一株深海環(huán)狀芽孢桿菌及其抑制黃曲霉毒素的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及深海微生物技術(shù)與真菌毒素生物防控技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一株深海環(huán)狀芽孢桿菌及其抑制黃曲霉毒素的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]黃曲霉毒素是目前在自然界中已發(fā)現(xiàn)的毒性最強的真菌毒素，并具有強致癌、致畸和免疫抑制性，被國際癌癥機構(gòu)列為一類致癌物質(zhì)。主要由黃曲霉、寄生曲霉等絲狀真菌產(chǎn)生，可廣泛污染糧食、飼料等，人類和動物食用被黃曲霉毒素污染的食物和飼料后，可嚴重危害人類和動物的健康，因此，如何有效防控黃曲霉毒素污染是全球亟待解決的重大課題。
[0003]有效防控黃曲霉毒素污染飼料和糧食的首選方法是抑毒，即抑制黃曲霉毒素在飼料和糧食中的產(chǎn)生，而不是除毒，即清除已經(jīng)產(chǎn)生的黃曲霉毒素，因為除毒不僅成本大，效果也不理想，難以根除，并會導致營養(yǎng)的損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是:一株深海環(huán)狀芽孢桿菌及其抑制黃曲霉毒素的應(yīng)用，其特征包括如下步驟:
(1)本發(fā)明所說的深海環(huán)狀芽孢桿菌為環(huán)狀芽孢桿菌FA13菌株circulansFA13)，并已于2015年3月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.10663 ；
(2)本發(fā)明所說的FA13菌株分離自南大西洋3203米水深的淺黃色軟泥沉積物，通過以下方法分離獲得:新鮮的淺黃色軟泥10倍系列稀釋液經(jīng)55°C水浴6min后，涂布于高氏一號培養(yǎng)基，28度下恒溫培養(yǎng)，及時挑取單菌落，并經(jīng)進一步劃線純化，獲得純菌種FA13菌株;
(3)本發(fā)明所說的FA13菌株經(jīng)16SrRNA基因分子鑒定為環(huán)狀芽孢桿菌的一個新菌株，菌體呈桿狀，可產(chǎn)生芽孢，革蘭氏染色陽性；
(4)將本發(fā)明的深海環(huán)狀芽孢桿菌FA13菌株接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，在20-36°C溫度下，振蕩培養(yǎng)4-12天，即可得到含有高效活性物質(zhì)的發(fā)酵液，該發(fā)酵液即使稀釋30倍后，仍可100%抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生菌的孢子萌發(fā)和黃曲霉毒素的合成，稀釋40倍后，仍可100%抑制黃曲霉毒素的合成。
[0005](5)本發(fā)明的FA13菌株的發(fā)酵液中的活性物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，在121°C高溫高壓下處理30分鐘后活性不喪失；在？!12-12的范圍內(nèi)處理6小時后活性不喪失；用胃蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶等在適宜條件下酶解6小時后活性仍不喪失；
(6)本發(fā)明的FA13菌株的發(fā)酵液中的活性物質(zhì)具有良好的生物安全性，對大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌等腸道菌群無抑制作用，對單細胞真菌釀酒酵母也沒有抑制作用；(7)本發(fā)明的深海環(huán)狀芽孢桿菌FA13菌株及其發(fā)酵液可應(yīng)用于飼料、糧食、大田作物
等的黃曲霉毒素污染的有效防控。
【具體實施方式】
[0006]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。
[0007]實施例1:深海環(huán)狀芽孢桿菌FA13菌株的液體發(fā)酵
將過夜培養(yǎng)的FA13菌株的液體種子，按1%接種量接種到含有0.5-1.5%酵母膏、0.1-0.3%麥芽糖和1.0-3.0%葡萄糖的液體培養(yǎng)基中，在20-36度、100-120轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)6-12天，結(jié)束發(fā)酵，對發(fā)酵液進行離心，獲得的無細胞上清液即是含有高效抑制黃曲霉毒素的活性物質(zhì)的發(fā)酵液，可直接用于防控黃曲霉毒素的污染，或者加工成干粉用于防控黃曲霉毒素的污染。
[0008]實施例2:深海環(huán)狀芽孢桿菌FA13菌株的發(fā)酵液及其稀釋液抑制黃曲霉毒素的活性
將實施例1獲得的無細胞發(fā)酵上清液中加入與發(fā)酵培養(yǎng)基等量的營養(yǎng)成分后作為培養(yǎng)黃曲霉毒素產(chǎn)生菌的培養(yǎng)液，以及將實施例1獲得的無細胞發(fā)酵上清液用發(fā)酵培養(yǎng)基分別稀釋30倍和40倍后作為培養(yǎng)黃曲霉毒素產(chǎn)生菌的培養(yǎng)液，對照為發(fā)酵培養(yǎng)基，向上述培養(yǎng)基中分別接種1%的黃曲霉毒素產(chǎn)生菌的孢子懸液后，在28度培養(yǎng)6天，離心收集菌絲體，稱重后，用甲醇-氫氧化鈉溶液提取菌絲體中的黃曲霉毒素中間產(chǎn)物，在560nm處測量吸光值，計算抑菌率和抑毒率，結(jié)果表明，未稀釋的無細胞發(fā)酵上清液和稀釋30倍的無細胞發(fā)酵上清液中接種的黃曲霉毒素產(chǎn)生菌的孢子沒有萌發(fā)，將其重新接種到適宜孢子萌發(fā)生長的培養(yǎng)基中6天后，仍無孢子萌發(fā)，表明黃曲霉毒素產(chǎn)生菌的孢子在FA13菌株的無細胞發(fā)酵上清液中培養(yǎng)后已經(jīng)被殺死，因而，F(xiàn)A13菌株的無細胞發(fā)酵上清液和稀釋30倍的無細胞發(fā)酵上清液具有完全殺死孢子和抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的能力，對稀釋40倍的FA13無細胞發(fā)酵上清液的檢測表明對菌絲生長的抑制率達80%以上，對黃曲霉毒素產(chǎn)生的抑制率達 100%。
[0009]
實施例3:深海環(huán)狀芽孢桿菌FA13菌株的發(fā)酵液中的活性物質(zhì)的溫度穩(wěn)定性將實施例1獲得的無細胞發(fā)酵上清液在60、80°C溫度下加熱處理2小時后自然冷卻至室溫、以及在121°C下高壓滅菌30分鐘后自然冷卻至室溫，將上述處理的發(fā)酵液、未經(jīng)過溫度處理的發(fā)酵液、和空白培養(yǎng)基一起分別接種1%的黃曲霉毒素產(chǎn)生菌的孢子懸液后，在28度培養(yǎng)6天，觀察孢子萌發(fā)情況，結(jié)果表明即使在121°C下高壓滅菌30分鐘的發(fā)酵液也能與未經(jīng)過溫度處理的發(fā)酵液一樣，完全抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生菌的孢子萌發(fā)和黃曲霉毒素的產(chǎn)生，表明發(fā)酵液中的抑菌抑毒活性物質(zhì)具有溫度穩(wěn)定性。
【主權(quán)項】
1.一株分離自南大西洋3203米水深的淺黃色軟泥沉積物的深海菌株，為環(huán)狀芽孢桿菌FA13菌株circulans FA13)，已于2015年3月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.10663。
【專利摘要】本發(fā)明提供一株可防控黃曲霉毒素的深海菌株，為環(huán)狀芽孢桿菌FA13菌株（<i>Bacillus？circulans</i>？FA13），分離自南大西洋3203米水深的淺黃色軟泥沉積物，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC？No.10663。將FA13菌株在優(yōu)化條件下發(fā)酵，獲得的發(fā)酵上清液30倍稀釋后，仍可殺死黃曲霉毒素產(chǎn)生菌的孢子和100%抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，即具有從生長源頭抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的能力，而對腸道菌群和單細胞真菌釀酒酵母則無抑制作用，具有更高的使用安全性；發(fā)酵液中的活性代謝產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，具有耐高溫、耐酸堿、和耐胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的降解。本發(fā)明的FA13菌株及其發(fā)酵產(chǎn)物可用于飼料、糧食、大田作物等的黃曲霉毒素污染的有效防控。CGMCC No.1066320150324
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/09
【公開號】CN105039199
【申請?zhí)枴緾N201510314566
【發(fā)明人】閆培生, 王文威, 邵宗澤, 王凱, 曹立新, 賈文文
【申請人】哈爾濱工業(yè)大學（威海）, 中國大洋礦產(chǎn)資源研究開發(fā)協(xié)會
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年6月10日