一種大巖桐離體再生體系建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及園藝植物生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種大巖桐離體再生體系建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大巖桐(■spec1sa)又名六雪尼、落雪泥、巴西芙蓉等,是苦苣苔科巖桐屬多年生球根草本花卉，塊莖扁球形，葉對生，肥厚而大，密生茸毛，花朵鐘狀，色彩豐富，大而美麗，是國慶用花的理想品種。大巖桐的栽培品種繁多，花色有藍(lán)、粉紅、白、紅、紫等，還有白邊監(jiān)花，白邊紅花雙色和重辦花。常見品種有威廉皇帝、挑戰(zhàn)、火神等，世界各地均有栽培。大巖桐喜溫暖、不耐低溫，5°C以下難以越冬，培育抗寒品種有望實(shí)現(xiàn)非溫室越冬，擴(kuò)大種植面積，降低生產(chǎn)成本。
[0003]目前，大巖桐種苗主要是通過種子、球根萌發(fā)、扦插等方式進(jìn)行繁育。種種方式都有各自特色，主要缺點(diǎn)是繁殖系數(shù)低，這很大程度上影響了其規(guī)?；l(fā)展和市場化的要求。而植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有加速育種進(jìn)程、縮短繁殖時間、改良植物品質(zhì)、節(jié)省空間、減少勞動、可終年生產(chǎn)、不受自然條件限制等特點(diǎn)，可有效解決大巖桐種苗繁殖耗時長、繁殖系數(shù)低的問題。因此，建立大巖桐離體再生技術(shù)體系，對推動優(yōu)良大巖桐園藝品種在我國的生產(chǎn)及應(yīng)用具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供出一種大巖桐離體再生體系建立方法，本發(fā)明以大巖桐幼嫩葉片為外植體，經(jīng)過外植體消毒、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等步驟建立了一種大巖桐離體再生體系建立方法，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種大巖桐離體再生體系建立方法，包括以下的步驟:
(I)外植體消毒:從盒栽的生長旺盛的大巖桐植株上的幼嫩葉片為外植體，先用流水下沖洗I?3h后置于超凈工作臺中，再于用75%乙醇消毒5?30s后用無菌水洗3?5次，再用0.1%升萊溶液消毒I?1min,用無菌水沖洗4?6次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后備用。
[0006](2)芽誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟(I)處理后的葉片切成I X Icm2長的小塊并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?3天，然后置于每天光照10?12小時，光照強(qiáng)度為1500?30001x，直至誘導(dǎo)形成不定芽。
[0007](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)的葉片邊緣傷口處產(chǎn)生的愈傷組織上的不定芽長至約2.0?3.0cm時切下，剪掉其莖尖并接種至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)3?5天，然后置于每天光照10?13小時，光照強(qiáng)度為1500?25001x,置于培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)2?3周后，其葉腋處就會長出許多小芽，再將這些小芽反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的不定芽。
[0008](4)生根培養(yǎng):將步驟(3)過程獲得的高度約為3.5?4.5cm的小芽分切下并接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)3?7天，然后置于每天光照12?15小時，光照強(qiáng)度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)20天左右即開始生根。
[0009](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5?7cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗3?5天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基并在多菌靈溶液中浸泡8?10s，栽入由營養(yǎng)土:沙土 = 3:1混合成的基質(zhì)，保持濕度并給予60%?80%的遮陰處理。
[0010]上述步驟(2)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.5?2mg/L6-BA+0.1?lmg/L NAA+15?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0011]上述步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.1?lmg/L ΝΑΑ+0.5?lmg/L6-BA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(4)所述的生根培養(yǎng)基為:l/2MS+0.1?2mg/L NAA+15?30g/L蔗糖+3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明通過植物組織培養(yǎng)方法短時間內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)大巖桐種苗的方法。以大巖桐幼嫩葉片為外植體，經(jīng)過外植體消毒、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等步驟建立了一種大巖桐離體再生體系建立方法，為滿足對大巖桐優(yōu)質(zhì)種苗的需求、加速大巖桐良種的推廣具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0015]實(shí)施例1:
(I)外植體消毒:從盒栽的生長旺盛的大巖桐植株上的幼嫩葉片為外植體，先用流水下沖洗Ih后置于超凈工作臺中，再于用75%乙醇消毒5s后用無菌水洗3次,再用0.1%升汞溶液消毒lmin，用無菌水沖洗4次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后備用。
[0016](2)芽誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟(I)處理后的葉片切成I X Icm2長的小塊并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，先在28°C條件下全暗培養(yǎng)I天，然后置于每天光照10小時，光照強(qiáng)度為15001x條件培養(yǎng)30天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率為96%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.Smg/L6-BA+0.3mg/L NAA+30g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為 5.8。
[0017](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)的葉片邊緣傷口處產(chǎn)生的愈傷組織上的不定芽長至約2.0?3.0cm時切下，剪掉其莖尖并接種至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)3天，然后置于每天光照10小時，光照強(qiáng)度為15001x，置于培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)14天后，其葉腋處就會長出許多小芽，再將這些小芽反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的不定芽。所述的增殖培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L NAA+lmg/L 6_BA+30g/L蔗糖+6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.8。
[0018](4)生根培養(yǎng):將步驟(3)過程獲得的高度約為3.5?4.5cm的小芽分切下并接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)3天，然后置于每天光照12小時，光照強(qiáng)度為15001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)18天即開始生根，生根率
100% ο
[0019](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5?7cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗3天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基并在多菌靈溶液中浸泡8s，栽入由營養(yǎng)土:沙土 = 3:1混合成的基質(zhì)，保持濕度并給予60%的遮陰處理，移栽成活率為98%以上。所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/L NAA+15g/L鹿糖+3.5?g/L瓊脂，pH為5.8。
[0020]實(shí)施例2:
(I)外植體消毒:從盒栽的生長旺盛的大巖桐植株上的幼嫩葉片為外植體，先用流水下沖洗Ih后置于超凈工作臺中，再于用75%乙醇消毒5s后用無菌水洗3次,再用0.1%升汞溶液消毒lmin，用無菌水沖洗4次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后備用。
[0021](2)芽誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟(I)處理后的葉片切成IXlcm2長的小塊并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，先在28°C條件下全暗培養(yǎng)3天，然后置于每天光照11小時，光照強(qiáng)度為15001x條件培養(yǎng)28天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率為92%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+lmg/L6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為 5.8。
[0022](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)的葉片邊緣傷口處產(chǎn)生的愈傷組織上的不定芽長至約2.0?3.0cm時切下，剪掉其莖尖并接種至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)5天，然后置于每天光照11小時，光照強(qiáng)度為20001χ，置于培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)15天后，其葉腋處就會長出許多小芽，再將這些小芽反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的不定芽。所述的增殖培養(yǎng)基為MS+0.3mg/L NAA+0.9mg/L 6_BA+30g/L鹿糖+6.0g/L瓊脂，pH為5.8。
[0023](4)生根培養(yǎng):將步驟(3)過程獲得的高度約為3.5?4.5cm的小芽分切下并接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)3天，然后置于每天光照12小時，光照強(qiáng)度為15001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)18天即開始生根，生根率100%。所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.8mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.5?g/L瓊脂，pH為5.8。
[0024](5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5?7cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗3天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基并在多菌靈溶液中浸泡8s，栽入由營養(yǎng)土:沙土 = 3:1混合成的基質(zhì)，保持濕度并給予60%的遮陰處理，移栽成活率為96%以上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種大巖桐離體再生體系建立方法，其特征在于包括以下步驟: (1)外植體消毒:從盒栽的生長旺盛的大巖桐植株上的幼嫩葉片為外植體，先用流水下沖洗I?3h后置于超凈工作臺中，再于用75%乙醇消毒5?30s后用無菌水洗3?5次，再用0.1%升萊溶液消毒I?1min,用無菌水沖洗4?6次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后備用; (2)芽誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟(I)處理后的葉片切成IX Icm2長的小塊并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?3天，然后置于每天光照10?12小時，光照強(qiáng)度為1500?30001x，直至誘導(dǎo)形成不定芽； (3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)的葉片邊緣傷口處產(chǎn)生的愈傷組織上的不定芽長至約2.0?3.0cm時切下，剪掉其莖尖并接種至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)3?5天，然后置于每天光照10?13小時，光照強(qiáng)度為1500?25001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)2?3周后，其葉腋處就會長出許多小芽，再將這些小芽反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到不定芽； (4)生根培養(yǎng):將步驟(3)過程獲得的高度約為3.5?4.5cm的小芽分切下并接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)3?7天，然后置于每天光照12?15小時，光照強(qiáng)度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)20天左右即開始生根； (5)煉苗移栽:將步驟(4)獲得的高約5?7cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根試管苗去瓶蓋置于自然光照下煉苗3?5天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基并在多菌靈溶液中浸泡8?10s，栽入由營養(yǎng)土:沙土 = 3:1混合成的基質(zhì)，保持濕度并給予60%?80%的遮陰處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大巖桐離體再生體系建立方法，其特征在于步驟(2)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.5 ?2mg/L6_BA+0.1 ?lmg/L NAA+15 ?30g/L 鹿糖+3.5 ?6.0g/L瓊脂，pH為5.4?5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大巖桐離體再生體系建立方法，其特征在于步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.1?lmg/L ΝΑΑ+0.5?lmg/L 6-BA+15?30g/L鹿糖+3.5?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大巖桐離體再生體系建立方法，其特征在于步驟(4)所述的生根培養(yǎng)基為:l/2MS+0.1?2mg/L NAA+15?30g/L蔗糖+3.5?6.0g/L瓊脂，pH為5.4 ?5.8。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大巖桐離體再生體系建立方法，涉及大巖桐（Sinningia speciosa）通過植物組織培養(yǎng)方法短時間內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)大巖桐種苗的方法。本發(fā)明以大巖桐幼嫩葉片為外植體，經(jīng)過外植體消毒、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗及移栽等步驟建立了一種大巖桐離體再生體系建立方法，為滿足對大巖桐優(yōu)質(zhì)種苗的需求、加速大巖桐良種的推廣具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104686328
【申請?zhí)枴緾N201510085884
【發(fā)明人】楊業(yè)云
【申請人】楊業(yè)云
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月21日