一種重組禽干擾素α成品凍干制劑的制備工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及基因工程干擾素蛋白的凍干制劑生產(chǎn)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著近年來全球畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，我國養(yǎng)殖業(yè)無論是禽類的品種還是數(shù)量都位于世界前列。然而，養(yǎng)禽業(yè)還存在很多問題，如禽流感、鴨肝炎等病毒傳染性疾病，每年都會在不同的季節(jié)暴發(fā)，這些動物一旦感染發(fā)病，具有發(fā)病急、臨床癥狀嚴(yán)重、極易傳播擴散以及病死率和死亡率均較高的特點，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失；更為重要的是，禽類與人類密切接觸，某些病毒性傳染病如禽流感等還給人類健康帶來潛在威脅。目前禽類傳染性疾病的防治主要采用疫苗免疫和藥物治療，由于疫苗免疫的血清型單一，而病毒的血清型復(fù)雜，毒株變異快，常導(dǎo)致疫苗免疫失敗。一些病毒病目前尚無疫苗可用，有些病毒也可能直接危害到人類的健康。
[0003]目前針對禽傳染病常用的藥物治療主要采用人用抗生素和抗病毒化學(xué)藥物進(jìn)行治療，但是引起的食品藥物殘留問題，給人類健康帶來威脅。現(xiàn)在一些國家己明令禁止一些抗生素和抗病毒藥物在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。因此，使用無任何毒副作用的干擾素來治療和預(yù)防禽類病毒性疾病將是當(dāng)前較為關(guān)注的問題。
[0004]干擾素是一類由病毒及脂多糖等物質(zhì)誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，1957年由Issacs和Lindeman首先發(fā)現(xiàn)，它是一類多功能的細(xì)胞因子，與細(xì)胞受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生多種特異性蛋白質(zhì)和酶類，主要通過抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄和降解病毒RNA來抑制病毒的生長繁殖及發(fā)揮抗腫瘤等的活性。按照干擾素的產(chǎn)生細(xì)胞、生化特征及在機體免疫方面所發(fā)揮的作用不同，分為α、β、γ三種型?，F(xiàn)已知，干擾素α在體內(nèi)可有選擇性地作用于病毒感染細(xì)胞，通過抑制受染細(xì)胞內(nèi)的病毒蛋白質(zhì)的生物合成，發(fā)揮廣譜和高效抗病毒作用，但對正常宿主細(xì)胞無作用。
[0005]目前重組雞干擾素α在大腸埃希菌中的表達(dá)已有報道，但是其工藝均為以發(fā)酵菌體中的包涵體表達(dá)目的蛋白，導(dǎo)致生產(chǎn)過程中需要對包涵體表達(dá)的蛋白進(jìn)行變性和復(fù)性，從而導(dǎo)致生產(chǎn)工藝復(fù)雜化而且成本較高，制約了其在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0006]凍干保護(hù)劑的研究和應(yīng)用是當(dāng)前國內(nèi)獸用生物制品行業(yè)中的熱點問題，過去凍干保護(hù)劑要為蔗糖脫脂牛奶和明膠、蔗糖，制品要求_15°C低溫保存，如2?8°C保存僅存6個月，給獸用生物制品貯存和運輸帶來較大的困難。需要一種新型保護(hù)劑能夠讓生物制品在2?8°C穩(wěn)定保存24個月以上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種重組禽干擾素α成品凍干制劑的制備工藝，以重組禽干擾素α的BL21/pET-32a-rChIFNa工程菌的凍干菌種(安徽九川生物科技有限公司生產(chǎn)，農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因安全證書:農(nóng)基安證字2014第034號)為原料，其DNA序列如SEQUENCE LISTING 400〈I〉所示，經(jīng)過以下步驟制得:(I)原液制備；(2)半成品制備；(3)成品制備。
[0008]步驟(I)中具體包括以下步驟:(1-1) 一級生產(chǎn)種子繁殖；(1-2) 二級生產(chǎn)種子繁殖；(1-3)發(fā)酵；(1-4)破碎；(1-5)純化；(1-6)原液檢測。
[0009]步驟(1-1)具體包括以下步驟:開啟表達(dá)重組禽干擾素α的BL21/ρΕΤ-32 a -rChIFNa工程菌的凍干菌種I支，加I?2mL無菌生理鹽水溶解成菌懸液，接種于LB固體培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)24?36小時，挑取單個菌落，接種于LB固體培養(yǎng)基斜面，37°C培養(yǎng)24?36小時，用5?1mL LB液體培養(yǎng)基洗下菌苔得菌液，加入30%?40%菌液體積的無菌甘油，可避免凍存菌種時水結(jié)冰產(chǎn)生冰晶損傷細(xì)胞，定量分裝成ImL/瓶，得到一級BL21/pET-32 a -rChIFN α工程菌生產(chǎn)種子。
[0010]步驟(1-2)具體包括以下步驟:將一級BL21/pET_32 a -rChIFNa工程菌生產(chǎn)種子接種于LB固體培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)24?36小時，用LB液體培養(yǎng)基洗下菌苔得菌液，將菌液接種于LB液體培養(yǎng)基，菌液與LB液體培養(yǎng)基的體積比為1:10?15，37°C搖床震蕩培養(yǎng)至OD值為0.8?1.2，制得二級種子菌液。
[0011]步驟(1-3)具體包括以下步驟:將LB液體培養(yǎng)基經(jīng)103.43Kpa壓力在位滅菌，按培養(yǎng)基體積量的10%?20%接種二級種子菌液，37°C發(fā)酵，加入酸或堿控制PH值為7.0?
7.2，控制溶氧>30%，待菌液的0D_nni值達(dá)到0.6?1.0時加入終濃度為lmmol/L的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，30?32°C誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)4?6小時，2?8°C溫度下離心，濕菌體稱重，-20°C凍存。
[0012]步驟(1-4)具體包括以下步驟:用10?15%菌液體積的lOmmol/L磷酸緩沖液(PBS)重懸濕菌體，以800?1500bar壓力的高壓細(xì)胞破碎機破碎，離心，所得上清液重復(fù)離心一次，再次收集上清液，得粗制重組禽干擾素α。
[0013]步驟(1-5)所述純化為親和層析純化和離子交換層析純化，這兩種不同原理的純化方案聯(lián)用制備出來蛋白純度更高，純化后得重組禽干擾素α原液。
[0014]步驟⑵具體包含以下步驟:將重組禽干擾素α原液用2?3倍體積10mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋，向凍干保護(hù)劑混勻，分裝成規(guī)格為2.2mL/瓶的重組禽干擾素α半成品，此處用PBS作為稀釋劑具有鹽平衡、可調(diào)整的適宜PH緩沖作用，能夠保護(hù)生物蛋白的結(jié)構(gòu)及生物活性物質(zhì)保持其最完整的特性。
[0015]進(jìn)一步地，所述凍干保護(hù)劑為終濃度為80?150mL/L脫脂牛奶、0.12?0.25g/mL甘露醇和0.025?0.085g/mL蔗糖，脫脂牛奶在凍干的過程中可以促進(jìn)升華，易取得均質(zhì)產(chǎn)品，并擴大細(xì)胞相互間的距離。
[0016]步驟(3)具體包含以下步驟:將重組禽干擾素α半成品在-40?_30°C的條件下經(jīng)冷凍真空干燥工藝，制得重組禽干擾素α成品凍干制劑。
[0017]上述冷凍真空干燥工藝為:將擱架溫度降溫到-10?-15°c，保持30min?60min，繼續(xù)降溫至_20°C保持30min?60min，之后在_35°C保持1.5h，抽真空進(jìn)行一次干燥，保持2?3.5h得到白色干燥物，開啟隔板加熱至30?35°C，維持4h。
[0018]按上述方法制備出的重組禽干擾素α原液目的蛋白的表達(dá)量不低于30%，效價大于1.0 X 19單位/mL，純化后同時采用SDS-PAGE和HPLC對蛋白質(zhì)純度進(jìn)行檢測，蛋白純度均高于95%以上，Lowry法檢測蛋白含量大于lmg/mL，比活性達(dá)到1.2 X 19單位/mg，分子量為35kD。
[0019]本發(fā)明制備的重組禽干擾素α為凍干型，呈白色或淡黃色疏松體，加入注射用水后迅速復(fù)溶為澄明液體，干擾素含量彡I X 19單位/瓶，2?8°C可長期保存，在低于25°C室溫下可保存兩年。
[0020]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，所建立的重組禽干擾素α，是在大腸埃希工程菌菌體破碎后的上清液中表達(dá)的目的蛋白，免去了由包涵體形式表達(dá)蛋白所需要的變性和復(fù)性過程，同時對每一步的制備及生產(chǎn)過程建立了詳細(xì)的技術(shù)參數(shù)以及相應(yīng)的質(zhì)量控制體系，為重組禽干擾素α產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
[0021]本發(fā)明所制的重組禽干擾素α成品凍干制劑是一類能誘導(dǎo)禽類細(xì)胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的細(xì)胞因子，可采用肌肉注射的方式給藥，治療周期短，療效迅速，能夠用于雞新城疫病毒和禽流感病毒性疾病的防治。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點是:使用本發(fā)明提供的制備方法得到的重組禽干擾素α凍干制劑產(chǎn)品，無論是在純度、蛋白含量、效價和內(nèi)毒素等方面均可達(dá)到獸用生物制品的要求，且生產(chǎn)工藝適合規(guī)?；a(chǎn)。
【附圖說明】
[0023]圖1為發(fā)酵破碎菌體離心后表達(dá)的重組禽干擾素α蛋白SDS-PAGE圖；M:蛋白Marker ;1:發(fā)酵破碎后上清；2:發(fā)酵破碎后包涵體；3:發(fā)酵破碎后全菌；
[0024]圖2為重組禽干擾素α原液純化層析色譜圖；Α為重組禽干擾素α親和層析純化色譜圖出為重組禽干擾素α離子交換層析純化色譜圖；
[0025]圖3為重組禽干擾素α原液純化前后SDS-PAGE圖；M:蛋白Marker ；4:重組禽干擾素α原液；5:重組禽干擾素α原液親和層析純化后樣品；6:重組禽干擾素α原液離子交換層析洗脫樣(雜蛋白);7:重組禽干擾素α原液離子交換層析純化后目的蛋白樣；
[0026]圖4為重組禽干擾素α原液HPLC檢測純度色譜圖；
[0027]圖5為重組禽干擾素α成品凍干制劑免疫印跡檢測結(jié)果圖；Μ:蛋白Marker ；8:重組禽干擾素α成品凍干制劑。
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合實施案例對本發(fā)明作詳細(xì)的說明，但這并不僅限于本發(fā)明的范圍。
[0029]重組禽干擾素α的BL21/pET_32 a -rChIFN α工程菌的凍干菌種(農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因安全證書:農(nóng)基安證字2014第034號)來源于安徽九川生物科技有限公司自制。
[0030]LB液體培養(yǎng)基的配制方法為:胰化蛋白胨100g、酵母提取物50g、氯化鈉100g，用8L純水溶解后，加5M NaOH調(diào)節(jié)PH值至7.0，再加入純水至總體積10L。
[0031]實施例1
[0032]一種重組禽干擾素α成品凍干制劑的制備工藝，包括以下步驟:
[0033]1.1原液制造與檢測
[0034]1.1.1 一級生產(chǎn)種子繁殖
[0035]開啟表達(dá)重組禽干擾素α的BL21/ρΕΤ-32 a -rChIFN α工程菌的凍干菌種I支，加ImL無菌生理鹽水溶解成菌懸液，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)24小時，挑取單個菌落，接種于LB固體培養(yǎng)基斜面，37°C培養(yǎng)24小時，用5mL LB液體培養(yǎng)基洗下菌苔得菌液，加入30%菌液體積的無菌甘油，定量分裝成ImL/瓶，制得一級BL21/ρΕΤ-32 a -rChIFNa工程菌生產(chǎn)種