一種天然防腐劑ε-聚賴氨酸菌種及其篩選、發(fā)酵和鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品添加劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種天然防腐劑ε -聚賴氨酸菌種及其篩選方法。本發(fā)明所述菌種于2014年12月14日保藏于位于中國.武漢.武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號M 2014646，CCTCC NO:Μ 2014646，中文命名為分隔北里抱 ΚΥ3，英文命名為 jfiiasaiaSjOara clausa KY3。
【背景技術(shù)】
[0002]食品腐敗是指食品中的蛋白質(zhì)受腐敗細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分解酶的作用而被分解，依次向低分子化合物降解，生成各種有毒物質(zhì)和不愉快氣味物質(zhì)的過程。食品腐敗不僅降低了食品的食用價值，并帶來巨大的經(jīng)濟損失。目前，添加食品防腐劑是主要的防腐措施之一，食品防腐劑是能防止由微生物引起的腐敗變質(zhì)、延長食品保質(zhì)期的添加劑。在食品添加劑市場上使用的防腐劑種類很多，其中很大一部分是人工合成防腐劑，如山梨酸鉀、苯甲酸鈉等，超劑量濫用對人體可能會有一定的毒副作用。因此，開發(fā)綠色、安全、高效的生物防腐劑尤其是微生物防腐劑成為增加市場競爭力，提高經(jīng)濟效益和人民生活質(zhì)量的重要舉措。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種天然防腐劑，篩選出新的ε -聚賴氨酸菌種，為進一步選育聚賴氨酸高產(chǎn)菌株提供了優(yōu)良的新出發(fā)菌。此外，本發(fā)明提供了一種天然生物代謝產(chǎn)物一一 ε-聚賴氨酸，它是一種強力的天然抗菌防腐劑。本發(fā)明要解決的另一個問題是聚賴氨酸菌種的篩選方法。
[0004]本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的:
一種天然防腐劑ε -聚賴氨酸菌種，其特征在于，中文命名為分隔北里孢ΚΥ3，英文命名為Kitasatospora clausa KY3 ;該菌種于2014年12月14日保藏于位于中國?武漢?武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號M 2014646，CCTCC NO:M 2014646。
[0005]本發(fā)明還提供該天然防腐劑ε -聚賴氨酸菌種的篩選方法，其步驟包括，
(1)選取土壤樣品，自然風(fēng)干7天，碾碎，60°C烘2小時；
(2)取Ig烘干后土壤樣品，加入1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的鹽水中，30°C振蕩10分鐘，然后靜置30分鐘，吸取上清液；
(3)將20μ L的上清液涂布于含有濃度為130mg/L的K2Cr2O7的初篩培養(yǎng)基上，28-30°C培養(yǎng)5天；
(4)挑選產(chǎn)生透明圈的單菌落，置于斜面培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)3天，通過滴加Dragendorff試劑進行檢驗，周圍能與Dragendorff試劑形成明顯磚紅色聚集圈的產(chǎn)透明圈菌株，即為ε -聚賴氨酸菌株。
[0006]為了獲得更好的技術(shù)效果，步驟(I)中所述土壤選自江西省樟樹市郊水稻田或菜地； 步驟(3)中所述初篩培養(yǎng)基的組成為:甘油8-10g、瓊脂15-18g、酵母膏0.2-0.4g、NaH2PO4 0.5-0.8g、MgSO4 ■ 7H20 0.3-0.5g、( NH4 ) 2S04 0.6_0.8g、120_150mL 痕量礦物溶液，定容至1L，用質(zhì)量濃度0.1%的稀鹽酸或氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)為6.5-7.5，并在IXlO5Pa 下 121°C 滅菌 30_50min ；
所述痕量礦物溶液組成為:NaCl lg、H3BO3 0.0lg、CaCl2- 2H 20 0.1g、NH4Mo7O24- 4H 200.0lg，定容至IL ；
步驟(4)中所述斜面培養(yǎng)基含有初篩培養(yǎng)基和占初篩培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)為0.002%的美.~~.0
[0007]本發(fā)明還提供該天然防腐劑ε -聚賴氨酸菌種的發(fā)酵方法，其步驟包括，
(1)在5L自動發(fā)酵罐中裝入3.5 L混合液，混合液中含有800-1000 g/L葡萄糖和500-600 g/L (NH4)2SO4，按接種量8% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))取ε _聚賴氨酸菌種；
(2)在5L自動發(fā)酵罐中通風(fēng)量1.0 vvm，溫度30 °C，溶氧(DO)維持在20%，溶氧-轉(zhuǎn)速聯(lián)動；
(3)初始pH值為6.8，當(dāng)pH自然下降到3.8時，自動流加10%的氨水維持pH 3.8，每隔3-6 h取樣測量生物量、葡萄糖及ε-PL濃度，至碳源耗盡。
[0008]本發(fā)明還提供該天然防腐劑ε -聚賴氨酸菌種的鑒定方法，其步驟包括，
1)形態(tài)與培養(yǎng)特征:將ε-聚賴氨酸菌種置于在甘油-天門冬瓊脂上，30°C培養(yǎng)48h，孢子絲呈波曲狀，生成氣絲為灰白色，生長致密，在電子顯微鏡下孢子長橢圓形至橢圓形，大小差別較大；
2)細(xì)胞壁化學(xué)組分分析:將聚賴氨酸菌種發(fā)酵純化產(chǎn)物的水解液，聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的水解液和賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品進行薄層層析，結(jié)果顯示ε -聚賴氨酸菌種純化產(chǎn)物及ε -聚賴氨酸的水解產(chǎn)物和賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品在薄板上僅形成一個斑點，且Rf值相等，因此ε -聚賴氨酸菌種發(fā)酵產(chǎn)物為賴氨酸的均聚物；采用Sanger法測定其酰胺鍵連接方式為ε結(jié)構(gòu)，ε -聚賴氨酸菌種細(xì)胞全水解液中含有LLDAP，mesoDAP，糖成分有鼠里糖和葡萄糖；
3)ε -聚賴氨酸菌種16S rDNA全系列的相似性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析:經(jīng)PCR擴增、BLAST對比后，發(fā)現(xiàn)ε -聚賴氨酸菌種與分隔北里孢菌的16S rDNA序列相似性達到99%，認(rèn)為是分隔北里孢菌(Kitasatospora clausa)。
[0009]作為優(yōu)化，步驟(I)中所述甘油-天門冬培養(yǎng)基(g/L):甘油20，天冬素0.5，牛肉膏2，K2HP04 0.5，瓊脂20，pH 6.8，115°C滅菌20min ;步驟(2)中，所述ε -聚賴氨酸菌種發(fā)酵純化產(chǎn)物的水解液通過以下方法獲得:刮取ε -聚賴氨酸菌種的孢子兩環(huán)，接種到裝在500mL三角瓶內(nèi)的80 mL M3G培養(yǎng)基中，30°C，200 rpm培養(yǎng)24 h至生長對數(shù)期，提取水解液；
作為優(yōu)化，所述M3G培養(yǎng)基為:葡萄糖50-80 g，酵母粉5-8 g，(NH4)2SO4 10-12 g，KH2PO4.2H20 1.4-1.6 g，MgSO4.7H20 0.5-0.8 g，K2HPO4.2H20 0.8-1.0 g，F(xiàn)eSO4.7H200.03-0.05 g，ZnSO4.7H20 0.03-0.05 g，加水定容至1L，用0.1%稀鹽酸或氫氧化鈉溶液將pH 調(diào)節(jié)為 6.8-7.2。
[0010]ε -聚賴氨酸是一種由25-35個L-賴氨酸殘基構(gòu)成的同聚物，它是一種廣譜的抑菌劑，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌及酵母都具有不同程度的抑制作用。它安全性能高，熱穩(wěn)定性好，是一種天然的抗菌防腐劑，對人體不僅無害，還具有一定的營養(yǎng)價值，是今后開發(fā)的方向，是目前天然防腐劑中具有優(yōu)良防腐性能和巨大商業(yè)潛力的微生物類食品防腐劑。
【具體實施方式】
[0011]下面通過實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步具體的說明。
[0012]實施例1
一種天然防腐劑ε -聚賴氨酸菌種，其特征在于，中文命名為分隔北里孢ΚΥ3，英文命名為Kitasatospora clausa KY3 ;該菌種于2014年12月14日保藏于位于中國?武漢?武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號M 2014646，CCTCC NO:M 2014646。
[0013]實施例2
實施例1所述天然防腐劑ε-聚賴氨酸菌種的篩選方法，其步驟包括，
(1)選取江西省樟樹市市郊水稻田、菜地等地的土壤樣品，自然風(fēng)干7天，碾碎，60°C烘2小時；
(2)取Ig土樣加入1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的NaCl溶液中，30°C振蕩10分鐘，然后靜置30分鐘，吸取上清液；
(3)將20μ L上清液涂布于含有130mg/L的K2Cr2O7初篩培養(yǎng)基上，28-30°C培養(yǎng)5天，篩選得到164株產(chǎn)堿菌株；
(4)挑選產(chǎn)生透明圈的單菌落，置于斜面培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)3天，通過滴加Dragendorff試劑進行檢驗，挑選出周圍能與Dragendorff試劑形成明顯磚紅色聚集圈的產(chǎn)透明圈菌株，即實施例1所述ε -聚賴氨酸菌株，共得到59株。
[0014]其中，步驟(3)所述初篩培養(yǎng)基的組成為:甘油10g、瓊脂18g、酵母膏0.2g、NaH2PO40.5g、MgSO4 ■ 7H20 0.3g、( NH4 )2S04 0.66g、120mL 痕量礦物溶液，定容至 1L，ρΗ7.0，并在 I X 15 Pal21°C 下滅菌 40min ;
所述痕量礦物溶液組成為:NaCl lg、H3BO3 0.0lg, CaCl2- 2H 20 0.1g、NH4Mo7O24- 4H