:1/4MS基本培養(yǎng)基+ 0~20g/L蔗糖+6-BA0.2mg/L +瓊脂7g/L。培養(yǎng)條件均為:12h光照+12h黑暗，光照強(qiáng)度2500Lx，25±2° Co
[0026](3)原葉體增殖培養(yǎng):將步驟(2)孢子萌發(fā)形成的原葉體剪切至原葉體增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行原葉體增殖培養(yǎng)。每50d更換一次培養(yǎng)基。原葉體增殖培養(yǎng)基配方為:1/4MS基本培養(yǎng)基 + 15g/L 蔗糖 + 6-BA 0-0.6mg/L +2, 4-D 0.lmg/L+瓊脂 7g/L。培養(yǎng)條件均為:12h光照+12h黑暗，光照強(qiáng)度2500Lx，25±2° C。
[0027](4)孢子體的誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟(3)形成的原葉體粉碎轉(zhuǎn)接至孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生幼孢子體。培養(yǎng)基配配方為:1/4MS基本培養(yǎng)基+ GA3 0-1.2mg/L +5g/L蔗糖+瓊脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。培養(yǎng)條件均為:12h光照+12h黑暗，光照強(qiáng)度2500Lx，25±2° Co
[0028](5)生根培養(yǎng)與煉苗:將步驟(4)誘導(dǎo)的幼孢子體分離出來(lái)，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)孢子體形成不定根。培養(yǎng)基配配方為:1/4MS基本培養(yǎng)基+15g/L蔗糖+2，4-D 0.05mg/L+瓊脂7g/L。10-15d肉眼可見(jiàn)幼孢子體不定根根尖剛突出后，隨即在培養(yǎng)室內(nèi)松開(kāi)、虛掩瓶蓋10d，期間培養(yǎng)基因水分較快消耗而收縮，但不致干涸，孢子體結(jié)構(gòu)分化更完善。培養(yǎng)條件均為:12h光照+12h黑暗，光照強(qiáng)度2500Lx，25±2° C。
[0029](6)移栽:取出步驟(5)的孢子體幼苗，洗去根部附著的凝膠培養(yǎng)基，將幼苗移栽入經(jīng)高溫滅菌的基質(zhì)中，基質(zhì)為草炭:蛭石=3: 1。定期澆水，覆蓋薄膜，保持相對(duì)濕度90%以上。
[0030]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整說(shuō)明:
實(shí)施例1
外植體采集、表面消毒與接種:選擇孢子囊群深褐的新鮮齒蕨孢子葉，剪取孢子葉用自封袋中帶回，及時(shí)處理新鮮材料。孢子葉表面消毒:孢子葉剪裁為lX3~4cm的條帶狀片段，置100ml廣口瓶中，飽和洗衣粉溶液浸泡，加入1滴吐溫-80，蓋瓶蓋，浸洗20min，期間每3~5min輕輕旋搖瓶體數(shù)次；廣口瓶口扎以紗布，以自來(lái)水緩緩沖洗孢子葉lOmin，至瓶?jī)?nèi)液體澄清；在超凈工作臺(tái)上，棄瓶?jī)?nèi)自來(lái)水，加入70%的酒精浸泡20s，棄酒精，加入0.1%取(:12消毒2.5min，再以無(wú)菌水沖洗5次，備用。用解剖刀刮取孢子葉腹面的孢子囊群，將其接于孢子無(wú)菌萌發(fā)培養(yǎng)基表面，加入少許無(wú)菌水，輕微振蕩