通用疫苗凍干保護劑及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種通用疫苗凍干保護劑，所述保護劑為單一成分的蔗糖，且作為疫苗的凍干骨架。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：獲得了在鹽水條件下以蔗糖為唯一凍干支架的通用疫苗凍干保護劑配方，該保護劑外型穩(wěn)定、易溶性良好、成本低廉、制備容易、保存方便；采用本發(fā)明提供的保護劑獲得凍干后疫苗在效價、水分、外觀等均達到藥典要求；所述保護劑獲得凍干后疫苗的穩(wěn)定性、復(fù)溶性均明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)同類產(chǎn)品，且該保護劑成分可控，完全排除過敏源性。此外，該保護劑可在三種不同凍干機型上運用，通用于各種需凍干疫苗；因此其應(yīng)用前景十分廣闊。
【專利說明】
通用疫苗凍干保護劑及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及疫苗保護劑，具體說，是涉及一種凍干疫苗骨架，尤其是通用疫苗凍干 保護劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 疫苗是將病原微生物（如細菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減 毒、滅活或利用轉(zhuǎn)基因等方法制成的用于預(yù)防或治療傳染病的自動免疫制劑，是生物制劑 中的最為常見的一類。疫苗的常見劑型主要為口服和注射劑，由于疫苗的分子活性要求，目 前的疫苗劑型研究主要集中在注射劑中，常見的疫苗注射劑型為小水針劑或凍干粉針劑兩 種，而凍干制劑因其高穩(wěn)定性已成為生物制品的基本劑型。
[0003] 凍干及冷凍干燥技術(shù)，是在一定的真空條件下，將制品溶液預(yù)先凍結(jié)成固體，然后 在低溫低壓條件下，從凍結(jié)狀態(tài)不經(jīng)過液態(tài)而直接升華除去水分的一種干燥方法，此過程 即稱為冷凍干燥，是冷凍和干燥的結(jié)合。該方法是目前保持微生物、動物組織、細胞及蛋白 質(zhì)等活性物質(zhì)生物活性的一個有效的、普遍的方法。
[0004] 在真空冷凍干燥過程中，冷凍和干燥不可避免地均會造成部分微生物細胞的損傷 及死亡，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。為提高和保證凍干活疫苗的存活率與生物活性，人們進行了大量 的研究，其中包括凍干過程中蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)變化、各種保護劑對蛋白質(zhì)的影響。
[0005] 蛋白質(zhì)的折疊與展開狀態(tài)的平衡受周圍物理環(huán)境(例如pH值、溫度、溶劑成分、水 合水平等）的影響很大。從二十世紀六、七十年代開始，國外一些學(xué)者對凍干蛋白質(zhì)的變性 機理進行研究并認為變性主要發(fā)生在冷凍過程。從二十世紀八、九十年代至今，普遍認為在 冷凍干燥過程中，冷凍和干燥都會引起蛋白質(zhì)變性。其中，冷凍變性機理是冷凍過程中結(jié)晶 引起水的狀態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，是蛋白質(zhì)變性的主要原因，并且蛋白質(zhì)變性的程度依賴于冷 凍的程度，冷凍溫度越低，蛋白質(zhì)變性越劇烈。在低溫下有序的水的結(jié)構(gòu)引起蛋白質(zhì)分子中 疏水鍵的破壞是導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的主要原因。蛋白質(zhì)分子周圍分布著多層水分子，在降溫 過程中，蛋白質(zhì)分子周圍的水分子不斷凍結(jié)，但只要蛋白質(zhì)分子表面的單層水分子沒有凍 結(jié)，蛋白質(zhì)就不會變性，反之亦然。干燥變性機理是干燥過程的變性，主要是發(fā)生在二次干 燥階段即移去結(jié)合水的階段。蛋白質(zhì)在水溶液中是水化的，表面有一層水分子包圍，構(gòu)成一 個單層分子，這就是水化層。這層水分子通過氫鍵和蛋白質(zhì)相互作用連接。干燥過程要移去 一部分水化層的水，破壞蛋白質(zhì)表面的氫鍵結(jié)構(gòu)，引起天然結(jié)構(gòu)的變性。
[0006] 針對上述問題，保護劑成為了凍干活疫苗中不可或缺的組成部分。保護劑的作用 主要有：1、具有保護病毒及細菌活力、抗原穩(wěn)定性、耐干燥和冷凍的低分子物質(zhì)和形成凍干 疫苗耐熱性結(jié)構(gòu)的有機高分子物質(zhì)；2、具有高度抗氧化作用的抗氧化劑，能夠最大限度地 消耗溶液中溶解的氧，減少病毒或細菌與氧的接觸，降低病毒或細菌的代謝活力和能量損 耗，防止其在冷凍干燥及儲運過程中死亡;3、根據(jù)保護劑中的每一種物質(zhì)的共融點進行大 量反復(fù)凍干試驗，科學(xué)地確定每一種疫苗的凍干曲線，使病毒或細菌在凍干過程中的失活 率降到最低，也使得疫苗形成良好的物理性狀。
[0007] 凍干活疫苗的整個凍干過程存在著各種各樣的應(yīng)力，通常包括低溫應(yīng)力、凍結(jié)應(yīng) 力(包括枝狀冰晶的形成、離子強度的增加、pH值的改變、相分離等）、干燥應(yīng)力(移去蛋白質(zhì) 表面單層水分子)等，這些應(yīng)力常常是直接或間接導(dǎo)致生物制品不穩(wěn)定的因素。保護劑可以 改變疫苗冷凍干燥時的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥或復(fù)水對細胞的損害，盡可能 保持生物樣品原有的各種理化特性和生物活性，同時對產(chǎn)品貯藏期內(nèi)蛋白質(zhì)變性起到抑制 作用。
[0008] 常用在凍干活疫苗中的保護劑種類有：多羥基化合物、糖、蛋白質(zhì)、聚合物、氨基 酸、鹽、表面活性劑等。
[0009] 1、多羥基化合物
[0010]多羥基化合物是保護劑中重要成分之一，常見的有甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二 醇、側(cè)金盞花醇等。多羥基化合物的保護機理：由于疫苗蛋白質(zhì)分子中存在大量的氫鍵，結(jié) 合水通過氫鍵與蛋白質(zhì)分子連接，當(dāng)凍干過程中脫水后，多羥基化合物的羥基能替代蛋白 質(zhì)表面的水分子的羥基，與蛋白質(zhì)表面形成一層假定的水化膜，從而保護氫鍵的連接位點 不直接暴露在周圍環(huán)境中，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的尚級結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)因凍干而變性。
[0011] 2、糖
[0012] 糖是凍干活疫苗中最常見的保護劑，使用最廣的一類必要成分，為蛋白質(zhì)的非特 異性穩(wěn)定劑。在凍干及保存各階段均能對生物制品起到一定的保護作用。糖的保護作用與 其及蛋白質(zhì)的種類有關(guān)。常見的有庶糖、乳糖、海澡糖、姻糖、糊精等。對阻止蛋白質(zhì)^級結(jié) 構(gòu)的改變、凍干處理過程中及貯藏期內(nèi)蛋白質(zhì)多肽鏈的伸展和聚集起著顯著作用。二糖中 的蔗糖和海藻糖是研究最多、也是公認最有效的保護劑。
[0013] 3、蛋白質(zhì)
[0014] 蛋白質(zhì)保護劑是保護劑的重要組分。蛋白質(zhì)類保護劑根據(jù)來源可分為兩種:動物 源性蛋白質(zhì)和外來蛋白質(zhì)。血清白蛋白是一個經(jīng)典-優(yōu)良的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，人血清白蛋白則 在更低濃度(〈0.05%~0.1%)時能有效阻止蛋白質(zhì)表面的吸附，對凍干過程中多數(shù)蛋白都 具有保護作用。目前，也有報道稱重組人白蛋白推薦為血清白蛋白的替代品。
[0015] 4、聚合物
[0016] 聚合物作為大分子物質(zhì)保護劑，要與小分子物質(zhì)聯(lián)合使用，常見的有聚乙二醇 (PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明膠、聚乙烯亞胺、海藻酸、果膠、阿拉伯膠、葡聚糖、聚乙烯 吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纖維素(CMC)及藻類。通常聚合物的穩(wěn)定作用取決于聚合物的多重 性質(zhì)，如優(yōu)先從蛋白質(zhì)表面析出、表面活性、使蛋白質(zhì)溶液濃度升高從而阻止其他小分子 (如糖及多羥基化合物）的結(jié)晶、抑制冷凍過程中pH值的劇烈變化等。盡管大分子物質(zhì)對疫 苗穩(wěn)定性及有限期有很好的效果，但會減低品種本身的安全性系數(shù)。
[0017] 5、氨基酸
[0018] 氨基酸是蛋白質(zhì)保護劑常見的一種，常用的氨基酸類保護劑有精氨酸、脯氨酸、色 氨酸、谷氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸鹽酸鹽、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸等。在 冷凍過程中的主要作用是能升高成品的塌陷溫度，阻止因塌陷而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。
[0019] 表a為現(xiàn)有技術(shù)中的常用保護劑對比。
[0020] 表 a
[0022] 由表a不難看出，要想獲得穩(wěn)定的活疫苗凍干制品，保護劑的選用至關(guān)重要。表a中 提到，明膠、海藻酸鹽用作凍干疫苗成型骨架時，由于明膠為動物源性物質(zhì)，海藻酸鹽中含 不明、不可控成分，為主要的過敏源，患者將具有潛在的過敏反應(yīng)。一個優(yōu)良的保護劑要對 保持疫苗的玻璃化有利，因為玻璃化的疫苗不僅復(fù)溶速率高，物理性狀好，而且質(zhì)量穩(wěn)定性 尚。
[0023] 綜上，為避免現(xiàn)有凍干劑型疫苗中含明膠、海藻酸鹽、等動物源性、食源性高分子 組分保護劑在注射時引起的過敏反應(yīng)，研制一種無動物源性、食源性等高分子組分，低敏的 通用疫苗保護劑，仍是一個亟待解決的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種通用疫苗用保護劑，以 獲得不含有動物源性、食源性等高分子組分的通用疫苗保護劑，且外型穩(wěn)定、易溶性良好， 從而具備極佳的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益。
[0025] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0026] -種通用疫苗凍干保護劑，為單一成分的蔗糖，且作為疫苗的凍干骨架，換言之， 該保護劑中不含有明膠和/或海藻酸鹽。
[0027]優(yōu)選地，蔗糖的初始濃度不小于60%，優(yōu)選為大于70%。
[0028]優(yōu)選地，蔗糖在凍干原液中的初始質(zhì)量百分含量為不大于20 % ;較佳地，為4~ 20% ;作為一種較佳的實施方式，根據(jù)所需制備的疫苗的不同為7~10%、8~10%、10~ 15%或 12~15%;最佳為7%、8%、10%或 12%。
[0029] 優(yōu)選地，蔗糖選用工業(yè)級分析純或藥用級。
[0030] 作為本發(fā)明的另一目的，是提供上述保護劑的制備方法，以獲得性能穩(wěn)定的保護 劑，配置濃度不小于60 %的蔗糖母液，經(jīng)高溫滅菌處理。
[0031] 優(yōu)選地，經(jīng)12rc滅菌處理15min。
[0032] 作為本發(fā)明的另一目的，是提供一種凍干疫苗的制備方法，以克服傳統(tǒng)凍干工藝 中無法采用單一成分的保護劑，即為唯一凍干骨架的料液進行疫苗凍干特需的成型凍干。 一種凍干疫苗的制備方法，在凍干過程中僅采用蔗糖作為凍干保護劑。
[0033] 優(yōu)選地，上述凍干疫苗的制備方法包括如下步驟：
[0034] 步驟a)配制病毒原液半成品；
[0035] 步驟b)將步驟a所得半成品進行預(yù)凍；
[0036]步驟c)將步驟b所得預(yù)凍后半成品進行干燥，即得凍干疫苗。
[0037]更優(yōu)選地，步驟a的具體操作為:無菌環(huán)境下，配制高溫滅菌處理的蔗糖母液，將蔗 糖母液加入病毒原液中，混勻制備成含有蔗糖保護劑的病毒原液半成品。
[0038] 更優(yōu)選地，步驟b中預(yù)凍時快速降溫至-55°C~_50°C，維持4h~8h或15h~20h。
[0039] 更優(yōu)選地，步驟c包括第一階段干燥和第二階段干燥。
[0040] 進一步，步驟c中第一階段干燥時升溫至-45°C~_33°C維持40h~96h和/或升溫 至-40 °C ~-30 °C 維持 12h ~22h。
[0041]相應(yīng)地，作為一種較佳實施方式，根據(jù)所需制備的疫苗的不同，步驟c中第一階段 干燥時升溫至-45°C~-40°C，維持50h，再升溫至-40°C~-33°C，維持22h;或升溫至-42°C ~-33°C，維持96h;或升溫至-42°C~_38°C，維持42h，再升溫至-35°C~_33°C，維持16h;或 升溫至-40 °C~-38 °C，維持44h，再升溫至-35 °C~-30 °C，維持14h;亦或升溫至-40 °C~-38 。(：，維持40h，再升溫至-35°C~_30°C，維持12h。
[0042] 更優(yōu)選地，步驟c中第二階段干燥時設(shè)定不同時間內(nèi)升溫至0°C~30°C，不同升溫 階段繼續(xù)維持18h~32h(根據(jù)水的三相性:壓強，沸點或熔點，溫度是一個相互作用的過程， 不同的升溫速率下，熱輻射速率不同，最后所得到的劑品外觀及水分含量也不相同；同時結(jié) 合蔗糖跟不同病毒會產(chǎn)生不同的玻璃化轉(zhuǎn)化溫度;通過調(diào)節(jié)審問速率來實現(xiàn)最優(yōu)值；因此 此處可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的方法進行調(diào)節(jié)，下同）。
[0043] 值得一提的是，本發(fā)明的進一步優(yōu)勢還體現(xiàn)在，本發(fā)明的另一目的是提供一種輪 狀病毒凍干疫苗，其中：所述輪狀病毒凍干疫苗在凍干過程中米用單一成分的鹿糖作為凍 干骨架。
[0044] -種輪狀病毒凍干疫苗的制備方法，其特征在于:通過以蔗糖為單一骨架的凍干 配方結(jié)合不同凍干曲線完成凍干的過程中，蔗糖在凍干原液中的初始質(zhì)量百分含量為7% ~10%，優(yōu)選為7%。
[0045] 需要注意的是，制備輪狀病毒凍干疫苗過程中，預(yù)凍時快速降溫至_55°C，維持15h ~20h;第一階段干燥時升溫至-45 °C~-40°C，維持50h，再升溫至-40°C~-33°C，維持22h; 第二階段干燥時設(shè)定不同時間內(nèi)升溫至〇°C~30°C，不同升溫階段繼續(xù)維持28h。
[0046] 本發(fā)明的另一目的是提供一種麻疹病毒凍干疫苗，其中：所述麻疹病毒凍干疫苗 在凍干過程中采用單一成分的蔗糖作為凍干骨架。
[0047] -種麻疹病毒凍干疫苗的制備方法，其特征在于:通過以蔗糖為單一骨架的凍干 配方結(jié)合不同凍干曲線完成凍干的過程中，蔗糖在凍干原液中的初始質(zhì)量百分含量為12% ~15%，優(yōu)選為12%。
[0048] 需要注意的是，制備麻疹病毒凍干疫苗過程中，預(yù)凍時快速降溫至-50°C，維持 4.5h~8h;第一階段干燥時升溫至-42°C~-33°C，維持96h;第二階段干燥時設(shè)定不同時間 內(nèi)升溫至〇°C~30°C，不同升溫階段繼續(xù)維持32h。
[0049] 本發(fā)明的另一目的是提供一種風(fēng)疹病毒凍干疫苗，其中：所述風(fēng)疹病毒凍干疫苗 在凍干過程中采用單一成分的蔗糖作為凍干骨架。
[0050] -種風(fēng)疹病毒凍干疫苗的制備方法，其特征在于:通過以蔗糖為單一骨架的凍干 配方結(jié)合不同凍干曲線完成凍干的過程中，蔗糖在凍干原液中的初始質(zhì)量百分含量為8% ~10%，優(yōu)選為8%。
[0051] 需要注意的是，制備風(fēng)疹病毒凍干疫苗過程中，預(yù)凍時快速降溫至-50°C，維持4h ~5h;第一階段干燥時升溫至-42°C~-38°C，維持42h，再升溫至-35°C~-33°C，維持16h;第 二階段干燥時設(shè)定不同時間內(nèi)升溫至〇°C~30°C，不同升溫階段繼續(xù)維持18h。
[0052] 本發(fā)明的另一目的是提供一種麻疹風(fēng)疹病毒凍干二聯(lián)疫苗，其中：所述麻疹風(fēng)疹 病毒凍干二聯(lián)疫苗在凍干過程中采用單一成分的蔗糖作為凍干骨架。
[0053] 一種麻疹風(fēng)疹病毒凍干二聯(lián)疫苗的制備方法，其特征在于:通過以蔗糖為單一骨 架的凍干配方結(jié)合不同凍干曲線完成凍干的過程中，蔗糖在凍干原液中的初始質(zhì)量百分含 量為10%~15%，優(yōu)選為10%。
[0054]需要注意的是，制備麻疹風(fēng)疹病毒凍干二聯(lián)疫苗過程中，預(yù)凍時快速降溫至-55 。(：，維持4.5h~8h;第一階段干燥時升溫至-40 °C~-38°C，維持44h，再升溫至-35 °C~-30 °C，維持14h;第二階段干燥時設(shè)定不同時間內(nèi)升溫至0°C~30°C，不同升溫階段繼續(xù)維持 Mlo
[0055] 本發(fā)明的另一目的是提供一種水痘病毒凍干疫苗，其中：所述水痘病毒凍干疫苗 在凍干過程中采用單一成分的蔗糖作為凍干骨架。
[0056] -種水痘病毒凍干疫苗的制備方法，其特征在于:通過以蔗糖為單一骨架的凍干 配方結(jié)合不同凍干曲線完成凍干的過程中，蔗糖在凍干原液中的初始質(zhì)量百分含量為10% ~15%，優(yōu)選為12%。
[0057]需要注意的是，制備水痘病毒凍干疫苗過程中，預(yù)凍時快速降溫至-50°C，維持 4.5h~8h;第一階段干燥時升溫至-40 °C~-38 °C，維持40h，再升溫至-35 °C~-30 °C，維持 12h;第二階段干燥時設(shè)定不同時間內(nèi)升溫至0°C~30°C，不同升溫階段繼續(xù)維持24h。
[0058] 此外，本發(fā)明還提供了上述保護劑用于制備凍干疫苗的用途。
[0059] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：
[0060] 1、本發(fā)明提供了一種外型穩(wěn)定、易溶性良好、成本低廉、制備容易、保存方便的通 用疫苗保護劑，獲得在鹽水條件下以蔗糖為唯一凍干支架的通用疫苗凍干保護劑配方； [0061 ] 2、本發(fā)明提供的技術(shù)方案避免凍干劑型疫苗中含動物源性明膠高分子、食源性海 藻酸鹽組分保護劑免疫接種引發(fā)過敏反應(yīng)；
[0062] 3、以蔗糖為疫苗凍干制劑唯一保護劑和成型劑骨架，可利用工業(yè)級分析純或藥用 級蔗糖殘留雜質(zhì)，成分可控，完全排除過敏源性；
[0063] 4、該疫苗凍干保護劑通用于各種可作為凍干劑的疫苗；
[0064] 5、該通用疫苗保護劑的凍干工藝適用于各種需凍干疫苗，成功建立了無高分子成 分通用疫苗保護液冷凍干燥工藝，且可在三種不同凍干機型上運用；
[0065] 6、采用本發(fā)明提供的保護劑獲得凍干后疫苗在效價、水分、外觀等均達到藥典要 求；
[0066] 7、采用本發(fā)明提供的保護劑獲得凍干后疫苗的穩(wěn)定性、復(fù)溶性均明顯優(yōu)于現(xiàn)有技 術(shù)同類產(chǎn)品。
[0067] 綜上，本發(fā)明提供的通用疫苗保護劑安全可靠，穩(wěn)定性好，且來源廉價易得，生產(chǎn) 工藝環(huán)境友好，其應(yīng)用前景十分廣闊。
【附圖說明】
[0068] 圖la為本發(fā)明實施例1提供的四價輪狀病毒半成品凍干曲線；
[0069] 圖lb為本發(fā)明實施例1-4和對比例1提供的四價輪狀病毒半成品凍干曲線；
[0070] 圖2a為本發(fā)明實施例2提供的麻疹病毒半成品凍干曲線；
[0071] 圖2b為本發(fā)明實施例2-6和對比例2提供的麻疹病毒半成品凍干曲線；
[0072 ]圖3a為本發(fā)明實施例3提供的風(fēng)疹病毒半成品凍干曲線；
[0073]圖3b為本發(fā)明實施例3-4和對比例3提供的風(fēng)疹病毒半成品凍干曲線；
[0074] 圖4a為本發(fā)明實施例4提供的麻疹風(fēng)疹病毒二聯(lián)疫苗半成品凍干曲線；
[0075] 圖4b為本發(fā)明實施例4-5和對比例4提供的麻疹風(fēng)疹病毒二聯(lián)疫苗半成品凍干曲 線；
[0076] 圖5a為本發(fā)明實施例5提供的水痘病毒半成品凍干曲線；
[0077]圖5b為本發(fā)明實施例5-6和對比例5提供的水痘病毒半成品凍干曲線。
【具體實施方式】
[0078] 下面結(jié)合實施例和對比例對本發(fā)明作進一步詳細、完整地說明。實施例中出現(xiàn)的 試劑或儀器在【具體實施方式】中無如特殊說明，均為市售，且按照其說明書進行操作，在此不 作贅述。
[0079] -、儀器：
[0080] I型凍干機，氟利昂制冷，電加熱，雙層隔板，高真空度維持〈15pa，冷阱溫度維持-65°C，隔板樣品溫差〈10°C，購自寧波新芝生物科技有限公司；（前期工藝開發(fā)使用）
[0081] Π 型凍干機，硅油制冷，雙層隔板，高真空度維持<25pa，冷阱溫度維持-65°C，隔板 樣品溫差<4°C，購自上海東富龍科技有限公司；（前期工藝開發(fā)使用）
[0082] m型凍干機，硅油制冷，雙層隔板，超高真空度維持<10pa，冷阱溫度維持-75°C，隔 板樣品溫差<4°C，購自上海拓領(lǐng)醫(yī)藥科技有限公司；（后期工藝驗證，實施例及對比例使用） [0083] 二、制劑瓶：
[0084] 中硼西林瓶，規(guī)格為7ml和5ml;
[0085] 溴化丁基膠塞，直徑20mm;
[0086] 鋁塑蓋，直徑20mm;
[0087] 三、試劑：
[0088] G1血清型輪狀病毒單價原液（即含有G1血清型輪狀病毒的基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液），使用 FRHL-2細胞接種G1血清型輪狀病毒后在MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備而得，F(xiàn)RHL-2細胞購自美國 惠氏公司；
[0089] G2血清型輪狀病毒單價原液（即含有G2血清型輪狀病毒的基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液），使用 FRHL-2細胞接種G2血清型輪狀病毒后在MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備而得；
[0090] G3血清型輪狀病毒單價原液（即含有G3血清型輪狀病毒的基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液），使用 FRHL-2細胞接種G3血清型輪狀病毒后在MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備而得；
[0091 ] G4血清型輪狀病毒單價原液（即含有G4血清型輪狀病毒的基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液），使用 FRHL-2細胞接種G4血清型輪狀病毒后在MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備而得；
[0092] 麻疹病毒原液(即含有麻疹病毒的基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液），使用雞胚原代細胞接種麻疹 病毒后在MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備而得，雞胚原代細胞培養(yǎng)參照現(xiàn)有技術(shù)制得；
[0093] 風(fēng)疹病毒原液（即含有風(fēng)疹病毒的基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液），使用MRC-5細胞接種風(fēng)疹病 毒后在MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備而得，MRC-5細胞由武漢病毒所提供實驗用細胞株；
[0094] 水痘病毒原液（即含有水痘病毒的基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液），使用MRC-5細胞接種水痘病 毒后在MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備而得；
[0095] 蔗糖，分析純；
[0096] 明膠，藥用級；
[0097]右旋糖酐，藥用級。
[0098] 實施例1制備凍干輪狀病毒四價疫苗
[0099] 發(fā)明人為了進一步獲得蔗糖作為保護劑在凍干原液中的百分濃度對疫苗指標的 影響，在相同的條件下，分別制備表1-2所示凍干原液中蔗糖濃度（即：1%、3%、5%、7%、 10%、12%、15%、20%)的八種凍干輪狀病毒四價疫苗，其制備方法均如下：
[0100]以制備凍干原液中蔗糖濃度為7%的輪狀病毒四價疫苗為例，在無菌環(huán)境下，進行 如下步驟：
[0101] 步驟1、配制濃度為70%、經(jīng)121°C滅菌處理15min的蔗糖母液；
[0102] 步驟2、將G1血清型輪狀病毒單價原液、G2血清型輪狀病毒單價原液、G3血清型輪 狀病毒單價原液和G4血清型輪狀病毒單價原液混合制備成輪狀病毒多價原液；
[0103] 步驟3、將步驟2所得輪狀病毒多價原液置于無菌容器內(nèi)，加入步驟1配制成的蔗糖 母液，使蔗糖濃度至7%，得混勻制備成含有蔗糖保護劑的病毒原液半成品，再分別以 1.0ml/瓶的規(guī)格灌裝于西林瓶內(nèi)以進行后續(xù)的凍干工藝；
[0104] 步驟4、將步驟3所得半成品進行預(yù)凍:預(yù)凍時快速降溫至-55°C，維持15h-20h;
[0105] 步驟5、將步驟4所得預(yù)凍后半成品進行第一階段干燥:升溫至_45°C~_40°C維持 50h，升溫至-40 °C~-33 °C維持22h;
[0106] 步驟6、將步驟5所得第一階段干燥后半成品進行第二階段干燥:設(shè)定不同時間內(nèi) 升溫至0°C~30°C，不同升溫階段繼續(xù)維持28h;即獲得凍干原液中蔗糖濃度為7%的凍干輪 狀病毒四價疫苗。
[0107] 其中，本實施例進行凍干步驟的各項參數(shù)如表1-1所示，所得各凍干輪狀病毒四價 疫苗的具體評價指標結(jié)果如表1-2所示，實施例1的凍干曲線如圖la所示。本發(fā)明中各實施 例與對比例中所有操作步驟嚴格按照藥典規(guī)定，如配置蔗糖母液的百分比系指溶液l〇〇ml 中含有的溶質(zhì)若干克;此外，凍干疫苗的制備方法可參考現(xiàn)有技術(shù)制備，在此均不做贅述。
[0108] 表1-1
[0112]由圖la和表1-2數(shù)據(jù)可知，1 %~5 %濃度的蔗糖凍干效果差，在此范圍內(nèi)的蔗糖濃 度無固定骨架形成，無法完成凍干，故使用濃度不適合作為保護劑使用；7%~10%濃度的 蔗糖凍干效果正常，在此濃度范圍內(nèi)，水分含量低，蔗糖可形成穩(wěn)定的骨架結(jié)構(gòu)支撐凍干完 成，符合藥典中對疫苗水分的規(guī)定，滿足凍干使用；12 %~20 %濃度的蔗糖其外觀凍干效果 較好，在此濃度范圍內(nèi)，蔗糖雖可形成穩(wěn)定的骨架結(jié)構(gòu)支撐凍干完成，但是水分含量偏高， 不符合藥典中對疫苗水分的規(guī)定，無法滿足凍干使用；結(jié)合凍干曲線可知凍干原液中較佳 蔗糖濃度范圍為7%~10%，最佳為7%。
[0113] 對比例1制備凍干輪狀病毒四價疫苗
[0114] 根據(jù)表1-4所示的其他常用保護劑及相應(yīng)含量制備凍干輪狀病毒四價疫苗作為對 比例1-1、1-2和1-3,用于評價實施例1(實施例1-4)所得凍干疫苗的效價。其中，本對比例進 行凍干步驟的各項參數(shù)如表1-3所示，實施例1-4和對比例1的凍干曲線如圖lb所示。
[0115] 表1-3
[0117] 復(fù)溶性、穩(wěn)定性以及過敏性實驗
[0118] 根據(jù)藥典對表1-4所示疫苗在相同實驗參數(shù)和條件下同時進行疫苗指標實驗，實 驗結(jié)果如表1-4所示：
[0119] 表1-4
[0120]
[0121] 由圖lb和表1-4數(shù)據(jù)可知：明膠加蔗糖的凍干效果最好，但是其具有過敏源性;右 旋糖酐過敏源性較明膠為好，但是復(fù)溶性較慢及效價損失較大;綜合可知實施例1-4所得疫 苗中的單成分鹿糖為最理想保護劑。
[0122] 實施例2制備凍干麻疹病毒減毒活疫苗
[0123] 發(fā)明人為了進一步獲得蔗糖作為保護劑在凍干原液中的百分濃度對疫苗指標的 影響，在相同的條件下，分別制備表2-2所示凍干原液中蔗糖濃度（即：1%、3%、5%、8%、 10%、12%、15%)的七種凍干麻疹病毒減毒活疫苗，其制備方法均如下：
[0124] 以制備凍干原液中蔗糖濃度為12%的凍干麻疹病毒減毒活疫苗為例，步驟如下：
[0125] 步驟1、配制濃度為70%、經(jīng)121°C滅菌處理15min的蔗糖母液；
[0126] 步驟2、將麻疹病毒原液置于無菌容器內(nèi)，加入步驟1配制成的蔗糖母液，使蔗糖濃 度至12%，混勻制備成含有蔗糖保護劑的病毒原液半成品，再分別以1.0ml/瓶的規(guī)格灌裝 于西林瓶內(nèi)以進行后續(xù)的凍干工藝；
[0127] 步驟3、將步驟2所得半成品進行預(yù)凍:預(yù)凍時快速降溫至_50°C，維持4.5h_8h;
[0128] 步驟4、將步驟3所得預(yù)凍后半成品進行第一階段干燥:升溫至_42°C~_33°C維持 96h；
[0129] 步驟5、將步驟4所得第一階段干燥后半成品進行第二階段干燥:設(shè)定不同時間內(nèi) 升溫至0°C~30°C，不同升溫階段繼續(xù)維持32h;即獲得凍干原液中蔗糖濃度為12%的凍干 麻疹病毒減毒活疫苗。
[0130]其中，本實施例進行凍干步驟的各項參數(shù)如表2-1所示，所得各凍干麻疹病毒減毒 活疫苗的具體評價指標結(jié)果如表2-2所示，實施例2的凍干曲線如圖2a所示。
[0135]由圖2a和表2-2數(shù)據(jù)可知，1 %~10 %濃度的蔗糖凍干效果差，在此范圍內(nèi)的蔗糖 濃度無固定骨架形成，無法完成凍干，故使用濃度不適合作為保護劑使用；12 %~15 %濃度 的蔗糖凍干效果正常，在此濃度范圍內(nèi)，水分含量低，蔗糖可形成穩(wěn)定的骨架結(jié)構(gòu)支撐凍干 完成，符合藥典中對疫苗水分的規(guī)定，滿足凍干使用;結(jié)合凍干曲線可知凍干原液中較佳蔗 糖濃度范圍為12%~15%，最佳為12%。
[0136] 對比例2制備凍干麻疹病毒減毒活疫苗
[0137] 根據(jù)表2-4所示的其他常用保護劑及相應(yīng)含量制備凍干麻疹病毒減毒活疫苗作為 對比例2-1、2-2和2-3，用于評價實施例2(實施例2-6)所得凍干疫苗的效價。其中，本對比例 進行凍干步驟的各項參數(shù)如表2-3所示，實施例2-6和對比例2的凍干曲線如圖2b所示。
[0138] 表2-3
[0140] 復(fù)溶性、穩(wěn)定性以及過敏性實驗
[0141] 根據(jù)藥典對表2-4所示疫苗在相同實驗參數(shù)和條件下同時進行疫苗指標實驗，實 驗結(jié)果如表2-4所示：
[0142] 表2-4
[0143]
[0144] 由圖2b和表2-4數(shù)據(jù)可知：明膠加蔗糖的凍干效果最好，但是其具有過敏源性;右 旋糖酐過敏源性較明膠為好，但是復(fù)溶性較慢及效價損失較大;綜合可知本發(fā)明提供的單 成分蔗糖為最理想保護劑。
[0145] 實施例3制備凍干風(fēng)疹病毒減毒活疫苗
[0146] 發(fā)明人為了進一步獲得蔗糖作為保護劑在凍干原液中的百分濃度對疫苗指標的 影響，在相同的條件下，分別制備表3-2所示凍干原液中蔗糖濃度（即：1%、3%、5%、8%、 10%、12%、15%、20%)的八種凍干風(fēng)疹病毒減毒活疫苗，其制備方法均如下：
[0147] 以制備凍干原液中蔗糖濃度為8%的凍干風(fēng)疹病毒減毒活疫苗為例，步驟如下：
[0148] 步驟1、配制濃度為70%、經(jīng)121°C滅菌處理15min的蔗糖母液；
[0149] 步驟2、將風(fēng)疹病毒原液置于無菌容器內(nèi)，加入步驟1配制成的蔗糖母液，使蔗糖濃 度至8%，混勻制備成含有蔗糖保護劑的病毒原液半成品，再分別以1.0ml/瓶的規(guī)格灌裝于 西林瓶內(nèi)以進行后續(xù)的凍干工藝；
[0150] 步驟3、將步驟2所得半成品進行預(yù)凍:預(yù)凍時快速降溫至_50°C，維持4h_5h;
[0151] 步驟4、將步驟3所得預(yù)凍后半成品進行第一階段干燥:升溫至-42°C~_38°C維持 4211，升溫至-35°(：~-33°(：維持1611 ;
[0152] 步驟5、將步驟4所得第一階段干燥后半成品進行第二階段干燥:設(shè)定不同時間內(nèi) 升溫至0°C~30°C，不同升溫階段繼續(xù)維持18h;即獲得凍干原液中蔗糖濃度為8%的凍干風(fēng) 疹病毒減毒活疫苗。
[0153]其中，本實施例進行凍干步驟的各項參數(shù)如表3-1所示，所得各凍干風(fēng)疹病毒減毒 活疫苗的具體評價指標結(jié)果如表3-2所示，實施例3的凍干曲線如圖3a所示。
[0158] 由圖3a和表3-2數(shù)據(jù)可知，1%~5%濃度的蔗糖凍干效果差，在此范圍內(nèi)的蔗糖濃 度無固定骨架形成，無法完成凍干，故使用濃度不適合作為保護劑使用；8%~10%濃度的 蔗糖凍干效果正常，在此濃度范圍內(nèi)，水分含量低，蔗糖可形成穩(wěn)定的骨架結(jié)構(gòu)支撐凍干完 成，符合藥典中對疫苗水分的規(guī)定，滿足凍干使用；12 %~20 %濃度的蔗糖其外觀凍干效果 較好，在此濃度范圍內(nèi)，蔗糖雖可形成穩(wěn)定的骨架結(jié)構(gòu)支撐凍干完成，但是水分含量偏高， 不符合藥典中對疫苗水分的規(guī)定，無法滿足凍干使用；結(jié)合凍干曲線可知凍干原液中較佳 蔗糖濃度范圍為8%~10%，最佳為8%。
[0159] 對比例3制備凍干風(fēng)疹病毒減毒活疫苗
[0160] 根據(jù)表3-4所示的其他常用保護劑及相應(yīng)含量制備凍干風(fēng)疹病毒減毒活疫苗作為 對比例3-1、3-2和3-3，用于評價實施例3(實施例3-4)所得凍干疫苗的效價。其中，本對比例 進行凍干步驟的各項參數(shù)如表3-3所示，實施例3-4和對比例3的凍干曲線如圖3b所示。
[0161] 表3-3
[0163] 復(fù)溶性、穩(wěn)定性以及過敏性實驗
[0164] 根據(jù)藥典對表3-4所示疫苗在相同實驗參數(shù)和條件下同時進行疫苗指標實驗，實 驗結(jié)果如表3-4所示：
[0165] 表3-4
[0166]
[0167] 由圖3b和表3-4數(shù)據(jù)可知：明膠加蔗糖的凍干效果最好，但是其具有過敏源性;右 旋糖酐過敏源性較明膠為好，但是復(fù)溶性較慢及效價損失較大;綜合可知本發(fā)明提供的單 成分蔗糖為最理想保護劑。
[0168] 實施例4制備凍干麻疹風(fēng)疹病毒二聯(lián)疫苗
[0169] 發(fā)明人為了進一步獲得蔗糖作為保護劑在凍干原液中的百分濃度對疫苗指標的 影響，在相同的條件下，分別制備表4-2所示凍干原液中蔗糖濃度（即：1%、3%、5%、7%、 10%、12%、15%)的七種凍干麻疹風(fēng)疹病毒二聯(lián)疫苗，其制備方法均如下：
[0170] 以制備凍干原液中蔗糖濃度為10%的凍干麻疹風(fēng)疹病毒二聯(lián)疫苗為例，步驟如 下：
[0171] 步驟1、配制濃度為70%、經(jīng)121°C滅菌處理15min的蔗糖母液；
[0172] 步驟2、將麻疹病毒原液和風(fēng)疹病毒原液混合制備成麻疹風(fēng)疹病毒原液；
[0173] 步驟3、將步驟2所得麻疹風(fēng)疹病毒原液置于無菌容器內(nèi)，加入步驟1配制成的蔗糖 母液，使蔗糖濃度至10%，混勻制備成含有蔗糖保護劑的病毒原液半成品，再分別以1.0ml/ 瓶的規(guī)格灌裝于西林瓶內(nèi)以進行后續(xù)的凍干工藝；
[0174] 步驟4、將步驟3所得半成品進行預(yù)凍:預(yù)凍時快速降溫至_55°C，維持4.5h_8h;
[0175] 步驟5、將步驟4所得預(yù)凍后半成品進行第一階段干燥:升溫至-40°C~_38°C維持 44h，升溫至-35 °C~-30 °C維持14h;
[0176] 步驟6、將步驟5所得第一階段干燥后半成品進行第二階段干燥:設(shè)定不同時間內(nèi) 升溫至0°C~30°C，不同升溫階段繼續(xù)維持24h;即獲得凍干原液中蔗糖濃度為10%的凍干 麻疹風(fēng)疹病毒二聯(lián)疫苗。
[0177]其中，本實施例進行凍干步驟的各項參數(shù)如表4-1所示，所得各麻疹風(fēng)疹病毒二聯(lián) 疫苗的具體評價指標結(jié)果如表4-2所示。實施例4的凍干曲線如圖4a所示。
[0182] 由圖4a和表4-2數(shù)據(jù)可知，1%~7%濃度的蔗糖凍干效果差，在此范圍內(nèi)的蔗糖濃 度無固定骨架形成，無法完成凍干，故使用濃度不適合作為保護劑使用；10%~15%濃度的 蔗糖凍干效果正常，在此濃度范圍內(nèi)，水分含量低，蔗糖可形成穩(wěn)定的骨架結(jié)構(gòu)支撐凍干完 成，符合藥典中對疫苗水分的規(guī)定，滿足凍干使用;結(jié)合凍干曲線可知凍干原液中較佳蔗糖 濃度范圍為10%~15%，最佳為10%。
[0183] 對比例4制備凍干麻疹風(fēng)疹病毒二聯(lián)疫苗
[0184] 根據(jù)表4-4所示的其他常用保護劑及相應(yīng)含量制備凍干麻疹風(fēng)疹病毒二聯(lián)疫苗作 為對比例4-1、4-2和4-3,用于評價實施例4(實施例4-5)所得凍干疫苗的效價。具體凍干疫 苗的制備方法參考現(xiàn)有技術(shù)制備，在此不做贅述。其中，本對比例進行凍干步驟的各項參數(shù) 如表4-3所示，實施例4-5和對比例4的凍干曲線如圖4b所示。
[0185] 表4-3
[0187] 復(fù)溶性、穩(wěn)定性以及過敏性實驗
[0188] 根據(jù)藥典對表4-4所示疫苗在相同實驗參數(shù)和條件下同時進行疫苗指標實驗，實 驗結(jié)果如表4-4所示：
[0189] 表4-4
[0190]
[0191 ]由圖4b和表4-4數(shù)據(jù)可知：明膠加蔗糖的凍干效果最好，但是其具有過敏源性;右 旋糖酐過敏源性較明膠為好，但是復(fù)溶性較慢;綜合可知本發(fā)明提供的單成分蔗糖為最理 想保護劑。
[0192] 實施例5制備凍干水痘病毒減毒活疫苗
[0193] 發(fā)明人為了進一步獲得蔗糖作為保護劑在凍干原液中的百分濃度對疫苗指標的 影響，在相同的條件下，分別制備表5-2所示凍干原液中蔗糖濃度（即：1%、3%、5%、8%、 10%、12%、15%)的七種凍干水痘病毒減毒活疫苗，其制備方法均如下：
[0194] 以制備凍干原液中蔗糖濃度為12%的凍干水痘病毒減毒活疫苗為例，步驟如下：
[0195] 步驟1、配制濃度為70%、經(jīng)121°C滅菌處理15min的蔗糖母液；
[0196] 步驟2、將水痘病毒原液置于無菌容器內(nèi)，加入步驟1配制成的蔗糖母液，使蔗糖濃 度至12%，混勻制備成含有蔗糖保護劑的病毒原液半成品，再分別以1.0ml/瓶的規(guī)格灌裝 于西林瓶內(nèi)以進行后續(xù)的凍干工藝；
[0197] 步驟3、將步驟2所得半成品進行預(yù)凍:預(yù)凍時快速降溫至_50°C，維持4.5h_8h;
[0198] 步驟4、將步驟3所得預(yù)凍后半成品進行第一階段干燥:升溫至-40°C~_38°C維持 40h，升溫至-35 °C~-30 °C維持12h;
[0199] 步驟5、將步驟4所得第一階段干燥后半成品進行第二階段干燥:設(shè)定不同時間內(nèi) 升溫至0°C~30°C，不同升溫階段繼續(xù)維持24h;即獲得凍干原液中蔗糖濃度為12%的凍干 水痘病毒減毒活疫苗。
[0200]其中，本實施例進行凍干步驟的各項參數(shù)如表5-1所示，所得各水痘減毒活疫苗的 具體評價指標結(jié)果如表5-2所示，實施例5的凍干曲線如圖5a所示。
[0205]由圖5a和表5-2數(shù)據(jù)可知，1 %~10%濃度的蔗糖凍干效果差，在此范圍內(nèi)的蔗糖 濃度無固定骨架形成，無法完成凍干，故使用濃度不適合作為保護劑使用；12 %~15 %濃度 的蔗糖凍干效果正常，在此濃度范圍內(nèi)，水分含量低，蔗糖可形成穩(wěn)定的骨架結(jié)構(gòu)支撐凍干 完成，符合藥典中對疫苗水分的規(guī)定，滿足凍干使用;結(jié)合凍干曲線可知凍干原液中較佳蔗 糖濃度范圍為12%~15%，最佳為12%。
[0206] 對比例5制備凍干水痘病毒減毒活疫苗
[0207] 根據(jù)表5-4所示的其他常用保護劑及相應(yīng)含量制備凍干水痘病毒減毒活疫苗作為 對比例5-1、5-2和5-3，用于評價實施例5(實施例5-6)所得凍干疫苗的效價。其中，本對比例 進行凍干步驟的各項參數(shù)如表5-3所示，實施例5-6和對比例5的凍干曲線如圖5b所示。
[0208] 表5-3
[0210] 復(fù)溶性、穩(wěn)定性以及過敏性實驗
[0211] 根據(jù)藥典對表5-4所示疫苗在相同實驗參數(shù)和條件下同時進行疫苗指標實驗，實 驗結(jié)果如表5-4所示：
[0212] 表5-4
[0213]
[0214] 由圖5b和表5-4數(shù)據(jù)可知，明膠加蔗糖的凍干效果最好，但是其具有過敏源性;右 旋糖酐過敏源性較明膠為好，但是復(fù)溶性較慢及效價損失較大;綜合可知本發(fā)明提供的單 成分蔗糖為最理想保護劑。
[0215] 由上述所有實驗結(jié)果可知，本發(fā)明提供的疫苗凍干保護劑可適用于各種不同疫 苗，尤其是病毒型疫苗的通用疫苗保護劑。具體如上述實驗結(jié)果所示，本發(fā)明提供的凍干疫 苗保護劑不僅適用于一般溫感型病毒類的麻疹風(fēng)疹病毒疫苗，也適用于熱敏感型病毒類的 水痘病毒疫苗，同樣適用于耐熱型病毒類的輪狀病毒疫苗。綜上，該通用疫苗凍干保護劑適 應(yīng)性廣，通過調(diào)整不同疫苗的不同凍干曲線即可制備相應(yīng)疫苗，對疫苗的具體生產(chǎn)工藝無 特殊要求，適合工業(yè)化生產(chǎn)所需。
【主權(quán)項】
1. 一種通用疫苗凍干保護劑，其特征在于:所述保護劑為單一成分的蔗糖，且作為疫苗 的凍干骨架。2. 權(quán)利要求1所述的保護劑，其特征在于:蔗糖在凍干原液中的初始濃度不大于20%。3. -種凍干疫苗的制備方法，其特征在于：在凍干過程中采用權(quán)利要求1所述的保護 劑。4. 權(quán)利要求11或12所述的制備方法，其特征在于，包括下列步驟： 步驟a)配制病毒原液半成品； 步驟b)將步驟a所得半成品進行預(yù)凍； 步驟c)將步驟b所得預(yù)凍后半成品進行干燥，即得凍干疫苗。5. -種輪狀病毒凍干疫苗，其特征在于:所述輪狀病毒凍干疫苗在凍干過程中采用單 一成分的蔗糖作為凍干骨架。6. -種麻疹病毒凍干疫苗，其特征在于:所述麻疹病毒凍干疫苗在凍干過程中采用單 一成分的蔗糖作為凍干骨架。7. -種風(fēng)疹病毒凍干疫苗，其特征在于:所述風(fēng)疹病毒凍干疫苗在凍干過程中采用單 一成分的蔗糖作為凍干骨架。8. -種麻疹風(fēng)疹病毒凍干二聯(lián)疫苗，其特征在于:所述麻疹風(fēng)疹病毒凍干二聯(lián)疫苗在 凍干過程中采用單一成分的蔗糖作為凍干骨架。9. 一種水痘病毒凍干疫苗，其特征在于:所述水痘病毒凍干疫苗在凍干過程中采用單 一成分的蔗糖作為凍干骨架。10. 權(quán)利要求1至10任一所述的保護劑用于制備疫苗凍干制劑的用途。
【文檔編號】A61K39/165GK106063933SQ201610046092
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年1月25日 公開號201610046092.6, CN 106063933 A, CN 106063933A, CN 201610046092, CN-A-106063933, CN106063933 A, CN106063933A, CN201610046092, CN201610046092.6
【發(fā)明人】王偉成, 祝洪敢, 鮑路偉, 李津
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