低-磷酸鹽可阻遏的啟動子的制作方法
【專利說明】低-磯酸鹽可阻遏的啟動子
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2013年3月14日提交的美國臨時專利申請序列號61/783, 641的 優(yōu)先權(quán)，為了所有的目的通過引用W其全部內(nèi)容并入本文。
[0003] 對"序列表"、表格、或作為ASCII文件提交的計算機程序列表附件的引用
[0004] 通過引用將W文件CX5-130W01_ST25.TXT書寫的序列表在此并入本文，所述文件 創(chuàng)建于2014年3月11日，32, 178字節(jié)，機器版本IBM-PC，MS-Windows操作系統(tǒng)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明提供了包含低-憐酸鹽可阻遏的啟動子的組合物和方法。特別地，本發(fā)明 提供了來自大腸桿菌巧.coli)的低-憐酸鹽可阻遏的啟動子。
[000引發(fā)明背景
[0007] 多種細菌的表達控制DNA序列已被經(jīng)轉(zhuǎn)化的細菌用來控制外來的（即，異源的） 多核巧酸的表達，W及控制同源基因的表達。事實上，近幾年來隨著遺傳工程的發(fā)展，利 用多種生物體作為宿主細胞來產(chǎn)生經(jīng)濟上期望的量的蛋白質(zhì)已經(jīng)成為可能。由于大腸桿 菌巧.coli)具有約20分鐘的短的生殖周期且可W利用多種糖來繁殖，在蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng) 中其被廣泛地用作宿主細胞。此外，可用于大腸桿菌的大量質(zhì)粒載體已被開發(fā)。已經(jīng)用宿 主-載體系統(tǒng)實現(xiàn)了重組蛋白的快速且穩(wěn)定的工業(yè)生產(chǎn)，其中所述宿主-載體系統(tǒng)采用大 腸桿菌作為宿主細胞。盡管如此，對于較好的控制細菌基因表達仍有需求，特別是在商業(yè)化 生產(chǎn)過程系統(tǒng)中。
[000引發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明提供了包含低-憐酸鹽可阻遏的啟動子的組合物和方法。特別地，本發(fā)明 提供了來自大腸桿菌的低-憐酸鹽可阻遏的啟動子。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用 于通過如本文提供的低-憐酸鹽可阻遏的啟動子的調(diào)節(jié)作用，控制感興趣的至少一種產(chǎn)物 的表達的方法。事實上，意圖本發(fā)明在感興趣的基因的選擇性表達中提供優(yōu)勢。在一些實施 方案中，如期望的，本發(fā)明提供了在微生物培養(yǎng)物的生長期間，使某些基因的表達沉默（也 就是，"關(guān)閉"）的工具。
[0010] 本發(fā)明提供了包括期望的表型的重組微生物，其中通過使微生物暴露至有限的憐 酸鹽濃度的條件來獲得期望的表型。在一些實施方案中，微生物的基因組包括改變微生物 的憐酸鹽敏感性的至少一個突變。在一些另外的實施方案中，微生物在psts中包括至少一 個突變。在一些另外的實施方案中，pstS突變選自T10M、T10Y、D56S和/或T139H。在一 些另外的實施方案中，pstS突變選自T10M、T10Y、D56S和/或T139H，其中氨基酸位置參考 SEQIDN0:3被編號。在一些仍然另外的實施方案中，在培養(yǎng)基內(nèi)存在重組微生物并且通過 在至少一個異源調(diào)控序列的控制下表達至少一個基因來獲得期望的表型且所述異源調(diào)控 序列響應(yīng)于培養(yǎng)基的憐酸鹽濃度。在一些實施方案中，微生物包括化〇1和/或化〇17啟動 子。在一些實施方案中，重組微生物包括SEQIDNO:4所列的化〇1序列。在一些另外的實 施方案中，重組微生物包括SEQIDNO: 5所列的化〇17序列。在一些另外的實施方案中，重 組微生物包括560 10^:4所列的化〇1序列和/或560 10^:5所列的化〇17序列。在 仍然一些另外的實施方案中，微生物是大腸桿菌。
[0011] 本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生至少一種異源多膚的方法，所述方法包括在包含低濃度 的憐酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼至少一種異源多膚的至少一種多核巧酸序列的重組微 生物，W使得至少一種多核巧酸被表達并產(chǎn)生至少一種異源多膚。在一些實施方案中，至少 一種異源多膚由異源基因編碼，其中所述異源基因在基因的調(diào)控區(qū)中包含至少一個突變。 在一些實施方案中，所述方法還包括回收至少一種多膚的步驟。在一些實施方案中，重組微 生物在psts中包含至少一個突變。在一些另外的實施方案中，psts突變選自T10M、T10Y、 D56S和/或T139H。在一些另外的實施方案中，pstS突變選自T10M、T10Y、D56S和/或 T139H，其中氨基酸位置參考SEQIDN0:3被編號。在一些另外的實施方案中，重組微生物 包含化〇1和/或化〇17啟動子。在一些實施方案中，重組微生物包括SEQIDN0:4所列 的化〇1序列。在一些另外的實施方案中，重組微生物包含SEQIDNO: 5所列的的化〇17序 列。在仍然一些另外的實施方案中，重組微生物包含SEQIDNO:4所列的化〇1序列和SEQ IDN0:5所列的化〇17序列。在一些實施方案中，微生物是大腸桿菌。在一些另外的實施方 案中，與不包含至少一個可阻遏的啟動子的重組微生物相比，重組微生物產(chǎn)生增加的產(chǎn)量 的至少一種異源多膚。在一些另外的實施方案中，與不包含可阻遏的啟動子的重組微生物 相比，重組微生物產(chǎn)生增加的產(chǎn)量的至少一種產(chǎn)物。在一些實施方案中，產(chǎn)物包括至少一種 醇。在一些另外的實施方案中，至少一種異源多膚選自真核多膚和原核多膚。
[0012] 本發(fā)明還提供了包含化〇1的低-憐酸鹽可阻遏的啟動子。在一些實施方案中， 化〇1啟動子包含SEQIDN0:4。在一些另外的實施方案中，本發(fā)明還提供了包含化〇17的 低-憐酸鹽可阻遏的啟動子。在一些實施方案中，Phol7啟動子包含SEQIDN0:5。
[0013] 本發(fā)明還提供了包含至少一種低-憐酸鹽可阻遏的啟動子的表達構(gòu)建體。在一些 實施方案中，表達構(gòu)建體包括化〇1啟動子和/或化〇17啟動子。在一些另外的實施方案 中，化〇1啟動子包含SEQIDN0:4。在一些另外的實施方案中，Phol7啟動子包含SEQID N0:5。
[0014] 本發(fā)明還提供了包含至少一種低-憐酸鹽可阻遏的啟動子的重組宿主細胞，其中 所述啟動子為低-憐酸鹽可阻遏的啟動子化〇1和/或化〇17。在一些另外的實施方案中， 化〇1啟動子包含560 10^:4。在一些另外的實施方案中，？11〇17啟動子包含560 10^:5。 在一些實施方案中，宿主細胞表現(xiàn)出期望的表型。
[0015] 附圖簡述
[001引圖1提供了啟動子化ol(SEQIDN0:4)和化ol7(SEQIDN0:w的部分DNA序列。 在該圖中，根據(jù)Diniz等人值iniz等人，J.Bact. 193:6929-6938[2011])，箭頭指示Pho框 的定位和方向。斜體字顯示了化〇17中改變的堿基。還指示了啟動子的-35和-10區(qū)。 [0017]圖2提供了顯示如在實施例2中描述的卡那霉素-Phol啟動子盒的結(jié)構(gòu)的示意 圖。
[001引發(fā)明描述
[0019] 基因表達的適當(dāng)控制對于經(jīng)濟上可行的生物技術(shù)商業(yè)化過程的發(fā)展來說是必要 的。主要的考慮是需要細胞機器W過度產(chǎn)生大量的商業(yè)上相關(guān)的一種并且往往多于一種產(chǎn) 物。但是，在正常情況下，細胞利用多種機制，所述多種機制避免細胞所不需要的任何分子 的過度生產(chǎn)。運些機制之一是通過控制轉(zhuǎn)錄啟動子的活性實現(xiàn)的基因表達的嚴緊調(diào)控。轉(zhuǎn) 錄啟動子（本文稱為"啟動子"）是于該處RNA聚合酶結(jié)合，W起始DNA轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生能夠 執(zhí)行生物學(xué)功能的RNA的染色體區(qū)域。啟動子活性通過增強或減少啟動子驅(qū)動RNA產(chǎn)生的 能力的激活和/或阻遏機制來控制。在利用大腸桿菌作為生產(chǎn)宿主的大多數(shù)生物技術(shù)過程 中，通常使用強啟動子。運些啟動子通常通過抑制RNA聚合酶與啟動子的生產(chǎn)性相互作用 的阻遏物的結(jié)合來控制。
[0020] 在大腸桿菌和其他細菌中最廣泛使用的啟動子系統(tǒng)是乳糖啟動子（Plac)及其阻 遏物L(fēng)acI。該系統(tǒng)通常在實驗室中通過添加安慰誘導(dǎo)物異丙基-P-D-硫代半乳糖巧酶 (IPTG)來誘導(dǎo)。大腸桿菌中的另一種常見的表達系統(tǒng)源自化oA啟動子和PstS啟動子，所 述表達系統(tǒng)僅在生長培養(yǎng)基中的憐酸鹽（Pi)的水平低時，被化oB蛋白質(zhì)激活。憐酸鹽作 為調(diào)芐基因表達的方式的應(yīng)用是特別有用的，因為憐酸鹽通常被添加到大多數(shù)生長培養(yǎng)基 中，且其水平可容易地被控制。在很多細菌中，含憐化合物的同化作用取決于細胞外的Pi 濃度并且基于由雙組分調(diào)控系統(tǒng)控制的傳感機制。在大腸桿菌和一些其他物種中，所述系 統(tǒng)由地oB和地oR基因編碼。地oR是監(jiān)控憐酸鹽的細胞外可用性的傳感器組氨酸激酶， 而化oB是控制基因表達的響應(yīng)調(diào)控因子。大腸桿菌對低-憐酸鹽條件的響應(yīng)設(shè)及化oR 自身憐酸化和Pi到化oB的轉(zhuǎn)移。憐酸化的化oB(PhoB~Pi)W比非憐酸化的化oB高的 親和力與DNA結(jié)合并發(fā)揮其對基因表達的調(diào)控功能。在大腸桿菌中，化oB~Pi通過與位 于Pho調(diào)節(jié)子基因的啟動子的上游的被稱為"Pho"框"的保守的18-bpDNA序列結(jié)合，激 活多于40個基因（即，Pho調(diào)節(jié)子）的表達（參見例如，化sieh和Wanner,化rr.化in. Microbiol.，13:198-203巧010])。大腸桿菌共有Pho框CT(G或T)TCATA(A或T)A(A或 T)CTGTCA燈或C)(SEQIDN0:1)由通過保守的4-bpAT富集的間隔序列分隔開的兩個 7-bp定向重復(fù)組成（參見，Blanco等人，St;ruc1:ure10:701-713 [2002];和Diniz等人， J.Bact.，193:6929-6938巧011])。
[0021] 如本文描述的，當(dāng)需要關(guān)閉基因（例如，因為其產(chǎn)物不是所需要的）和/或基因產(chǎn) 物的存在干擾期望的產(chǎn)物的過度生產(chǎn)時，低-憐酸鹽可阻遏的啟動子的應(yīng)用是有用的。事 實上，如本文描述的，本發(fā)明提供了可W通過低憐酸鹽條件阻遏的用于大腸桿菌的新的啟 動子系統(tǒng)。
[0022] 在一些另外的實施方案中，宿主細胞的憐酸鹽傳感器機制被改進。盡管并非意圖 本發(fā)明限于任何特定的機制，但是大腸桿菌的PstS傳感器的憐酸鹽-結(jié)合口袋中的突變可 W影響其對憐酸鹽的親和力并且結(jié)果是影響傳感器機制的敏感性（參見例如，美國專利號 5, 304, 472;Yao等人；Biochem.，35:2079-2085 [1996])。在內(nèi)源性大腸桿菌pstS基因中 引入突變的任何合適的方法在本發(fā)明中具備實用性，所述合適的方法包含但不限于如本文 描述的利用AR邸重組工程技術(shù)的寡核巧酸定點誘變。在一些另外的實施方案中，參與無 機憐酸鹽傳感機制的一個或更多個基因（例如，phoB、地oR、phoU、pstsA、ps1:B、pstC、和/ 或pst巧中的突變在改變利用本發(fā)明產(chǎn)生的宿主菌株的憐酸鹽敏感性中具備實用性。并非 意圖本發(fā)明限于任何特定基因中的任何特定突變，也不意圖本發(fā)明限于任何特定的培養(yǎng)條 件。在一些實施方案中，宿主菌株是大腸桿菌。事實上，意圖本發(fā)明在通過包含本發(fā)明的至 少一個憐酸鹽-可阻遏的啟動子的細菌產(chǎn)生任何合適的異源多膚中具備實用性。
[0023] 帝義:
[0024]除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語通常具有與本發(fā)明所屬于的 領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。通常，本文使用的命名法和W下描述的細 胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、微生物學(xué)、有機化學(xué)、分析化學(xué)、和核酸化學(xué)的實驗室程序是本領(lǐng)域公 知且被通常地采用的。此類技術(shù)是公知的并被描述于本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的許多文本和 參考著作中。將本文前文和下文兩者提到的所有專利、專利申請、文章和出版物在此通過引 用明確地并入本文。
[0025] 盡管與本文描述的那些相似或等價的任何合適的方法和材料在本發(fā)明的實踐中 具備實用性，本文描述了一些方法和材料。要理解本發(fā)明不限于所描述的特定方法論、方案 和試劑，因為取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員使用其的上下文，運些可W改變。因此，W下緊接著定 義的術(shù)語通過參考本申請整體被更充分地描述。
[0026] 同樣，如本文使用的，除非上下文另外明確指出，術(shù)語"一個（a)"、" 一種（an)"和 "該（the)"包括復(fù)數(shù)指代物。數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)字。因此，本文公開的每個數(shù) 值范圍意圖包括落在此類較寬的數(shù)值范圍的每個較窄的數(shù)值范圍，如同在本文中此類較窄 的數(shù)值范圍被全部明確地寫出。還意圖本文公開的每個最大的（或最小的）數(shù)值限制包含 每個較低（或較高）的數(shù)值限制，如同在本文中此類較低（或較高）數(shù)值限制被明確地寫 出。此外，本文提供的標題并不是可通過參考本申請整體得到的本發(fā)明的多個方面或?qū)嵤?方案的限制。盡管如此，為了利于本發(fā)明的理解，W下定義了許多術(shù)語。除非另外指出，分 別從左到右W5'到3'的方向書寫核酸；從左到右W氨基到簇基的方向書寫氨基酸序列。
[0027] 如本文使用的，術(shù)語"包括（comprising)"及其同根詞W其包含性含義被使用 (即，等價于術(shù)語"包含（including)"及其相應(yīng)的同根詞）。
[0028] 如本文使用的，術(shù)語"憐酸鹽消耗"指與培養(yǎng)基中常規(guī)使用的憐酸鹽濃度相比，培 養(yǎng)基中憐酸鹽的顯著減少。如本領(lǐng)域已知的，取決于使用的大腸桿菌菌株、接種量、初始憐 酸鹽濃度和生長培養(yǎng)基的抑，當(dāng)憐酸鹽濃度低于大約50微摩爾時，化oB-PhoR系統(tǒng)被誘 導(dǎo)（參見例如，Lubke等人，E；nz.Microb.Technol.，17 :923-928[199引）。然而，還已知，在 一些條件下，當(dāng)憐酸鹽濃度小于大約4微摩爾時，獲得最大的誘導(dǎo)（參見例如，化sieh和 Wanner,同上）。因而，并非意圖本發(fā)明限于任何特定的初始或過程中產(chǎn)生的憐酸鹽濃度、特 定細菌菌株、或其他生長條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白如何改變條件，W使所使用的菌株的性 能最佳化。
[0029] 如本文使用的，"憐酸鹽結(jié)合區(qū)域"是與憐酸鹽結(jié)合的蛋白質(zhì)區(qū)域。
[0030] 如本文使用的，大腸桿菌叩Sts蛋白質(zhì)"指由細菌細胞中的"PstS基因"編碼的蛋 白質(zhì)，所述細菌細胞包含但不限于腸桿菌科（例如，大腸桿菌）。在一些實施方案中，大腸桿 菌PstS分別地包含W下多膚和多核巧酸序列：
[0034]如本文使用的酶變體"和"變異酶"，包括"PstS變體"，用于指與參考酶相似（尤 其在它們的功能上），但是在其氨基酸序列中具有突變使其在序列上不同于野生型或另一 種參考酶的酶。可W通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的很多種不同的誘變技術(shù)制備酶變體。另 夕F，誘變試劑盒也是從很多商業(yè)的分子生物學(xué)供應(yīng)商可得的。對于在限定的氨基酸上形成 特定的取代（定點）、在基因的局部區(qū)域中形成特定的或隨機的突變（區(qū)域特定的）或在整 個基因上形成隨機誘變（例如，飽和誘變），方法是可得的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知形成酶 變體的許多合適的方法，包含但不限于利用PCR的單鏈DNA或雙鏈DNA的定點誘變、盒式誘 變、基因合成、易錯PCR、重排、和化學(xué)飽和誘變或本領(lǐng)域已知的任何其他合適方法。在產(chǎn)生 變體之后，可針對任何合適的期望的特性對其篩選。
[003引如本文使用的，術(shù)語"啟動子"指轉(zhuǎn)錄啟動子（即，指導(dǎo)多核巧酸的轉(zhuǎn)錄的序列）。
[0036] 如本文使用的，"啟動子序列"是被宿主細胞識別，用于編碼區(qū)的表達的核酸序列。 控制序列可W包含適當(dāng)?shù)膯幼有蛄小幼有蛄邪閷?dǎo)多膚的表達的轉(zhuǎn)錄控制序列。 啟動子可W是在所選的宿主細胞內(nèi)顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的啟動子、截 短的啟動子、和雜合啟動子，并且可W從編碼宿主細胞內(nèi)源性或異源性的細胞外或細胞內(nèi) 多膚的基因獲得。
[0037] 如本文使用的，"細菌啟動子"指能夠起始細菌細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄的啟動子。在一些實 施方案中，啟動子能夠調(diào)節(jié)至少一個多核巧酸的轉(zhuǎn)錄。在一些實施方案中，細菌啟動子是大 腸桿菌啟動子。
[0038] 如本文使用的，"可阻遏的啟動子"是在某些條件下表現(xiàn)出降低的發(fā)揮功能的能力 的啟動子。
[0039] 如本文使用的，"憐酸鹽-調(diào)節(jié)的啟動子"是轉(zhuǎn)錄啟動子，其中啟動子發(fā)揮功能的能 力通過用于培養(yǎng)啟動子居于其中的細胞的生長培養(yǎng)基中的憐酸鹽水平來調(diào)節(jié)。
[0040] 如本文使用的，"憐酸鹽敏感性"指培養(yǎng)基中的憐酸鹽對憐酸鹽-調(diào)節(jié)的啟動子的 影響。在一些實施方案中，啟動子對憐酸鹽濃度相對不敏感（即，憐酸鹽濃度對啟動子的活 性沒有影響），而在一些其他的實施方案中，啟動子對憐酸鹽濃度非常敏感（即，憐酸鹽濃 度極大地影響啟動子的活性）。
[0041]如本文使用的低-憐酸鹽可阻遏的啟動子"是轉(zhuǎn)錄啟動子，其中與在其中用于培 養(yǎng)包含啟動子的細菌的生長培養(yǎng)基中（如在通常用于培養(yǎng)細菌的生長培養(yǎng)基中）的憐酸鹽 處于高濃度的條件下啟動子的功能性能力相比，在低-憐酸鹽條件下啟動子發(fā)揮功能的能 力降低。
[0042]如本文使用的，術(shù)語"低-憐酸鹽條件"指生長培養(yǎng)基中的憐酸鹽濃度低于大約50 微摩爾。
[0043]如本文使用的，術(shù)語"誘導(dǎo)型啟動子"指轉(zhuǎn)錄啟動子，其中啟動子有效地發(fā)揮功能 的能力需要化學(xué)或物理因子的存在或不存在。因而，在一些實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子的活 性受某些條件（例如，光、溫度、化學(xué)濃度、蛋白質(zhì)濃度等）的影響。
[0044]如本文使用的，術(shù)語"組成型啟動子"指在大多數(shù)，但是不一定所有的環(huán)境條件和 /或細胞發(fā)育和/或分化的狀態(tài)下，積極促進轉(zhuǎn)錄的啟動子。
[0045]如本文使用的，"任選的啟動子片段"指對于驅(qū)動可操作地連接的編碼區(qū)所不需要 的啟動子的任何子序列。在一些實施方案中，運些片段包括5'UTR(即，5'非翻譯區(qū)），W及 內(nèi)源性編碼區(qū)的任何外顯子。在一些另外的實施方案中，任選的啟動子片段包括任何外顯 子和存在于啟動子的上游（即，啟動子的5'）的基因的3'或5'。術(shù)語還包括任何位于中 間的序列（旨P，內(nèi)含子），W及存在于外顯子之間或外顯子和UTR之間的序列。
[0046]如本文使用的，術(shù)語"優(yōu)先轉(zhuǎn)錄"指響應(yīng)于特定的刺激（例如，低的或高的憐酸鹽 濃度）發(fā)生的轉(zhuǎn)錄?？蒞通過測量起始、速率和/或轉(zhuǎn)錄水平評價優(yōu)先轉(zhuǎn)錄。
[0047]如本文使用的，術(shù)語"調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄"指啟動子序列影響轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄的速率和/或 轉(zhuǎn)錄水平，W及任何其他相關(guān)的生物活性的上調(diào)和下調(diào)的活性。
[0048]如本文使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)錄起始位點"指在多核巧酸上起始轉(zhuǎn)錄的點。
[0049]如本文使用的，術(shù)語"表型"指菌株的可觀察的特征。運些特征由菌株的基因的表 達，W及環(huán)境因素的影響和兩者之間的相互作用引起。表型的實例包括但不限于特定的一 組條件下菌株的生長速率；菌株利用葡萄糖作為碳源的能力；和/或菌株在低-憐酸鹽生 長條件下表達某些基因的能力。
[0050]如本文使用的，"期望的表型"是通過菌株的至少一個遺傳修飾獲得的特定表型。 因而，期望的表型不同于遺傳修飾之前的菌株的表型。例如，在一些實施方案中，起始（即， 親本）菌株能夠在低憐酸鹽條件下表達某些基因并且期望的表型是在相同的生長條件下 不能表達此類基因的菌株。在一些另外的實施方案中，親本菌株能夠在高憐酸鹽條件下表 達某些基因并且期望的表型是在相同的生長條件下不能表達此類基因的菌株。
[0051]如本文使用的，"途徑"指參與引起產(chǎn)物和/或活性的產(chǎn)生的至少兩個連續(xù)的相互 作用的一組系統(tǒng)組分。術(shù)語包括多種途徑類型，包括但不限于生物化學(xué)途徑、基因表達途 徑、調(diào)控途徑、和/或運些示例性途徑類型的組合。
[0052]如本文使用的，術(shù)語"公共序列"指在可公開訪問的數(shù)據(jù)庫中儲存的任何序列。術(shù) 語包括氨基酸和核巧酸序列?？晒_訪問的數(shù)據(jù)庫的實例包括但不限于NCBIFTP網(wǎng)站、 GenBank、EuropeanBioinformaticsInstitue巧BI-EMBL)、DNADatebaseofJapan(DBBJ) 和化ooWiavenProteinDataBank(PDB)、W及與專利局（例如