一種小分子牦牛奶酪蛋白多肽及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酪蛋白多肽領(lǐng)域，尤其涉及一種小分子酪蛋白多肽及制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 牦牛奶是優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)食品，但是又是較易引起過敏的食物之一。酪蛋白占牦牛奶 蛋白總量的80%，是牛乳中含量最高的蛋白質(zhì)，也是牦牛奶5種具變應(yīng)原性蛋白中，變應(yīng)原 性最強的蛋白質(zhì)。異性蛋白質(zhì)，如酪蛋白，由于其分子量過大，進入體內(nèi)后，未發(fā)育成熟的 嬰兒胃腸缺乏分解它們的酶，便作為抗原進入血液循環(huán)，刺激人體產(chǎn)生抗體，從而引起過敏 反應(yīng)，如腹痛、腹脹或腹瀉、哮喘、蕁麻疹、濕疹、過敏性鼻炎、大便常帶粘液和血等過敏等癥 狀。這些癥狀會給嬰幼兒帶來很大的痛苦。
[0003] 小分子蛋白質(zhì)或多肽就不會誘發(fā)免疫變態(tài)反應(yīng)。但是，小分子蛋白質(zhì)往往會失去 原形蛋白質(zhì)的營養(yǎng)和功效。而且，氨基酸本身的味道較苦，分解越充分、純度越高的氨基酸 味道越苦，因此，會影響口感。如何才能讓分解后的小分子蛋白質(zhì)既有營養(yǎng)，口感又好，一直 是一個難以協(xié)調(diào)的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的
[0005] 針對現(xiàn)有牦牛奶乳制品的現(xiàn)狀，發(fā)明一種小分子酪蛋白多肽，該多肽既有酪蛋白 的營養(yǎng)，而且對嬰幼兒不易產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)，口感又好的食品添加劑。
[0006] 技術(shù)方案
[0007] 本發(fā)明為一種小分子牦牛奶酪蛋白多肽，其序列為PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ。 其制備步驟包括（1)將牦牛奶1L與50-100ml凝乳酶混合，離心2000-3000rpm，5-10分 鐘，得到凝固沉淀物；（2)將凝固沉淀物加入水中，煮沸，離心2000-3000rpm，5-10分鐘， 取上清；（3)將上清液加入pH4-5的酸性緩沖液中，攪拌，離心10000-15000rpm，30-60分 鐘，得到沉淀物；⑷將沉淀物溶于PH4. 5-5. 0緩沖液中，經(jīng)S印hadexG25分離出分子量為 2-3KDa的多肽，即得。所述的凝乳酶，可以是木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、生姜 蛋白酶、合歡蛋白酶、朝鮮薊蛋白酶等。
[0008] 有益效果
[0009] 本發(fā)明的制備得到的小分子牦牛奶酪蛋白多肽，經(jīng)蛋白質(zhì)序列測定，序列為 PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ，純度大于60%。藥理實驗表明，該小分子多肽能顯著促進 Ca、Mg等微量元素的吸收，作用與酪蛋白相當(dāng)?？乖瓕嶒灲Y(jié)果表明，該小分子多肽沒有抗原 性。由于該多肽為小分子多肽，而不是氨基酸，因此口感較好。
【具體實施方式】
[0010] 實施例1
[0011] 將牦牛奶1L與50ml木瓜蛋白酶混合，離心2000rpm，5分鐘，得到凝固沉淀物；將 凝固沉淀物加入水中，煮沸，離心2000rpm，5分鐘，取上清；將上清液加入pH4-5的酸性緩 沖液中，攪拌，離心lOOOOrpm，30分鐘，得到沉淀物；將沉淀物溶于pH4. 5-5. 0緩沖液中， 經(jīng)S印hadexG25,pH7. 2的PBS緩沖液作為流動相，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即 得。采用固相蛋白質(zhì)自動測序儀測定該多肽的序列為PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ，純度為 87%〇
[0012] 實施例2
[0013] 將牦牛奶1L與100ml合歡蛋白酶混合，離心3000rpm，10分鐘，得到凝固沉淀物； 將凝固沉淀物加入水中，煮沸，離心3000rpm，10分鐘，取上清；將上清液加入pH4-5的酸性 緩沖液中，攪拌，離心15000rpm，60分鐘，得到沉淀物；將沉淀物溶于pH4. 5-5. 0緩沖液中， 經(jīng)S印hadexG25,pH7. 2的PBS緩沖液作為流動相，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即 得。采用固相蛋白質(zhì)自動測序儀測定該多肽的序列為PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ，純度為 76%〇
[0014] 實施例3
[0015] 免疫原性檢測：BALB/c白鼠6只，雌雄各半，口服分別給予36mg/kg的實施例1制 備得到的多肽。連續(xù)給藥8周，于1-12周眼眶靜脈叢定點取血每周一次，12000rpm離心 2min，分離血漿取上清液，-20°C低溫保存?zhèn)溆?。待室溫溶解后，?. lml上清液間接ELISA 檢測血清中抗體滴度，其中所述的ELISA檢測試劑盒購自上海生工。以各樣品實際A值 (0D450)比陰性對照血清A值即得RA值，RA彡2. 1即為陽性，將Blood bio-samples樣品 作一系列稀釋后進行檢測，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為該樣品的滴度。測定結(jié)果顯示。 1-12周收集的血樣，經(jīng)ELISA間接法檢測多肽誘導(dǎo)抗體的RA均小于1. 5,均為陰性。由此 可見，本發(fā)明得到的小分子牦牛奶酪蛋白多肽無免疫原性。
[0016] 實施例4
[0017] 血清中鈣離子的含量：ICR白鼠40只，雌雄各半，隨機分成4組，每組10只，分別 為空白組、牦牛奶組、酪蛋白多肽低、高劑量組，分別口服生理鹽水、牦牛奶、酪蛋白多肽9， 36mg/kg。連續(xù)給藥4周，于第四周末次給藥后眼眶靜脈叢定點取血測血清中鈣含量。
[0018] 結(jié)果：如表1，酪蛋白多肽低、高劑量組均能顯著性升高血清中鈣離子的含量 (P〈0. 05)，與牦牛奶組相比無差異。
[0019] 表1小分子牦牛奶酪蛋白多肽對血清f丐離子含量的影響（means土s)
[0020]
[0021] #p〈0.05模型組相比。
【主權(quán)項】
1. 一種小分子牦牛奶酪蛋白多肽，其特征在于，序列為PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述小分子牦牛奶酪蛋白多肽的制備方法，其特征在于，步驟包括 (1) 將牦牛奶IL與50-100ml凝乳酶混合，離心2000-3000rpm，5-10分鐘，得到凝固沉淀物； (2) 將凝固沉淀物加入水中，煮沸，離心2000-3000rpm，5-10分鐘，取上清；（3)將上清液加 入PH4-5的酸性緩沖液中，攪拌，離心10000-15000rpm，30-60分鐘，得到沉淀物；（3)將沉 淀物溶于pH4. 5-5. 0緩沖液中，經(jīng)S印hadex G25,分離出分子量為2-3KDa的多肽，即得。3. 根據(jù)權(quán)利要求書2小分子牦牛奶酪蛋白多肽的制備方法，其特征在于，所述的凝乳 酶是木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、生姜蛋白酶、合歡蛋白酶或朝鮮薊蛋白酶。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小分子牦牛奶酪蛋白多肽，主要涉及一種小分子酪蛋白多肽及制備領(lǐng)域。其序列為PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ。其制備步驟包括（1）將牦牛奶1L與50-100ml凝乳酶混合，離心2000-3000rpm，5-10分鐘，得到凝固沉淀物；（2）將凝固沉淀物加入水中，煮沸，離心2000-3000rpm，5-10分鐘，取上清；（3）將上清液加入pH4-5的酸性緩沖液中，攪拌，離心10000-15000rpm，30-60分鐘，得到沉淀物；（4）將沉淀物溶于pH4.5-5.0緩沖液中，經(jīng)Sephadex？G25，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即得。本發(fā)明的有意效益在于制備得到的多肽純度大于60%，能顯著促進Ca、Mg等微量元素的吸收，作用與酪蛋白相當(dāng)，無抗原性，口感較好。
【IPC分類】C07K14/47, C07K1/30, C12P21/06
【公開號】CN105111298
【申請?zhí)枴緾N201510548625
【發(fā)明人】葉亞東, 葉季峨
【申請人】常州亞當(dāng)生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年8月31日