來(lái)自玉蜀黍的ms9基因的克隆和使用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地講，設(shè)及影響雄性育性。
【背景技術(shù)】
[0002] 雜交植物育種的發(fā)展已使產(chǎn)生的作物在質(zhì)量和數(shù)量方面取得相當(dāng)大的進(jìn)展成為 可能。由于經(jīng)過(guò)了雜交程序，故產(chǎn)量增加，所需特性的有利組合如對(duì)病害和蟲(chóng)害的抗性、耐 熱性和耐旱性，W及植物組成發(fā)生變化都可能出現(xiàn)。運(yùn)些程序在很多情況下主要依賴(lài)于提 供向雌性親本貢獻(xiàn)花粉的雄性親本W(wǎng)產(chǎn)生所得的雜交體。
[0003] 大田作物通過(guò)利用植物的授粉方法的技術(shù)進(jìn)行育種。如果來(lái)自植物的一朵花的花 粉轉(zhuǎn)移到同一植物或遺傳上相同的植物的同一朵花或另一朵花，則植物自花授粉。如果花 粉來(lái)自遺傳上不同的植物的花，則植物異花授粉。
[0004] 在蕓苔屬度rassica)中，植物通常自花不育，并且只能夠異花授粉。在自花授粉 的物種中，諸如大豆和棉花，雄性和雌性植株在解剖學(xué)上是雌雄同株的。在自然授粉過(guò)程 中，一朵花的雄性繁殖器官給同一朵花的雌性繁殖器官授粉。 陽(yáng)〇化]玉蜀泰植物狂eamaysL.)不尋常的地方在于它們易于通過(guò)自花授粉和異花授粉 兩種技術(shù)來(lái)繁育。玉蜀泰在同一植株上具有位于雄穗上的雄花和位于雌穗上的雌花。玉蜀 泰可自花授粉或異花授粉。當(dāng)風(fēng)或重力將花粉從雄穗移動(dòng)至從初期（incipient)雌穗頂部 突出的穗絲時(shí)便會(huì)在玉蜀泰中發(fā)生天然的授粉。
[0006] 控制植株中的育性的可靠方法將提供改良植物育種的機(jī)會(huì)。對(duì)于玉蜀泰雜交種的 開(kāi)發(fā)而言特別是如此，玉蜀泰雜交種的開(kāi)發(fā)通常依賴(lài)于某些雄性不育系統(tǒng)。
[0007] 玉蜀泰雜種的開(kāi)發(fā)需要純合近交系的開(kāi)發(fā)、運(yùn)些近交系的雜交和雜交的評(píng)估。譜 系育種和輪回選擇是用于從種群開(kāi)發(fā)近交系的育種方法中的兩種。育種程序?qū)?lái)自?xún)蓚€(gè)或 更多個(gè)近交系或多種基礎(chǔ)廣泛的來(lái)源的所需性狀組合進(jìn)育種庫(kù)，通過(guò)自交和對(duì)所需表型的 選擇從所述庫(kù)中開(kāi)發(fā)出新的近交系。雜種玉蜀泰品種是兩種此類(lèi)近交系的雜交，每種都可 能具有另一種所缺乏的一種或多種所需特性，或補(bǔ)足另一者的一種或多種所需特性。新的 近交系與其它近交系雜交，對(duì)從運(yùn)些雜交獲得的雜種進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定哪些具有商業(yè)潛能。第 一代的雜種子代被定為Fi。在對(duì)雜種的開(kāi)發(fā)中，僅尋求Fi雜種植物。Fi雜種比其近交親本 更有活力。運(yùn)種雜種活力或雜種優(yōu)勢(shì)可W多種途徑體現(xiàn)，包括增加的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和提高的產(chǎn) 率。
[0008] 可通過(guò)結(jié)合人工去雄在內(nèi)的雄性不育系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生雜種玉蜀泰種子。為產(chǎn)生雜種種 子，從正在生長(zhǎng)的雌性近交親本（其可與雄性近交親本W(wǎng)各種交替行模式種植）除去雄穗。 因此，如果與外來(lái)玉蜀泰花粉來(lái)源充分隔離，雌性近交系的雌穗將僅被來(lái)自雄性近交系的 花粉受精。因此，得到的種子是雜種（Fi)并將形成雜種植物。
[0009] 植物發(fā)育過(guò)程中的環(huán)境變化可導(dǎo)致在雌性親本的人工去雄完成后植物又抽出雄 穗?；蛘撸バ壑参锟赡軟](méi)有完全移除雌性近交植物的雄穗。在任何情況下，結(jié)果都是雌性 植物成功散播花粉，一些雌性植物被自花授粉。運(yùn)將導(dǎo)致連同正常產(chǎn)生的雜種種子一起收 獲雌性近交系的種子，運(yùn)對(duì)于種植者來(lái)說(shuō)是不利的，因?yàn)榇菩越幌捣N子的生產(chǎn)力不如Fi種子。此外，雌性近交種子的存在對(duì)生產(chǎn)雜種的公司來(lái)說(shuō)可能代表著種質(zhì)安全風(fēng)險(xiǎn)。
[0010] 或者，可W機(jī)械方式對(duì)雌性近交系去雄。機(jī)械去雄和手工去雄的可靠性大致相同， 但更快并且成本更低。然而，與手工去雄相比，大多數(shù)去雄機(jī)器會(huì)對(duì)植物造成更多的傷害。 因此，目前沒(méi)有令人完全滿(mǎn)意的去雄形式，故而還是需要進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本并消除雜種 種子生產(chǎn)中的雌性親本自花授粉的替代方法。
[0011] 遺傳雄性不育的可靠系統(tǒng)具有優(yōu)勢(shì)。使用胞質(zhì)雄性不育（CM巧近交系可在一些基 因型中避免繁瑣的去雄過(guò)程。在不存在育性恢復(fù)基因的情況下，由于是細(xì)胞質(zhì)而非細(xì)胞核、 基因組所引起的因素，所WCMS近交系的植物是雄性不育的。因而，該特性只通過(guò)母本在玉 蜀泰植株遺傳，因?yàn)閮H母本為受精種子提供胞質(zhì)。來(lái)自非雄性不育的另一近交系的花粉使 CMS植株受精。來(lái)自第二近交系的花粉可能會(huì)，也可能不會(huì)貢獻(xiàn)使雜種植物成為雄性可育的 基因。通常，必須混合來(lái)自去雄正常玉蜀泰的種子和相同雜種的CMS生成的種子，才能保證 足夠的花粉負(fù)荷在種植雜種植物時(shí)可用于受精，并且確保細(xì)胞質(zhì)多樣性。
[0012] 對(duì)于CMS而言還有其他缺點(diǎn)。其中一個(gè)缺點(diǎn)是，歷史上觀(guān)察到CMS的特定變體與 對(duì)某些作物病害的易感性之間的關(guān)聯(lián)。此問(wèn)題已經(jīng)阻礙CMS-T變體在雜種玉蜀泰種子的生 產(chǎn)中廣泛使用，而且總體來(lái)說(shuō)，已經(jīng)對(duì)CMS在玉蜀泰中的使用產(chǎn)生負(fù)面影響。
[0013] 在多種情況下，雄性不育的植物性狀通過(guò)維持純合隱性條件來(lái)表達(dá)。當(dāng)恢復(fù)基因 必須用于維持時(shí)，維持純合條件出現(xiàn)困難。例如，對(duì)于雄性不育至關(guān)重要的基因中的天然突 變?cè)谠撏蛔冃偷任换蛱幱诩兒蠣顟B(tài)時(shí)可賦予植物雄性不育表型。當(dāng)將該基因的非突變形 式引入植物中時(shí)，可恢復(fù)該不育性。然而，運(yùn)種形式的恢復(fù)移除了所需的純合隱性條件，恢 復(fù)了全部雄性育性并且阻止了對(duì)純的雄性不育母系的維持。如果消除生成包含恢復(fù)基因的 花粉，提供僅生成不包含恢復(fù)基因的花粉的保持系植物，讓后代保留純合隱性條件，運(yùn)樣可 避免出現(xiàn)運(yùn)種問(wèn)題。
[0014] 如所指出的那樣，用雄性不育體系進(jìn)行的大部分工作的必要方面是識(shí)別影響雄性 育性的基因。運(yùn)種基因可W在包括本文所述的那些體系在內(nèi)的多種體系中使用W控制雄性 育性。 陽(yáng)〇1引發(fā)明概述
[0016] 本發(fā)明設(shè)及核酸序列，具體地講，設(shè)及對(duì)于雄性育性關(guān)鍵的DNA分子及由所述DNA 分子編碼的氨基酸。本發(fā)明鑒定了所述DNA的啟動(dòng)子。本發(fā)明還設(shè)及使用此類(lèi)DNA分子介 導(dǎo)植物的育性。
[0017] 在本發(fā)明中，發(fā)明人提供了對(duì)于植物中雄性育性至關(guān)重要的新型DNA分子和所編 碼的氨基酸序列。運(yùn)些序列可用于可利用育性控制的任何體系，包括上述那些體系。
[0018] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種核酸序列，所述核酸序列的表達(dá)對(duì)于植物中 的雄性育性至關(guān)重要。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供編碼氨基酸序列的DNA分子，所述氨基酸序列的表達(dá) 對(duì)于植物中的雄性育性至關(guān)重要。
[0020] 本發(fā)明的又一個(gè)目標(biāo)是提供使用此類(lèi)DNA分子介導(dǎo)植物中的雄性育性的方法。
[0021] 在隨后的描述和權(quán)利要求書(shū)中，本發(fā)明的其他目標(biāo)將變得顯而易見(jiàn)。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1-通過(guò)基于圖譜的克隆技術(shù)所鑒定的染色體1基因組區(qū)域的示意圖。在該區(qū) 間中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因：無(wú)任何已知同源性的預(yù)測(cè)基因、與植物R2-R3myb蛋白質(zhì)具有同源性的 第二基因。根據(jù)發(fā)現(xiàn)，該未知基因包含重組，而myb基因旁側(cè)分布有重組體并代表Ms9的候 選基因。
[002引圖2-天然（野生型）Ms9基因的示意圖，其示出了內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)，W及該天 然基因的各部分與ms9參考等位基因的外顯子1和ms9-AD62A等位基因的外顯子3的比對(duì)。 ms9-參考等位基因比較將ms9參考等位基因CDS(SEQIDNO:6)的一部分與ZmMS9野生型 CDS(沈QIDN0:2)的一部分進(jìn)行比對(duì)。ms9-AD62A等位基因比較將ms9-AD62ACDS(沈QID NO:7)的一部分與ZmMS9野生型CDS(SEQIDNO:2)的一部分進(jìn)行比對(duì)。
[0024] 圖3-Ms9野生型等位基因（SEQIDNO:3)、ms9參考等位基因（SEQIDNO:10)和ms9-AD62A等位基因（SEQIDN0:9)的蛋白質(zhì)翻譯的比對(duì)。mybR2結(jié)構(gòu)域由比對(duì)上方的黑 線(xiàn)表示，mybR3結(jié)構(gòu)域由比對(duì)下方的黑線(xiàn)表示，它們分別被ms9-ref和ms9-AD62A突變所 破壞。 陽(yáng)02引 圖 4-來(lái)自玉蜀泰（SEQIDNO:3)、高梁（SEQIDNO:13)和水稻（SEQIDNO:14) 的Ms9蛋白質(zhì)序列的比對(duì)。
[0026] 序列簡(jiǎn)沐
[0027]表 1
[0028]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0030] 提到的所有參考文獻(xiàn)均W引用方式并入本文。
[0031] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。除非另外提出，否則本文所采用或所考慮的技術(shù)是本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。材料、方法和實(shí)例僅為示例性的而不是限制性的。
[0032] 遺傳雄性不育由對(duì)于小抱子發(fā)生（該術(shù)語(yǔ)適用于花粉形成的整個(gè)過(guò)程）的特定步 驟至關(guān)重要的基因之一的突變、抑制或其他影響而引起。運(yùn)些基因可統(tǒng)稱(chēng)為雄性育性基因 (或者，雄性不育基因）。在基因功能影響育性的整個(gè)途徑中有多個(gè)步驟。運(yùn)似乎適當(dāng)?shù)乇?玉蜀泰的遺傳雄性不育的頻率所支持。在范圍從優(yōu)良近交系到未適應(yīng)群體的材料中掲示了 雄性不育突變體的新等位基因。
[0033] 因此，本發(fā)明包括使用本文所示的序列影響植物的雄性育性，即，通過(guò)使用本發(fā)明 的基因操縱基因組來(lái)控制雄性育性。舉例來(lái)說(shuō)（但不限于此），下文所述的任何方法可與本 發(fā)明的序列一起使用，諸如將突變體序列引入植物中W引起不育，造成天然序列突變，將序 列的反義鏈引入植物中，使用發(fā)夾式形成物，將其與其他序列相連W控制其表達(dá)或控制本 領(lǐng)域技術(shù)人員可用來(lái)影響植物的雄性育性的大量過(guò)程中的任何一者。
[0034] Ms9表型在1932年首次在玉蜀泰中鑒定出。Beadle, (1932)Genetics17 : 413-431 @eadle，1932年，《遺傳學(xué)》，第17卷，第413-431頁(yè)）。據(jù)發(fā)現(xiàn)，Ms9表型與染色體 1上的P1基因相關(guān)。雄性繁殖組織發(fā)育的破壞發(fā)生在前減數(shù)分裂的很早期；絨拉層細(xì)胞也 可能受到影響。Gr巧son，etal.，（1980)Can.J.Genet.切tol.22:153-166(G;化yson等人， 1980年，《加拿大遺傳學(xué)與細(xì)胞學(xué)雜志》，第22卷，第153-166頁(yè)）。
[0035] 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可使用保留該基因的雄性不育控制性質(zhì)的多 種變型、突變型、衍生型，包括比所示整條序列更短的片段。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可W通 過(guò)W下所述來(lái)容易地評(píng)估變體或片段：引入到對(duì)于Ms9的穩(wěn)定雄性不育等位基因而言為純 合的植物中，隨后觀(guān)察植物的雄性組織發(fā)育。
[0036] 本發(fā)明的序列可分離自任何植物，包括但不限于玉米狂eamays)、卡諾拉油 菜（甘藍(lán)型油菜度rassicanapus)、憲菁度rassicarapassp.))、首猜（Medicago sativa)、水稻（Oryzasativa)、黑麥（Secalecereale)、高梁（So;r曲umbicolo;r、So;r曲um vulgare)、向日葵(Helianthusannuus)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycine max)、煙草（Nicotianatabacum)、粟(Panicumspp.)、馬鈴馨(Solanumtuberosum)、 落花生(Arachishypogaea)、棉花(Gossypiumhirsutum)、甘馨(Ipomoeabatatus)、 木馨（Manihotes州lenta)、咖啡（Cofeaspp.)、挪子（Cocosnucifera)、渡蘿（Ananas comosus)、相橘(Citrusspp.)、可可（Theobromacacao)、茶（Camelliasinensis)、香 蕉（Musaspp.)、鱷梨（Perseaamericana)、無(wú)花果（Fi州scasica)、番石惱（Psidium guajava)、芒果（Mangiferaindica)、橄攬（Oleaeuropaea)、燕麥（Avenasativa)、大麥 化ordeumvulgare)、蔬菜類(lèi)、觀(guān)賞植物類(lèi)和針葉樹(shù)類(lèi)。優(yōu)選地，植物包括玉米、大豆、向日 葵、紅花、卡諾拉油菜、小麥、大麥、黑麥、首猜、水稻、棉花和高梁。
[0037] 來(lái)自其他植物的序列可根據(jù)熟知的技術(shù)，基于它們與本文所示編碼序列的同源編 碼區(qū)的序列同源性來(lái)分離。在運(yùn)些技術(shù)中，將已知的編碼序列的全部或者一部分用作探針， 所述探針與來(lái)自所選生物體的克隆的基因組DNA片段群體（即基因組文庫(kù)）中存在的其他 序列選擇性雜交。本領(lǐng)域易于獲得用于核酸序列雜交的方法。有關(guān)核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可 在女日下文南犬中找到：Tijssen,I曰bor曰torvTechniquesinBiochemistry曰nd Molecul曰r BioloRV-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridiz曰tion曰nd the strategy of nucleic曰cid probe曰ss曰ys"， Elsevier, New化rk(1993)燈ijssen，《生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)--用核酸探針 的雜交》，第I部分，第2章，"有關(guān)雜交原理和核酸探針?lè)治霾呗缘木C述"，愛(ài)思唯爾，紐約， 1993年）和CurrentProtocolsinMolecular BioloRV, Chapter 2, Ausubel, et al., Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，化w York(1995).(《最新分子生物學(xué) 實(shí)驗(yàn)方法匯編》，第2章，Ausubel等人編輯，格林出版和Wil巧-Interscience出版公司，紐 約，1995年）。
[0038] 因此，本發(fā)明還包括在嚴(yán)格條件下與Ms9核巧酸序列選擇性雜交的那些核巧酸序 列。在提及與Ms9 "選擇性雜交"的序列時(shí)，該術(shù)語(yǔ)包括指核酸序列在嚴(yán)格雜交條件下與指 定的核酸祀序列的雜交達(dá)到比其與非祀核酸的雜交可檢測(cè)地更高的程度。
[0039] 術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格條件"或者"嚴(yán)格雜交條件"包括指探針與其祀序列雜交的程度將比它 與其他序列雜交的程度可檢測(cè)地更高的條件。嚴(yán)格條件是祀序列依賴(lài)性的，并且將因多核 巧酸的結(jié)構(gòu)而不同。通過(guò)控制雜交和/或洗涂條件的嚴(yán)格性，可鑒定與探針100%互補(bǔ)的祀 序列（同源探測(cè)）?；蛘?，可W調(diào)節(jié)嚴(yán)格條件W允許序列中的一些錯(cuò)配，從而檢測(cè)到較低程 度的相似性（異源探測(cè)）。一般來(lái)講，該類(lèi)型的探針在約1000個(gè)核巧酸長(zhǎng)至約250個(gè)核巧 酸長(zhǎng)的范圍內(nèi)。 W40]有關(guān)核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可在如下文獻(xiàn)中找到：Tijssen，L油oratory Techniques inBiochemistry and MolecularBioloRV-HybridizationwithNucleic AcidProbes, Part I，Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays"，Elsevier，New York(1993) (Tijssen， 《生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)--用核酸探針的雜交》，第I部分，第2章，"有關(guān)雜 交原理和核酸探針?lè)治霾呗缘木C述"，愛(ài)思唯爾，紐約，1993年）和Current Protocols inMolecular BioloRV, Chapter 2，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing and 1;[1巧-1]116'3(316]1〇6，化￥ York(1995)(《最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編》，第2章，Ausubel 等人編輯，格林出版和Wil巧-Interscience出版公司，紐約，1995年）。另參見(jiàn)Sambrook， et al. , (1989)MolecularCloning :ALaboratory Manual(2nd ed. Cold Spring Harbor L油oratory, Cold Spring Harbor, N. Y.) (Sambrook等人，1989年，《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手 冊(cè)》，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約冷泉港）。
[0041] 一般來(lái)講，對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的核巧酸序列并且與本文公開(kāi)的核巧酸序列雜交的序 列將與所公開(kāi)的序列具有至少50 %同源性、70 %同源性W及甚至85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性或更大。旨日，探針與 祀標(biāo)之間的序列相似性可在共用至少約50%、約70%和甚至約85%或更大序列相似性的 范圍內(nèi)。
[0042] 特異性通常隨雜交后的洗涂而變化，關(guān)鍵因素為最終洗涂溶液的離子強(qiáng)度和溫 度。一般來(lái)講，將嚴(yán)格洗涂溫度條件選擇為比特定序列在確定的離子強(qiáng)度和抑下的解鏈溫 度（Tm)低約5°C至約2°C。DNA的解鏈溫度或變性發(fā)生在較窄溫度范圍內(nèi)，表示雙螺旋分裂 為其互補(bǔ)單鏈。該過(guò)程由轉(zhuǎn)變中點(diǎn)的溫度Tm(也稱(chēng)為解鏈溫度）描述。本領(lǐng)域有用于測(cè)定 解鏈溫度的公式。
[0043] 本發(fā)明核巧酸序列的優(yōu)選雜交條件包括在42°C下于50% (w/v)甲酯胺、6XSSC、 0. 5% (w/v)SDS、lOOg/ml娃魚(yú)精DNA中雜交。示例性的低嚴(yán)格洗涂條件包括在42°C下于2X SSC、0. 5% (w/v)SDS的溶液中雜交30分鐘并重復(fù)。示例性的中等嚴(yán)格條件包括在50°C下 于2XSSC、0.5% (w/v)SDS中洗涂30分鐘并重復(fù)。示例性的高嚴(yán)格條件包括在65°C下于 0.IXSSC、0. 1% (w/v)SDS中洗涂30分鐘到一小時(shí)并重復(fù)?？墒褂盟蠾上條件獲得與本 發(fā)明啟動(dòng)子相對(duì)應(yīng)的序列。出于限定本發(fā)明的目的，使用高嚴(yán)格條件。
[0044] 如下術(shù)語(yǔ)用來(lái)描述兩條或更多條核酸或多核巧酸之間的序列關(guān)系：(a)"參考序 列"、化）"比較窗口"、（C)"序列同一性及（d)"序列同一性百分?jǐn)?shù)"。
[0045] (a)本文所用的"參考序列"是用作序列比較的基礎(chǔ)的確定序列。參考序列可W是 指定序列的子集或全體；例如，作為全長(zhǎng)cDNA或基因序列的區(qū)段，或者完全的cDNA或基因 序列。
[0046] 化）本文所用的"比較窗口"是指多核巧酸序列的連續(xù)的且指定的區(qū)段，其中該比 較窗口中的多核巧酸序列相比于參考序列（不包含添加或缺失）可包含添加或缺失（即 空位），W便兩條序列進(jìn)行最佳比對(duì)。通常，比較窗口為至少20個(gè)連續(xù)核巧酸長(zhǎng)，任選可