Cyp4f2基因的檢測(cè)引物組、其構(gòu)成的反應(yīng)體系及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種CYP4F2基因的檢測(cè)引物組、其構(gòu)成 的反應(yīng)體系及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 華法林，是一種香豆素類(lèi)抗凝劑，作為臨床應(yīng)用最為廣泛的抗凝藥物之一，具有價(jià) 格低廉，小劑量即可起效等優(yōu)點(diǎn)，主要用于防治靜動(dòng)脈血栓栓塞性疾病，適用患者人群為屯、 臟瓣膜置換、房顫、深靜脈血栓和肺栓塞患者。但是，目前在臨床上，華法林的用藥面臨一個(gè) 嚴(yán)重的問(wèn)題，即華法林的給藥劑量非常難W掌握，劑量不足會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)血栓的產(chǎn)生，而劑量 稍大則會(huì)加大出血的傾向。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)外臨床工作者們多采用定期監(jiān)測(cè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR)和凝血酶原時(shí) 間（PT)兩種手段監(jiān)測(cè)華法林的臨床藥效。而近年來(lái)，對(duì)于華法林藥效學(xué)影響因素的研究熱 點(diǎn)則主要集中在遺傳藥物基因組學(xué)方面運(yùn)個(gè)研究領(lǐng)域。由于華法林的抗凝作用主要由S-華 法林產(chǎn)生，而S-華法林的體內(nèi)代謝主要是由細(xì)胞色素 P450酶超家族中的CYP2C9完成CYP2C9 可W催化人體內(nèi)的華法林成為無(wú)活性形式6-或7-徑基華法林，所WCYP2C9的活性對(duì)華法林 的抗凝治療效果有著十分重要的影響。除此之外，另外一種等位基因 CYP4F2的遺傳多態(tài)性 與華法林劑量也有不可忽視的關(guān)聯(lián)。CYP4F2*3(rs2108622C〉T，V433M)可導(dǎo)致細(xì)胞色素藥物 酶活性降低，相反患者體內(nèi)維生素 K的濃度會(huì)增高。所W攜帶運(yùn)種突變型等位基因的患者在 使用華法林時(shí)，體內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)與野生型等位基因攜帶者相比會(huì)大大增高。因此，臨床上在使 用華法林進(jìn)行治療的過(guò)程中，對(duì)于CYP4F2*3突變型等位基因的檢測(cè)，會(huì)給華法林的安全使 用帶來(lái)更可靠的保障。
[0004] 目前，臨床及市場(chǎng)上針對(duì)CYP4F2的突變型等位基因檢測(cè)已經(jīng)有了商品化的試劑 盒，運(yùn)些試劑盒所采用的技術(shù)主要包括化qman-MGB巧光探針?lè)ā⒁合嗳唐ā⒁淮鷾y(cè)序法、 二代測(cè)序法。CN 104561302A公開(kāi)了一種CYP4F2基因多態(tài)性的檢測(cè)探針，所述檢測(cè)探針的核 巧酸序列選自序列1和序列2,5'和3'端分別具有巧光基團(tuán)和澤滅基團(tuán)，并且巧光基團(tuán)所發(fā) 巧光的波長(zhǎng)峰值在不同的位置。運(yùn)些技術(shù)手段均在不同方面展現(xiàn)出了自己的優(yōu)勢(shì)，但是也 都普遍存在檢測(cè)儀器及配套試劑耗材購(gòu)買(mǎi)成本高昂，檢測(cè)需要復(fù)雜的變溫循環(huán)過(guò)程，周期 長(zhǎng)、操作繁瑣且假陽(yáng)性率時(shí)有出現(xiàn)的問(wèn)題。因此，發(fā)明并構(gòu)建一套價(jià)格低廉，使用操作簡(jiǎn)便 且利于臨床檢驗(yàn)大范圍普及的商品化試劑盒就顯得十分重要。
[0005] 環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是日本科學(xué)家于2000年提出的一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)， 其主要特點(diǎn)是針對(duì)祀基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，在鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)的作用下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，僅需15-90分鐘即可產(chǎn)生IO9-IOW數(shù)量級(jí)的產(chǎn)物。具有 敏感性高、特異性好、操作簡(jiǎn)便、成本低廉且結(jié)果易于判定的優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為了克服上述方法的缺陷，提供一種CYP4F2基因的檢測(cè)引物組、其構(gòu)成的 反應(yīng)體系及應(yīng)用，所述檢測(cè)體系具有敏感性高、特異性好和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
[0007]為達(dá)到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[000引第一方面，本發(fā)明提供一種CYP4F2基因的檢測(cè)引物組，所述檢測(cè)引物組如下：
[0009] 正向外側(cè)引物F3:
[0010] 反向外側(cè)引物B3:
[00川正向內(nèi)側(cè)引物Fn G;
[001 ^ 反向內(nèi)側(cè)引物Bn T；
[oou] 反向內(nèi)側(cè)引物Bn T。
[0014] 優(yōu)選地，所述SEQ ID NO: 1-4所示的序列是用于檢測(cè)rs2108622位點(diǎn)的C等位基因。
[0015] 優(yōu)選地，所述沈Q ID NO: 1-3和沈Q ID NO: 5所示的序列是用于檢測(cè)rs2108622位 點(diǎn)的T等位基因。
[0016] 本發(fā)明中，外側(cè)引物記為正向外側(cè)引物F3和反向外側(cè)引物B3,內(nèi)側(cè)引物記為正向 內(nèi)側(cè)引物FIP和反向內(nèi)側(cè)引物BIP，其中FIP包含了Flc和F2，BIP包含了Blc和B2,上述引物均 由在線軟件PrimerE邱Iorer V4設(shè)計(jì)。本發(fā)明在普通LAMP的基礎(chǔ)上，W特異性要求最嚴(yán)格的 Blc的5'端針對(duì)rs2108622位點(diǎn)設(shè)計(jì)等位基因特異引物，分別檢測(cè)rs2108622的C等位基因和 rs2108622的T等位基因。通過(guò)分別在BIPC和BIPT的5'端第S位引進(jìn)額外突變，進(jìn)一步降低 非特異性擴(kuò)增的可能性。
[0017] 第二方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)CYP4F2基因的反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系包括第一 方面所述的引物組，反應(yīng)緩沖液，dNTPs，徑基糞酪藍(lán)，甜菜堿，Bst DNA聚合酶，待檢樣品基 因組DNA和去離子水。
[001引優(yōu)選地，所述反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCl，KC1，（NH4)2S04，MgS04和Tween-20。
[0019]優(yōu)選地，所述Tr i S-HCI 的濃度為 10-30mM，例如可 W 是 IOmM、I ImM、12mM、13mM、 151111、161111、181111、2〇1111、22111]\1、23111]\1、25111]\1、261111、281111或3〇1111，優(yōu)選為15-251111，進(jìn)一步優(yōu)選為 2 OmM O
[0020] 優(yōu)選地，所述 KCl 的濃度為 10-60mM，例如可 W 是 10mM、llmM、12mM、15mM、18mM、 20mM、23mM、2 日mM、30mM、3 日mM、40mM、4 日1111、5〇1111、51111]\1、52111]\1、531111、541111、5日1111或6〇1111，優(yōu)選為 50-55mM，進(jìn)一步優(yōu)選為50mM。
[0021] 優(yōu)選地，所述(NH4)2S04 的濃度為 5-13mM，例如可 W 是 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、 "mM、12mM或13mM，優(yōu)選為8-12mM，進(jìn)一步優(yōu)選為1 OmM。
[0022] 優(yōu)選地，所述 MgS〇4 的濃度為 2-8mM，例如可 W 是 2111]\1、31111、41111、5111]\1、6111]\1、71111或81111， 優(yōu)選為2-6mM，進(jìn)一步優(yōu)選為4mM。
[0023] 優(yōu)選地，所述Tween-20的體積分?jǐn)?shù)為0.1-1 %，例如可W是0 .!%、0.2%、0.3%、 0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%，優(yōu)選為0.1%。
[0024] 優(yōu)選地，所述dNTPs的濃度為 1 -2mM，例如可 W是 ImM、1. ImM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、 1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2mM，優(yōu)選為1.2-1.8mM，進(jìn)一步優(yōu)選為1.4mM。
[00巧]優(yōu)選地，所述徑基糞酪藍(lán)的濃度為108-130咖，例如可W是10如M、10化 111山1、112山1、115山1、116山1、11祉]?、120山1、122山1、125山1、126山1、12祉]\1或130山1，優(yōu)選為115-123iiM，進(jìn)一步優(yōu)選為120iiM。
[00%] 優(yōu)選地，所述甜菜堿的濃度為0.1-lM，例如可W是0.謹(jǐn)、0.21、0.4]?、0.61、0.81或 IM，優(yōu)選為0.5-0.8M，進(jìn)一步優(yōu)選為0.8M。
[0027]作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述反應(yīng)體系包括反應(yīng)體系C和反應(yīng)體系T，其中每個(gè)25iiL反 應(yīng)體系含有W下組分：
[002引緩沖液： Tris-HCl mM KCl 5 0 mM 巧 H4)2S04 10 mM MgS04 4 mM Tween-20 0 1% (體積分?jǐn)?shù)) 做TPs 1.4 mM 徑基蔡酷藍(lán) 120 pM
[0029] 敵菜堿 0.8 M 巧 々.4 JiM B3 0.4 卿 FIP 1.6 MM BIPC/BIPT 1.6 IiM Bst DNA聚合酶 8 U 待檢測(cè)樣品基因組 0滿-4 ng/|正 去離子水加至25叫L。
[0030] 第=方面，本發(fā)明提供一種如第二方面所述的反應(yīng)體系的使用方法，所述方法包 括如下步驟：
[0031] 將反應(yīng)體系C和反應(yīng)體系T所需各組分混合完畢，放置于恒溫水浴鍋進(jìn)行反應(yīng)，反 應(yīng)后升溫進(jìn)行滅活處理，再根據(jù)體系顏色變化判定結(jié)果。
[0032] 優(yōu)選地，所述恒溫水浴鍋的溫度為55-70C，例如可W是55r、56r、57r、58r、59 °C、60°C、6rc、62°C、63°C、64°C、65°C、68°C、69°C或70°C，優(yōu)選為60-68°C，進(jìn)一步優(yōu)選為65 〇c。
[0033] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)時(shí)間為15-90min，例如可W是15min、20min、25min、30min、 35min、40min、45min、SOmin、55min、60min、65min、TOmin、75min、SOmin、85min 或 90min，優(yōu)選 為45-90min，進(jìn)一步優(yōu)選為70min。
[0034] 優(yōu)選地，所述升溫后的溫度為78-90°C，例如可W是78°C、79°C、80°C、8rC、82°C、 83°(：、84°(：、85°(：、86°(：、87°(：、88°(：、89°(：或90°(：，優(yōu)選為80-85°(：，進(jìn)一步優(yōu)選為80°(：。
[0035] 優(yōu)選地，所述升溫后的反應(yīng)時(shí)間為15-30min，例如可W是15min、16min、17min、 18min、19111；[]1、2〇111；[]1、22111；[]1、25111；[]1、26111；[]1、28111；[]1或3〇111；[]1，優(yōu)選為18-26111；[]1，進(jìn)一步優(yōu)選為 20min。
[0036] 優(yōu)選地，所述根據(jù)體系顏色變化判定結(jié)果為：
[0037] 反應(yīng)體系C為紫羅蘭，反應(yīng)體系T為天藍(lán)色，則待測(cè)位點(diǎn)基因型為T(mén)T;
[0038] 反應(yīng)體系C為天藍(lán)色，反應(yīng)體系T為紫羅蘭，則待測(cè)位點(diǎn)基因型為CC;
[0039] 反應(yīng)體系C為天藍(lán)色，反應(yīng)體系T為天藍(lán)色，則待測(cè)位點(diǎn)基因型為CT。
[0040] 第四方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)CPY4F2基因的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含如第 二方面所述的反應(yīng)體系。
[0041] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：