牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽及其制備方法，包括物理及化學(xué)法對原料的預(yù)處理，明膠的制備，復(fù)合酶解制備ACE抑制膠原多肽，通過利用超濾、離子交換層析、凝膠過濾層析和高效液相色譜等方法進(jìn)行分離純化多肽，濃縮干燥。本發(fā)明技術(shù)方案成功從牦牛皮中提取膠原蛋白多肽，其具有良好的溶解度、乳化能力和起泡特性，具有較高的ACE抑制活性即降血壓功效，制法簡單、易操作、成本低，擴(kuò)展牦牛皮的應(yīng)用前景。
【專利說明】牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種膠原蛋白多肽及其制備方法，更加具體地說，尤其涉及牦牛皮降 血壓多肽及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 膠原蛋白肽通常是由膠原或明膠經(jīng)過蛋白酶等降解處理得到的產(chǎn)物，含有的氨基 酸和膠原的基本一致，特別是特征氨基酸羥脯氨酸。現(xiàn)代生物代謝的研究發(fā)現(xiàn)，通過一系列 酶消化蛋白，可以形成一些小分子的物質(zhì)，并被人體吸收。體內(nèi)吸收不僅局限于游離氨基酸 的形式，而且主要是以2-3個(gè)氨基酸組成的小肽形式直接吸收?？垢哐獕弘挠直环Q為血管 緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE)抑制肽。ACE抑制多肽是通過競爭性抑制作用，阻礙ACE的催化反應(yīng)， 與血管緊張素 I相比，ACE抑制肽與ACE的結(jié)合能力更強(qiáng)，而且還不容易釋放，從而阻礙ACE 催化水解血管緊張素 I成為血管緊張素II的生化反應(yīng)過程，發(fā)揮降低血壓的作用。
[0003] 自從蛇毒中發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽，已經(jīng)有許多研究嘗試合成ACE抑制多肽，如依那普 利、阿拉普利和賴諾普利等，這些合成化合物被用來治療人體的高血壓和心力衰竭等疾病。 但是合成的ACE抑制化合物一般都會有副作用，如咳嗽、味覺障礙、皮疹和血管神經(jīng)性水腫 等。因此，在最近10年，人們都在努力尋找天然來源的ACE抑制劑，盡管很少但是這些抑制 劑是沒有副作用的。
[0004] 牦牛是青藏高原地區(qū)的重要畜種，擁有頑強(qiáng)的生命力，生長環(huán)境是無污染、綠色純 天然的青藏高原。牦牛皮中含有人體必需的各種氨基酸、多種營養(yǎng)元素、二十多種對人體 有益的礦物質(zhì)。其化學(xué)成分主要由蛋白質(zhì)、水、無機(jī)鹽、脂類、色素及碳水化合物等組成，其 中水分占60% -70%，蛋白質(zhì)含量占到30% -40%，脂類的含量的百分比在2. 0% -4. 0%之 間，無機(jī)鹽含量為0. 3% -1. 0%，碳水化合物及其他占0. 5% -1. 5%。從牦牛皮中提取天然 的膠原蛋白多肽，可拓寬牦牛皮產(chǎn)品的種類，從而充分利用牦牛皮的營養(yǎng)價(jià)值和功用，防止 浪費(fèi)，保護(hù)環(huán)境。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，對牦牛皮進(jìn)行膠原蛋白提取，進(jìn)行明膠 的提取和復(fù)合酶解，獲得具有降血壓功效的膠原蛋白肽，擴(kuò)展牦牛皮的應(yīng)用前景。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明提供一種以牦牛皮為主原料的具有降血壓功效的膠原蛋白多肽的制備方 法，依據(jù)上述制備方法制備牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽，其工藝步驟包括物理及化學(xué)法對 原料的預(yù)處理，明膠的制備，復(fù)合酶解制備ACE抑制膠原多肽，通過利用超濾、離子交換層 析、凝膠過濾層析和高效液相色譜等方法進(jìn)行分離純化多肽，濃縮干燥，具體步驟是：
[0008] 步驟1，牦牛皮的脫毛，即將牦牛皮置于水中清洗除去表面雜質(zhì)，在剪去折干牦牛 皮上的毛后在60?80°C溫水中浸泡牦牛皮4?48h，機(jī)械徹底脫毛，清水沖洗，清除毛屑， 將皮剪切成〇. 5X0. 5cm的小塊，得到脫毛的牦牛皮，置于-18?-20°C冷凍保存；
[0009] 步驟2,牦牛皮的脫脂，即將步驟1脫毛的牦牛皮置于5wt%?20wt%正丁醇的水 溶液中（即在溶液中，正丁醇的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5 - 20% )，在溶液溫度為0?10°C下連續(xù)攪 拌4?48h，得到脫脂的牦牛皮，所述步驟1脫毛的牦牛皮與正丁醇的水溶液的質(zhì)量比為1 : (5 ?20);
[0010] 步驟3,牦牛皮的除雜蛋白，即將步驟2脫脂的牦牛皮置于堿液中，在0?10°C下 連續(xù)攪拌5?48h，得到除雜蛋白的牦牛皮，其中所述堿液為0. 01?0. 2M的氫氧化鈉水溶 液或者氫氧化鉀水溶液，所述步驟2脫脂的牦牛皮與堿液的質(zhì)量比為1 : (15?40);
[0011] 步驟4,牦牛皮的脫酸，即將步驟3除雜蛋白的牦牛皮置于酸液中，在室溫20- 25°C攪拌浸泡2?15h，再反復(fù)水洗牦牛皮至pH值達(dá)到5?7,得到脫酸牦牛皮，其中所述 酸液為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為〇. 01 %?2 %的鹽酸水溶液或者硫酸水溶液，所述步驟3除雜蛋白的 牦牛皮與酸液的質(zhì)量比為1 : (5?15);
[0012] 步驟5,對脫酸牦牛皮進(jìn)行抽提，即將步驟4脫酸的牦牛皮置于70?90°C的熱水 中攪拌抽提，所述步驟4脫酸的牦牛皮與熱水的質(zhì)量比為1 : (5?15)，在攪拌抽提過程中 每隔30?120min進(jìn)行過濾并更換熱水繼續(xù)進(jìn)行攪拌抽提，直至牦牛皮全部溶解，每次過濾 得到的濾液匯總成為水抽提產(chǎn)物；
[0013] 步驟6,將水抽提產(chǎn)物制備明膠粉末，即將步驟5得到的水抽提產(chǎn)物（即牦牛皮全 部溶解后得到的全部膠液）在4000?10000g離心力下離心2?20min，收集上清液，利用 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮后干燥得到明膠粉末，2?4°C儲存?zhèn)溆茫?br> [0014] 步驟7,對明膠粉末進(jìn)行酶解，即將步驟6制備的明膠粉末溶于0. 01?0. 2M的磷 酸鈉緩沖溶液中以得到質(zhì)量百分?jǐn)?shù)4?10%的明膠水溶液，加入復(fù)合酶進(jìn)行酶解，加酶量 為底物（即明膠粉末）重量的〇. 1?2%，酶解溫度為35?55°C，酶解時(shí)間4?8h，pH值 為7 ;酶解后置于75?90°C滅酶處理5?15min ;滅活后，在4000?10000g離心力下離心 15?40min，保留上清液；
[0015] 步驟8,將步驟7制備的上清液進(jìn)行超濾以得到所需分子量的膠原蛋白溶液，其中 選擇使用超濾膜進(jìn)行超濾，分別使用分子量為10kDa及3000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，得到分 子量為小于10kDa和3000Da的膠原蛋白溶液。
[0016] 優(yōu)選的，在步驟2中，所述正丁醇濃度優(yōu)選10 - 20 %，溫度為5?10°C，時(shí)間為 20 ?40h。
[0017] 優(yōu)選的，在步驟3中，所述堿液為氫氧化鈉的水溶液，摩爾濃度為0. 01M，除雜溫度 為2?6°C，時(shí)間為15 - 40h。
[0018] 優(yōu)選的，在步驟4中，所述酸液為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.01%?2%的鹽酸水溶液，在室 溫20- 25°C攪拌浸泡10?15h。
[0019] 優(yōu)選的，在步驟6中，在濃縮后進(jìn)行的干燥為冷凍干燥或者噴霧干燥。
[0020] 優(yōu)選的,在步驟7中，復(fù)合酶酶解明膠，復(fù)合酶為胰蛋白酶和堿性蛋白酶，兩者質(zhì) 量比例為（0.5-1. 5) :1，復(fù)合蛋白酶添加量為明膠粉末質(zhì)量的0. 在35?55°C下 酶解4?8h。
[0021] 優(yōu)選的，在完成步驟8的超濾之后，進(jìn)行離子交換層析、凝膠過濾層析和高效液相 色譜等方法進(jìn)行分離純化多肽，濃縮干燥，以得到膠原蛋白多肽的粉末。
[0022] 利用本發(fā)明的技術(shù)方案成功從牦牛皮中提取膠原蛋白多肽，其具有良好的溶解 度、乳化能力和起泡特性，具有較高的ACE抑制活性即降血壓功效。制法簡單、易操作、成本 低。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。 HHL:Hippuryl-Histidyl-Leucin馬尿酰組氨酸亮氨酸（購于sigma公司）、鹽干牦牛皮（青 海牛牦牛市場）、胰蛋白酶（分析純試劑、購于天津諾維信公司）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE) 分析純（購于天津諾維信公司）、堿性蛋白酶（天津諾維信公司提供）、噴霧干燥機(jī)（上海 雅程有限公司）。
[0024] 實(shí)例 1
[0025] (1)將牦牛皮置于水中清洗除去表面雜質(zhì)，再剪去折干牦牛皮上的毛，后在80°C 溫水中浸泡牦牛皮20h，機(jī)械徹底脫毛，清水沖洗，清除毛屑，將皮剪切成0. 5 X 0. 5cm的小 塊，得到脫毛的牦牛皮，置于-18?_20°C冷凍保存；
[0026] (2)將脫毛牦牛皮置于12%正丁醇中，料液比為1:10,在溶液溫度為4°C下連續(xù)攪 拌20h，得到脫脂的牦牛皮；
[0027] (3)將脫脂牦牛皮以1 :15的比例置于摩爾濃度為0. 1M的堿液中，在4°C下連續(xù)攪 拌20h，得到除雜蛋白的牦牛皮；
[0028] (4)將除雜蛋白牦牛皮置于0. 2%的酸溶液中，料液比為1 :10,室溫?cái)嚢杞?h， 再反復(fù)水洗牦牛皮至pH值達(dá)到7,得到脫酸牦牛皮；
[0029] (5)將脫酸牦牛皮以1:5的比例置于80°C的熱水中攪拌抽提，每隔30min過濾并 更換蒸餾水，至碎皮全部溶解，得到水抽提產(chǎn)物；
[0030] (6)將水抽提產(chǎn)物即全部膠液，8000g離心力下離心15min，收集上清液；
[0031] (7)將上清液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，后干燥得到明膠粉末，4°C儲存?zhèn)溆茫?br> [0032] (8)將明膠粉末溶于0. 1M的磷酸鈉緩沖溶液，得到5%的明膠溶液，后加入復(fù)合 酶進(jìn)行酶解，加酶量為底物重量的1 %，復(fù)合酶為胰蛋白酶和堿性蛋白酶，兩者質(zhì)量比例為 0. 5 :1，酶解溫度為50°C，酶解時(shí)間6h，pH值為7 ;酶解后置于90°C滅酶處理lOmin ;滅活后， 4000g離心30min，保留上清；
[0033] (9)將上清液分別通過分子量為lOkDa及3000Da的超濾膜超濾，得到分子量為小 于lOkDa和3000Da的膠原蛋白溶液，ACE抑制能力IC50分別為0· 802mg/ml，0· 437mg/ml。
[0034] 實(shí)例 2
[0035] (1)將牦牛皮置于水中清洗除去表面雜質(zhì)，再剪去折干牦牛皮上的毛，后在80°C 溫水中浸泡牦牛皮l〇h，機(jī)械徹底脫毛，清水沖洗，清除毛屑，將皮剪切成0. 5X0. 5cm的小 塊，得到脫毛的牦牛皮，置于-18?-20°C冷凍保存；
[0036] (2)將脫毛牦牛皮置于5%正丁醇中，料液比為1:5,在溶液溫度為4°C下連續(xù)攪拌 12h，得到脫脂的牦牛皮；
[0037] (3)將脫脂牦牛皮以1 :20的比例置于摩爾濃度為0. 1M的堿液中，在5°C下連續(xù)攪 拌20h，得到除雜蛋白的牦牛皮；
[0038] (4)將除雜蛋白牦牛皮置于1 %的酸溶液中，料液比為1 :5,室溫?cái)嚢杞?h，再反 復(fù)水洗牦牛皮至pH值達(dá)到7,得到脫酸牦牛皮；
[0039] (5)將脫酸牦牛皮以1:5的比例置于80°C的熱水中攪拌抽提，每隔40min過濾并 更換蒸餾水，至碎皮全部溶解，得到水抽提產(chǎn)物；
[0040] (6)將水抽提產(chǎn)物即全部膠液，8000g離心力下離心15min，收集上清液；
[0041] (7)將上清液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，后干燥得到明膠粉末，4°C儲存?zhèn)溆茫?br> [0042] (8)將明膠粉末溶于0. 05M的磷酸鈉緩沖溶液，得到4%的明膠溶液，后加入復(fù)合 酶進(jìn)行酶解，加酶量為底物重量的1%，復(fù)合酶為胰蛋白酶和堿性蛋白酶，兩者質(zhì)量比例為 1.5 :1，酶解溫度為40°C，酶解時(shí)間6h，pH值為7 ;酶解后置于85°C滅酶處理lOmin ;滅活后， 8000g離心15min，保留上清；
[0043] (9)將上清液分別通過分子量為lOkDa及3000Da的超濾膜超濾，得到分子量為小 于lOkDa和3000Da的膠原蛋白溶液，ACE抑制能力IC50分別為4. 780mg/ml，2. 012mg/ml。
[0044] 實(shí)例 3
[0045] (1)將牦牛皮置于水中清洗除去表面雜質(zhì)，再剪去折干牦牛皮上的毛，后在60°C 溫水中浸泡牦牛皮4h，機(jī)械徹底脫毛，清水沖洗，清除毛屑，將皮剪切成0. 5X0. 5cm的小 塊，得到脫毛的牦牛皮，置于-18?_20°C冷凍保存；
[0046] (2)將脫毛牦牛皮置于10%正丁醇中，料液比為1:10,在溶液溫度為4°C下連續(xù)攪 拌12h，得到脫脂的牦牛皮；
[0047] (3)將脫脂牦牛皮以1 :40的比例置于摩爾濃度為0. 2M的堿液中，在4°C下連續(xù)攪 拌20h，得到除雜蛋白的牦牛皮；
[0048] (4)將除雜蛋白牦牛皮置于2%的酸溶液中，料液比為1 :5,室溫?cái)嚢杞?h，再反 復(fù)水洗牦牛皮至pH值達(dá)到6,得到脫酸牦牛皮；
[0049] (5)將脫酸牦牛皮以1:10的比例置于70°C的熱水中攪拌抽提，每隔60min過濾并 更換蒸餾水，至碎皮全部溶解，得到水抽提產(chǎn)物；
[0050] (6)將水抽提產(chǎn)物即全部膠液，6000g離心力下離心20min，收集上清液；
[0051] (7)將上清液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，后干燥得到明膠粉末，4°C儲存?zhèn)溆茫?br> [0052] (8)將明膠粉末溶于0. 15M的磷酸鈉緩沖溶液，得到10%的明膠溶液，后加入復(fù)合 酶進(jìn)行酶解，加酶量為底物重量的2%，復(fù)合酶為胰蛋白酶和堿性蛋白酶，兩者質(zhì)量比例為 0. 8 :1，酶解溫度為35°C，酶解時(shí)間4h，pH值為7 ;酶解后置于75°C滅酶處理lOmin ;滅活 后，6000g離心20min，保留上清；
[0053] (9)將上清液分別通過分子量為lOkDa及3000Da的超濾膜超濾，得到分子量為小 于lOkDa和3000Da的膠原蛋白溶液，ACE抑制能力IC50分別為12. 26mg/ml，5. 243mg/ml。
[0054] 實(shí)例 4
[0055] (1)將牦牛皮置于水中清洗除去表面雜質(zhì)，再剪去折干牦牛皮上的毛，后在70°C 溫水中浸泡牦牛皮48h，機(jī)械徹底脫毛，清水沖洗，清除毛屑，將皮剪切成0. 5X0. 5cm的小 塊，得到脫毛的牦牛皮，置于-18?_20°C冷凍保存；
[0056] (2)將脫毛牦牛皮置于20%正丁醇中，料液比為1:15,在溶液溫度為4°C下連續(xù)攪 拌12h，得到脫脂的牦牛皮；
[0057] (3)將脫脂牦牛皮以1 :30的比例置于摩爾濃度為0. 15M的堿液中，在4°C下連續(xù) 攪拌48h，得到除雜蛋白的牦牛皮；
[0058] (4)將除雜蛋白牦牛皮置于1. 5%的酸溶液中，料液比為1 :10,室溫?cái)嚢杞?0h， 再反復(fù)水洗牦牛皮至pH值達(dá)到7,得到脫酸牦牛皮；
[0059] (5)將脫酸牦牛皮以1:10的比例置于90°C的熱水中攪拌抽提，每隔80min過濾并 更換蒸餾水，至碎皮全部溶解，得到水抽提產(chǎn)物；
[0060] (6)將水抽提產(chǎn)物即全部膠液，10000g離心力下離心5min，收集上清液；
[0061] (7)將上清液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，后干燥得到明膠粉末，4°C儲存?zhèn)溆茫?br> [0062] (8)將明膠粉末溶于0. 05M的磷酸鈉緩沖溶液，得到4%的明膠溶液，后加入復(fù) 合酶進(jìn)行酶解，加酶量為底物重量的2 %，復(fù)合酶為胰蛋白酶和堿性蛋白酶，兩者質(zhì)量比例 為1 :1，酶解溫度為45°C，酶解時(shí)間8h，pH值為7 ;酶解后置于90°C滅酶處理lOmin ;滅活 后，8000g離心15min，保留上清；
[0063] (9)將上清液分別通過分子量為10kDa及3000Da的超濾膜超濾，得到分子量為小 于10kDa和3000Da的膠原蛋白溶液，ACE抑制能力IC50分別為1. 67mg/ml，0· 721mg/ml。
[0064] 實(shí)例 5
[0065] (1)將牦牛皮置于水中清洗除去表面雜質(zhì)，再剪去折干牦牛皮上的毛，后在75°C 溫水中浸泡牦牛皮4h，機(jī)械徹底脫毛，清水沖洗，清除毛屑，將皮剪切成0. 5X0. 5cm的小 塊，得到脫毛的牦牛皮，置于-18?_20°C冷凍保存；
[0066] (2)將脫毛牦牛皮置于5%正丁醇中，料液比為1:5,在溶液溫度為10°C下連續(xù)攪 拌12h，得到脫脂的牦牛皮；
[0067] (3)將脫脂牦牛皮以1 :15的比例置于摩爾濃度為0. 15M的堿液中，在10°C下連續(xù) 攪拌24h，得到除雜蛋白的牦牛皮；
[0068] (4)將除雜蛋白牦牛皮置于0. 05%的酸溶液中，料液比為1 :5,室溫?cái)嚢杞?5h， 再反復(fù)水洗牦牛皮至pH值達(dá)到7,得到脫酸牦牛皮；
[0069] (5)將脫酸牦牛皮以1:15的比例置于90°C的熱水中攪拌抽提，每隔30min過濾并 更換蒸餾水，至碎皮全部溶解，得到水抽提產(chǎn)物；
[0070] (6)將水抽提產(chǎn)物即全部膠液，4000g離心力下離心30min，收集上清液；
[0071] (7)將上清液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，后干燥得到明膠粉末，4°C儲存?zhèn)溆茫?br> [0072] (8)將明膠粉末溶于1M的磷酸鈉緩沖溶液，得到5%的明膠溶液，后加入復(fù)合酶 進(jìn)行酶解，加酶量為底物重量的〇. 5%，復(fù)合酶為胰蛋白酶和堿性蛋白酶，兩者質(zhì)量比例為 1.2 :1，酶解溫度為55°C，酶解時(shí)間6h，pH值為7 ;酶解后置于90°C滅酶處理lOmin ;滅活 后，4000g離心30min，保留上清；
[0073] (9)將上清液分別通過分子量為10kDa及3000Da的超濾膜超濾，得到分子量為小 于10kDa和3000Da的膠原蛋白溶液，ACE抑制能力IC50分別為8. 561mg/ml，2. 331mg/ml。
[0074] 在本發(fā)明技術(shù)方案中，ACE抑制能力的測定方法如下：
[0075] HHL底物溶液配制：將HHL溶于pH8. 350mmol/L硼酸緩沖液中（含0· 5mol/LNaCl)， 配制成8. 3mmol/L的溶液
[0076] 取50μl樣品與150μlHHL底物溶液在37°C預(yù)熱5min后，加入50μlACE酶液 (25mU/ml)，在37°C反應(yīng)60min后立即加入250μ llmol/LHCl終止反應(yīng)。加入1. 5ml乙酸乙 酯萃取反應(yīng)生成的馬尿酸，1200Xg轉(zhuǎn)速下離心15min，吸取乙酸乙酯層溶液lml加入干凈 試管中，放入烘箱120°C揮發(fā)溶劑35min，最后用3ml蒸饋水溶解馬尿酸，測定228nm下的吸 光度值。
【權(quán)利要求】
1. 牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽，其特征在于，按照下述步驟進(jìn)行： 步驟1，牦牛皮的脫毛，即將牦牛皮置于水中清洗除去表面雜質(zhì)，在剪去折干牦牛皮上 的毛后在60?80°C溫水中浸泡牦牛皮4?48h，機(jī)械徹底脫毛，清水沖洗，清除毛屑，將皮 剪切成0. 5X0. 5cm的小塊，得到脫毛的牦牛皮，置于-18?-20°C冷凍保存； 步驟2,牦牛皮的脫脂，即將步驟1脫毛的牦牛皮置于5wt%?20wt%正丁醇的水溶液 中（即在溶液中，正丁醇的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5-20% )，在溶液溫度為0?10°C下連續(xù)攪拌4? 48h，得到脫脂的牦牛皮，所述步驟1脫毛的牦牛皮與正丁醇的水溶液的質(zhì)量比為1 : (5? 20)； 步驟3,牦牛皮的除雜蛋白，即將步驟2脫脂的牦牛皮置于堿液中，在0?10°C下連續(xù) 攪拌5?48h，得到除雜蛋白的牦牛皮，其中所述堿液為0. 01?0. 2M的氫氧化鈉水溶液或 者氫氧化鉀水溶液，所述步驟2脫脂的牦牛皮與堿液的質(zhì)量比為1 : (15?40); 步驟4,牦牛皮的脫酸，即將步驟3除雜蛋白的牦牛皮置于酸液中，在室溫20- 25°C攪 拌浸泡2?15h，再反復(fù)水洗牦牛皮至pH值達(dá)到5?7,得到脫酸牦牛皮，其中所述酸液為 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為〇. 01 %?2%的鹽酸水溶液或者硫酸水溶液，所述步驟3除雜蛋白的牦牛皮 與酸液的質(zhì)量比為1 : (5?15); 步驟5,對脫酸牦牛皮進(jìn)行抽提，即將步驟4脫酸的牦牛皮置于70?90°C的熱水中攪 拌抽提，所述步驟4脫酸的牦牛皮與熱水的質(zhì)量比為1 : (5?15)，在攪拌抽提過程中每隔 30?120min進(jìn)行過濾并更換熱水繼續(xù)進(jìn)行攪拌抽提，直至牦牛皮全部溶解，每次過濾得到 的濾液匯總成為水抽提產(chǎn)物； 步驟6,將水抽提產(chǎn)物制備明膠粉末，即將步驟5得到的水抽提產(chǎn)物（即牦牛皮全部溶 解后得到的全部膠液）在4000?10000g離心力下離心2?20min，收集上清液，利用旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮后干燥得到明膠粉末，2?4°C儲存?zhèn)溆茫? 步驟7,對明膠粉末進(jìn)行酶解，即將步驟6制備的明膠粉末溶于0. 01?0. 2M的磷酸鈉 緩沖溶液中以得到質(zhì)量百分?jǐn)?shù)4?10 %的明膠水溶液，加入復(fù)合酶進(jìn)行酶解，加酶量為底 物（即明膠粉末）重量的〇· 1?2%，酶解溫度為35?55°C，酶解時(shí)間4?8h，pH值為7 ; 酶解后置于75?90°C滅酶處理5?15min ;滅活后，在4000?10000g離心力下離心15? 40min,保留上清液； 步驟8,將步驟7制備的上清液進(jìn)行超濾以得到所需分子量的膠原蛋白溶液，其中選擇 使用超濾膜進(jìn)行超濾，分別使用分子量為10kDa及3000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，得到分子量 為小于10kDa和3000Da的膠原蛋白溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽，其特征在于，在步驟2中，所述 正丁醇濃度優(yōu)選10 - 20%，溫度為5?10°C，時(shí)間為20?40h ;在步驟3中，所述堿液為氫 氧化鈉的水溶液，摩爾濃度為0. 01M，除雜溫度為2?6°C，時(shí)間為15-40h ;在步驟4中，所 述酸液為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為〇. 01 %?2%的鹽酸水溶液，在室溫20- 25°C攪拌浸泡10?15h。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽，其特征在于，在步驟6中，在濃 縮后進(jìn)行的干燥為冷凍干燥或者噴霧干燥。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽，其特征在于，在完成步驟8的超 濾之后，進(jìn)行離子交換層析、凝膠過濾層析和高效液相色譜等方法進(jìn)行分離純化多肽，濃縮 干燥，以得到膠原蛋白多肽的粉末。
5. 牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽的制備方法，其特征在于，按照下述步驟進(jìn)行：步驟1， 牦牛皮的脫毛，即將牦牛皮置于水中清洗除去表面雜質(zhì)，在剪去折干牦牛皮上的毛后在 60?80°C溫水中浸泡牦牛皮4?48h，機(jī)械徹底脫毛，清水沖洗，清除毛屑，將皮剪切成 0. 5X0. 5cm的小塊，得到脫毛的牦牛皮，置于-18?-20°C冷凍保存； 步驟2,牦牛皮的脫脂，即將步驟1脫毛的牦牛皮置于5wt%?20wt%正丁醇的水溶液 中（即在溶液中，正丁醇的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5-20% )，在溶液溫度為0?10°C下連續(xù)攪拌4? 48h，得到脫脂的牦牛皮，所述步驟1脫毛的牦牛皮與正丁醇的水溶液的質(zhì)量比為1 : (5? 20)； 步驟3,牦牛皮的除雜蛋白，即將步驟2脫脂的牦牛皮置于堿液中，在0?1(TC下連續(xù) 攪拌5?48h，得到除雜蛋白的牦牛皮，其中所述堿液為0. 01?0. 2M的氫氧化鈉水溶液或 者氫氧化鉀水溶液，所述步驟2脫脂的牦牛皮與堿液的質(zhì)量比為1 : (15?40); 步驟4,牦牛皮的脫酸，即將步驟3除雜蛋白的牦牛皮置于酸液中，在室溫20- 25°C攪 拌浸泡2?15h，再反復(fù)水洗牦牛皮至pH值達(dá)到5?7,得到脫酸牦牛皮，其中所述酸液為 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為〇. 01 %?2%的鹽酸水溶液或者硫酸水溶液，所述步驟3除雜蛋白的牦牛皮 與酸液的質(zhì)量比為1 : (5?15); 步驟5,對脫酸牦牛皮進(jìn)行抽提，即將步驟4脫酸的牦牛皮置于70?90°C的熱水中攪 拌抽提，所述步驟4脫酸的牦牛皮與熱水的質(zhì)量比為1 : (5?15)，在攪拌抽提過程中每隔 30?120min進(jìn)行過濾并更換熱水繼續(xù)進(jìn)行攪拌抽提，直至牦牛皮全部溶解，每次過濾得到 的濾液匯總成為水抽提產(chǎn)物； 步驟6,將水抽提產(chǎn)物制備明膠粉末，即將步驟5得到的水抽提產(chǎn)物（即牦牛皮全部溶 解后得到的全部膠液）在4000?10000g離心力下離心2?20min，收集上清液，利用旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮后干燥得到明膠粉末，2?4°C儲存?zhèn)溆茫? 步驟7,對明膠粉末進(jìn)行酶解，即將步驟6制備的明膠粉末溶于0. 01?0. 2M的磷酸鈉 緩沖溶液中以得到質(zhì)量百分?jǐn)?shù)4?10 %的明膠水溶液，加入復(fù)合酶進(jìn)行酶解，加酶量為底 物（即明膠粉末）重量的〇· 1?2%，酶解溫度為35?55°C，酶解時(shí)間4?8h，pH值為7 ; 酶解后置于75?90°C滅酶處理5?15min ;滅活后，在4000?10000g離心力下離心15? 40min,保留上清液； 步驟8,將步驟7制備的上清液進(jìn)行超濾以得到所需分子量的膠原蛋白溶液，其中選擇 使用超濾膜進(jìn)行超濾，分別使用分子量為10kDa及3000Da的超濾膜進(jìn)行超濾，得到分子量 為小于10kDa和3000Da的膠原蛋白溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽的制備方法，其特征在于，在步 驟2中，所述正丁醇濃度優(yōu)選10 - 20%，溫度為5?10°C，時(shí)間為20?40h ;在步驟3中， 所述堿液為氫氧化鈉的水溶液，摩爾濃度為〇. 01M,除雜溫度為2?6°C,時(shí)間為15 - 40h ; 在步驟4中，所述酸液為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 01 %?2 %的鹽酸水溶液，在室溫20-25 °C攪拌 浸泡10?15h。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽的制備方法，其特征在于，在步 驟6中，在濃縮后進(jìn)行的干燥為冷凍干燥或者噴霧干燥。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的牦牛皮降血壓膠原蛋白多肽的制備方法，其特征在于，在完 成步驟8的超濾之后，進(jìn)行離子交換層析、凝膠過濾層析和高效液相色譜等方法進(jìn)行分離
【文檔編號】C07K14/78GK104087641SQ201410326515
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】朱宏吉, 馬力, 王世鵬 申請人:天津大學(xué)