大豆春化基因GmVRN1及其克隆方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于資源與環(huán)境技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大豆春化基因 GmVRNl及其克隆 方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆起源于中國，自古以來一直是我國主要的糧油作物之一。大豆籽粒中含有豐 富的蛋白質(zhì)和脂肪，是重要的植物蛋白質(zhì)和食用油脂的來源，因而具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近 年來，隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，植物發(fā)育生物學(xué)的研宄取得了長足的進(jìn)展。在 分子水平上逐步地揭示花發(fā)育的本質(zhì)成為研宄者的目標(biāo)，因此，與開花相關(guān)的新基因的挖 掘和功能探宄不僅有助于解析花發(fā)育過程或者反應(yīng)通路，同時(shí)對于作物改良也意義深遠(yuǎn)。
[0003] 近幾年，科學(xué)家們通過正向、反向遺傳學(xué)等研宄手段去挖掘調(diào)控花期的基因，而對 于典型的光周期敏感型作物一大豆，研宄者更多專注于光周期途徑基因的研宄。盡管大豆 開花不需要春化處理，但比較基因組學(xué)的研宄表明，在大豆基因組中仍保留了春化途徑的 基因，這些基因的功能卻鮮有研宄。本研宄在實(shí)驗(yàn)室前期研宄的基礎(chǔ)上，解析了大豆春化 途徑基因 GmVRNl的相關(guān)功能，豐富了大豆花期調(diào)控的理論，對今后的大豆遺傳改良奠定基 礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于利用比較基因組學(xué)探索大豆基因組中春化途徑的相關(guān)基因，運(yùn) 用real-time PCR技術(shù)對AtDREBlA轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行春化途徑基因差異表達(dá)的篩選，提供一 種大豆春化基因 GmVRNl的克隆方法。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述克隆方法獲得的大豆春化基因 GmVRNl。
[0006] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述大豆春化基因 GmVRNl的應(yīng)用；所述的應(yīng)用為大 豆春化基因 GmVRNl參與調(diào)控花期的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種大豆春化基因 GmVRNl的 克隆方法：應(yīng)用引物 F :5-CGCGGATC CATGAGAGACTTTTCATTTCAT-3 ;引物 R : 5-CGGGGTACCCTAATGTGGTGCAC-3 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 PCR，94°C 3min 預(yù)變性，94°C 變性 30s，59°C 退火 45s，72°C延伸lmin，34個(gè)循環(huán)后72°C再延伸IOmin ;在栽培大豆華春5號中克隆了 GmVRNl， 長度為1863bp，包含175bp的5'非翻譯區(qū)，383bp的3'非翻譯區(qū)和1305bp的開放式閱讀 框。
[0008] 一種大豆春化基因 GmVRNl由上述克隆方法獲得，其核苷酸基因序列如下所示：
[0009] ATGAGAGACTTTTCATTTCATTCCAATGATTTATTAATCTTGCAAGGAAACAACAGAGAGAGGTGGAAG ATGGATTATCATCAGGACAACCCTGCAGTTTTCTTCACTACCATCAAGAACACCAAGCAACTGAAAGTCCCAGAGGA GTTTCTGAAGCATTTGAATAAAGACTTGTGGAGTAATTCAGTTCTTATAGGCCCTTCTGGTGATAAGTGGCAAGTAA CTATTTTGAAGAAAGGAAATAACGTGTATATGGACAATGGTTGGTCACAATTTCTGAAAGACAATTCAGTGGTGCTT GATGAGTTCTTGCTTTTTACATATCATGGAGGAAACTGCTTCTATGTTCAAATTTTTGGTGGGAATGGATTGGAGAG GCTATGCCGCAAAGAAGCAAGAGAAGAACAAGCTGCTACCCCTCAATTTTTTGATCTGCCTTTCAGCAACAAAGCCT CAATTTCTGATGGATGTGAGATAAAGAAAACAAGACAAGAACAAGCTTCTGCCCCAAGTTTGGCGAGGACAAACAAG AGCAAGCAAAGAAAAACTTTTGTCGGTTCATCACACCTCCATGAATCGAACTCTTACAAAAAAGATCTGCCTTCCAG CAACAAAGGCACACTTTCTAAAGGATGTGAGATAAAGAAAACAAGACAAGAACAAGCTGCCACCCCAAGTTTTTTGA GGCCAAATAAGATTAAACAAAGAAAAACTTCTGCCAGATCATCAAACCTCAATGAATCCAAATCTTGTCAAGAAGGA CAAGAACGAGTTGCCACCCTAAGTTGGGCGAGGACAAATAATTATAACAGTACGCAAAGAAAAACTTCAGCCGGTTC ATCACACCTGCATGAATCGAATTCTTCCAAAGAAGATCTTCCTTTCAGCAACAAAGCCTCACTTTCTAAGGACTTCC CAAAGCCTCAGAGTTCAATTAATATTGAATGTTCAGAAGCATGTAAATTGGCCGAGTCTTTTACCTCTCGGAATCCT CATTGGAAGCACCTTTTGACAAAATGCAATTTGGAACGGTGCATCTTGCTTATTGCTGCTGAGTTTGCCAGAAAGTA CATTCCTGAAGCACTGGAACAGATCTATCTTTGGAATTCGGAAGGAAAATCTTGGGAAGTGCGAGTGCATTATTTTA GAAATCGAAATACATGGTATGCTGCGTTTAAGAGAGGATGGGAAAGATTCGTTCGTGATAACAAGCTCATGAAAGGT GACACTTGCATTTTTGAAGTTGAAGAAGAACAAGGCCATTGGAGTGTTCACATATTCAGAACCGGATGTGCACCACA TTAG0
[0010] 上述的大豆春化基因 GmVRNl在參與調(diào)控花期中的應(yīng)用。
[0011] 上述的大豆春化基因 GmVRNl在參與調(diào)控花期中的應(yīng)用，通過采用轉(zhuǎn)基因擬南芥 來實(shí)現(xiàn)大豆春化基因 GmVRNl參與花期調(diào)節(jié)的應(yīng)用；具體通過春化途徑調(diào)控?cái)M南芥的開花。
[0012] 所述的采用轉(zhuǎn)基因擬南芥為采用花藥侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥來實(shí)現(xiàn)。
[0013] 上述的大豆春化基因 GmVRNl的克隆方法，和通過采用轉(zhuǎn)基因擬南芥來實(shí)現(xiàn)大豆 春化基因 GmVRNl參與花期調(diào)節(jié)，具體包括以下步驟：
[0014] (1)大豆GmVRNl基因的克隆：華春5號大豆種子植株培養(yǎng)，TRIzol提取法進(jìn)行RNA 的提取，通過設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及目的基因的克隆，連接pZeroBack/Blunt vector載 體進(jìn)行測序；
[0015] (2)擬南芥為載體來實(shí)現(xiàn)大豆春化基因 GmVRNl參與花期調(diào)節(jié)試驗(yàn)：首先進(jìn)行擬南 芥的遺傳轉(zhuǎn)化，GmVRNl基因轉(zhuǎn)化擬南芥陽性植株的篩選，擬南芥春化途徑和自主途徑的基 因以及下游的關(guān)鍵基因進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證。為了進(jìn)一步了解GmVRNl的功能，我們構(gòu)建了過 量表達(dá)載體對擬南芥進(jìn)行異源轉(zhuǎn)化。得到的TO代種子經(jīng)含有20mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，10天后把具有抗性的苗移入營養(yǎng)土中。得到Tl代后，取以上13株Tl代植株葉片 提取基因組總DNA，用質(zhì)粒DNA作陽性對照，野生型植株DNA和水作陰性對照，擴(kuò)增潮霉素基 因。同時(shí)，為了解析GmVRNl引起轉(zhuǎn)基因擬南芥植株早花的分子機(jī)制，我們選擇了擬南芥春 化途徑和自主途徑的基因以及下游的關(guān)鍵基因進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證。
[0016] 檢測結(jié)果顯示，一個(gè)誘導(dǎo)開花的基因 Glymallgl3220. 1的序列信息從Phytozome V. 9. 1數(shù)據(jù)庫獲得，并命名為GmVRNl。我們以栽培大豆華春5號為材料，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄 成cDNA，設(shè)計(jì)引物克隆出了 GmVRNl的⑶S序列。它的長度為1863bp的基因，包含了 175bp 的5'非翻譯區(qū)，383bp的3'非翻譯區(qū)和1305bp的開放式閱讀框。測序后進(jìn)行比對，GmVRNl 的序列和William 82參考序列一致。除此之外，GmVRNl編碼434個(gè)氨基酸，含有2個(gè)B3DNA 結(jié)構(gòu)域，分別位于40-120和334-429的位置。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，GmVRNl在大豆中存在 序列一致性很高的同源基因，但這些基因的功能都未被研宄過。除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)該基 因的同源基因主要存在于雙子葉植物中，尤其是豆科植物，但是在低等植物、微生物、動(dòng)物 中都未發(fā)現(xiàn)，這說明該類基因是高等植物特有的。盡管GmVRNl和擬南芥VRNl同源性不是 很高，但是它們都含有2個(gè)保守的B3 DNA結(jié)合域，這暗示了兩者在功能方面可能存在相似 性。
[0017] 檢測結(jié)果顯示，我們構(gòu)建了過量表達(dá)載體對擬南芥進(jìn)行異源轉(zhuǎn)化。得到的TO代種 子經(jīng)含有20mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10天后把具有抗性的苗移入營養(yǎng)土中。得到 Tl代后，取以上13株Tl代植株葉片提取基因組總DNA，用質(zhì)粒DNA作陽性對照，野生型植 株DNA和水作陰性對照，擴(kuò)增潮霉素基因。結(jié)果表明，10株擬南芥植株能擴(kuò)增出與陽性對照 相同大小的DNA條帶，初步證明了目的基因 GmVRNl已整合在擬南芥的基因組中。同時(shí)進(jìn)行 了野生型擬南芥植株相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株春化途徑基因 VIN3、開花促進(jìn)因子FT、花芽 分化基因 APl顯著上調(diào)，而開花抑制因子FLC、FD的表達(dá)量顯著下調(diào)。因此，我們推測轉(zhuǎn)基 因植株早花是由于花期抑制因子FLC受到抑制，揭示GmVRNl可能通過春化途徑調(diào)控了擬南 芥的開花。
[0018] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0019] 1、本發(fā)明通過Phytozome V. 9. 1數(shù)據(jù)庫獲得一個(gè)誘導(dǎo)開花的基因 Glymallgl3220. 1的序列信息，并命名為GmVRNl，并在栽培大豆華春5號中克隆了 GmVRNl， 長度為1863bp，包含175bp的5'非翻譯區(qū)，383bp的3'非翻譯區(qū)和1305bp的開放式閱讀 框。
[0020] 2、本發(fā)明克隆了大豆春化基因 GmVRNl，并對其調(diào)控花期的功能進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明 包括大豆春化基因 GmVRNl的克隆及PCR引物設(shè)計(jì)與反應(yīng)條件，同時(shí)還包括了對利用轉(zhuǎn)基因 技術(shù)來闡述大豆春化基因 GmVRNl參與調(diào)控花期的應(yīng)用。
[0021] 3、本發(fā)明首次將GmVRNl在擬南芥中過量表達(dá)，并證實(shí)了該基因是一個(gè)功能蛋白 質(zhì)，并通過春化途徑調(diào)控開花。
【附圖說明】
[0022] 圖1為瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增出來的GmVRNl基因的CDS序列檢測結(jié)果圖； M, DL2000 DNA maker ; 1-2, GmVRNl