一種小分子多肽、其應(yīng)用及產(chǎn)品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小分子多肽、其應(yīng)用及產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)表明，所述小分子多肽，其應(yīng)用于制備降低缺血后神經(jīng)元壞死藥物、降低缺血后神經(jīng)元凋亡藥物及防治缺血性卒中藥物，具有良好的效果與實(shí)際操作可行性。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，為其活性成分包括所述小分子多肽的防治缺血性卒中的藥物，其為醫(yī)學(xué)上可接受的劑型，優(yōu)選為注射劑。
【專利說明】一種小分子多肽、其應(yīng)用及產(chǎn)品

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，涉及一種小分子多肽、其應(yīng)用及產(chǎn)品。

【背景技術(shù)】
[0002] 缺血性腦卒中是由于腦血流中斷，引起血栓形成或栓塞，導(dǎo)致大腦局部缺血的一 類嚴(yán)重的神經(jīng)疾病，患者會(huì)出現(xiàn)語言功能損傷，視力喪失，癱瘓甚至死亡。腦卒中發(fā)病率、死 亡率、致殘率居高不下，伴隨著人口老齡化的加劇，腦卒中的發(fā)生率還在逐漸上升。被公認(rèn) 為目前嚴(yán)重危害人類健康和生命安全的常見難治性疾病。
[0003] 盡管如此，目前針對(duì)腦缺血造成的損害所采取的治療手段卻非常有限，目前唯一 有效的治療是運(yùn)用組織纖溶酶原激活物（tPA)的溶栓療法。然而，出于安全考慮和溶栓治 療的時(shí)間窗較窄（小于4. 5小時(shí)），多數(shù)患者只能得到對(duì)癥支持治療。目前實(shí)驗(yàn)室針對(duì)腦缺 血治療所開發(fā)的小分子化合物已超過1000種，并開展了約200項(xiàng)臨床試驗(yàn)，但所有這些方 法運(yùn)用到臨床都面臨失敗。卒中的研宄走在了十字路口，若要取得突破，則必須對(duì)傳統(tǒng)治療 手段的利弊進(jìn)行再評(píng)價(jià)，與此同時(shí)，還應(yīng)研宄新的策略來指導(dǎo)臨床。因此，針對(duì)缺血性卒中 腦損傷，開發(fā)新的藥物來對(duì)抗腦損傷并保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞顯得格外重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種小分子多肽、其應(yīng)用及 產(chǎn)品，其目的在于提供一種小分子多肽，對(duì)于缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷具有修復(fù)作用，可用于制 備防治缺血性卒中藥物，由此解決目前針對(duì)腦缺血造成的損傷所采取的質(zhì)量手段有限的技 術(shù)問題。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種小分子多肽，其序列為SEQ ID NO. 1 所示。
[0006] 按照本發(fā)明的另一方面，提供了編碼所述小分子多肽的核苷酸序列。
[0007] 按照本發(fā)明的另一方面，提供了所述的小分子多肽的應(yīng)用，其應(yīng)用于制備降低缺 血后神經(jīng)元壞死藥物。
[0008] 按照本發(fā)明的另一方面，提供了所述的小分子多肽的應(yīng)用，其應(yīng)用于制備降低缺 血后神經(jīng)元凋亡藥物。
[0009] 按照本發(fā)明的另一方面，提供了所述的小分子多肽的應(yīng)用，其應(yīng)用于制備防治缺 血性卒中藥物。
[0010] 總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有 益效果：
[0011] (1)本發(fā)明提供的小分子多肽，和對(duì)照組相比，對(duì)于缺血后神經(jīng)元具有明顯的滋養(yǎng) 作用，實(shí)驗(yàn)表明，其應(yīng)用于制備降低缺血后神經(jīng)元凋亡藥物及防治缺血性卒中藥物，具有良 好的效果；
[0012] ⑵本發(fā)明所涉及的小分子多肽純度高，可溶，適合靜脈注射，無毒副作用，便于轉(zhuǎn) 化生產(chǎn)；
[0013] (3)本發(fā)明提供的小分子多肽，意在采用靜脈注射的方式達(dá)到改善缺血性卒中后 神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，減少缺血性卒中神經(jīng)細(xì)胞死亡和腦損傷的目的，其可以經(jīng)血液穿過血腦屏 障被神經(jīng)元攝取，可以轉(zhuǎn)化應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病如缺血性卒中，使其具有實(shí)際操作的可行 性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是實(shí)施例1制備本發(fā)明提供的小分子多肽的色譜圖；
[0015] 圖2是離體細(xì)胞水平實(shí)施例1中制備的小分子多肽對(duì)缺血性卒中治療作用的流程 圖；
[0016] 圖3是離體細(xì)胞水平實(shí)施例1中制備的小分子多肽應(yīng)用的最佳濃度探索結(jié)果示意 圖，其中圖3A為應(yīng)用不同濃度小分子多肽處理原代神經(jīng)元免疫沉淀實(shí)驗(yàn)后免疫印跡條帶 圖，圖3B為圖3A條帶灰度統(tǒng)計(jì)圖；
[0017] 圖4是實(shí)施例1中制備的小分子多肽減少氧糖剝奪（CO)處理后神經(jīng)元壞死，逆 轉(zhuǎn)OGD引起微興奮性突觸后電流（mEPSC)頻率和幅度下降的結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，其中圖4A為碘 化丙啶（PI)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，圖4B為樹突棘數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖，圖4C為mEPSC頻率統(tǒng)計(jì)圖，圖4D為 mEPSC幅度統(tǒng)計(jì)圖；
[0018] 圖5是在體動(dòng)物水平實(shí)施例1中制備的小分子多肽應(yīng)用的最佳濃度和治療時(shí)間窗 探索結(jié)果示意圖，其中圖5A為靜脈注射不同濃度小分子多肽免疫沉淀后免疫印跡結(jié)果示 意圖，圖5B為大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO)后不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用小分子多肽免疫沉淀后免疫印跡 結(jié)果示意圖；
[0019] 圖6是在體動(dòng)物水平實(shí)施例1中制備的小分子多肽對(duì)缺血性卒中治療作用的實(shí)施 方案圖；
[0020] 圖7是實(shí)施例1中制備的小分子多肽減少缺血性卒中后缺血梗死體積與神經(jīng)元死 亡的結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，其中圖7A為TTC染色結(jié)果示意圖，圖7B為Fluoro-Jade C(FJ)和TUNEL 染色結(jié)果示意圖；
[0021] 圖8是實(shí)施例1中制備的小分子多肽改善缺血性卒中后神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及運(yùn)動(dòng)平衡 功能的結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，其中圖8A為神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖，圖8B為1-5分鐘內(nèi)小鼠曠場(chǎng)運(yùn) 動(dòng)速度結(jié)果示意圖，圖8C為Rotarod轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要 彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
[0023] 本發(fā)明提供的小分子多肽，其序列為SEQ ID NO. 1所示，為：
[0024] Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Glu-Asp-Ser-Ser-Ser-Pro-P ro-Ser-Thr(YGRKKRRQRRR-EDSSSPPST)〇
[0025] 所述小分子多肽為商業(yè)化公司合成。
[0026] 編碼所述小分子多肽的核苷酸，其序列為SEQ ID NO. 2所示序列及其同義序列。
[0027] 本發(fā)明提供的小分子多肽具有滋養(yǎng)缺血后神經(jīng)元的作用，可應(yīng)用于制備降低缺血 后神經(jīng)元壞死藥物及制備降低缺血后神經(jīng)元凋亡藥物，從而可應(yīng)用于制備治療或預(yù)防缺血 性卒中藥物的應(yīng)用，具體如下：
[0028] (1)缺血性卒中細(xì)胞模型應(yīng)用所述小分子多肽
[0029] 氧糖剝奪（Oxygen Glucose Deprivation, 0GD)是一種缺血性中風(fēng)的體外細(xì)胞模 型。我們對(duì)體外培養(yǎng)14天的原代神經(jīng)元給予Lenti-EGFP-virus顯示樹突棘，共聚焦顯微 鏡下觀察樹突棘的密度，進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)感染了 GFP的神經(jīng)元進(jìn)行60分鐘OGD處理，然后再 觀察樹突棘的密度，結(jié)果樹突棘密度明顯下降。用5 μΜ的所述小分子多肽對(duì)培養(yǎng)的原代神 經(jīng)元進(jìn)行孵育處理，0⑶處理，結(jié)果樹突棘密度的下降得到抑制，說明所述小分子多肽處理 可以在細(xì)胞水平降低缺血后神經(jīng)元樹突棘丟失。PI染色檢測(cè)OGD后神經(jīng)元壞死情況，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)所述小分子多肽處理后壞死神經(jīng)元數(shù)量較對(duì)照組明顯下降。同時(shí)我們對(duì)〇⑶處理的原 代神經(jīng)元進(jìn)行電生理記錄，5 μ M的所述小分子多肽孵育處理能顯著提高AMPA受體介導(dǎo)的 mEPSC幅度和頻率，說明所述小分子多肽處理可以恢復(fù)0⑶導(dǎo)致的突觸功能損傷。
[0030] (2)缺血性卒中動(dòng)物模型應(yīng)用所述小分子多肽
[0031] 大腦中動(dòng)脈檢塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCA0)以及光照缺血檢 塞模型廣泛用于腦缺血研宄中，通過向小鼠頸動(dòng)脈中插入線拴堵塞大腦中動(dòng)脈能引起大腦 中動(dòng)脈支配的皮層紋狀體缺血，拔出線拴，則引起血流再灌注，從而引起缺血再灌注損傷， 以模擬臨床腦梗塞或腦栓塞的癥狀。光照缺血栓塞模型：小鼠腹腔注射Rose bengal，暴露 頭皮，15分鐘后冷光源照射大腦局部，10分鐘后，移除冷光源，則光照區(qū)域內(nèi)的血管形成血 栓，其所支配的腦區(qū)則缺血。采用一系列的實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)小鼠缺血后的表型。TTC染色反映缺 血梗死體積，F(xiàn)J和TUNEL檢測(cè)神經(jīng)元死亡與凋亡的情況，轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)Rotarod反映動(dòng)物協(xié)調(diào)平 衡能力，神經(jīng)系統(tǒng)功能評(píng)分（Neurological Score, N. S.)反映缺血后神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，曠場(chǎng)實(shí) 驗(yàn)檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。對(duì)動(dòng)物缺血再灌注后3小時(shí)和6小時(shí)的小鼠股靜脈注射2mg/kg的 所述小分子多肽溶液，動(dòng)物缺血再灌注第3天處理，TTC染色顯示給予所述小分子多肽的小 鼠腦缺血梗死體積顯著低于對(duì)照組實(shí)施例1制備的對(duì)照用小分子多肽或生理鹽水Vehicle 組。而FJ和TUNEL染色也顯示死亡的神經(jīng)元大大減少。此外，所述小分子多肽注射的小鼠 轉(zhuǎn)棒行為學(xué)與曠場(chǎng)行為學(xué)結(jié)果均較實(shí)施例1制備的對(duì)照用小分子多肽或Vehicle組得到顯 著改善，神經(jīng)癥狀評(píng)分也得到一致的結(jié)果。進(jìn)一步證明，所述小分子多肽對(duì)缺血性卒中具有 確切的治療作用。
[0032] 本發(fā)明提供的防治缺血性卒中的藥物，其活性成分包括本發(fā)明提供的小分子多 肽，濃度優(yōu)選5 μ M至500 μ M，其為醫(yī)學(xué)上可接受的劑型，優(yōu)選為注射劑。
[0033] 以下為實(shí)施例：
[0034] 實(shí)施例1本發(fā)明提供的小分子多肽及對(duì)照用小分子多肽的人工合成
[0035] 本發(fā)明提供的小分子RNA序列如SEQ ID NO. 1所示，由武漢百意欣生物技術(shù)有限 公司人工合成，合成報(bào)告如下所示，色譜如圖1所示。
[0036] 人工合成HPLC報(bào)告
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 一種小分子多肽，其特征在于，其序列為SEQ ID NO. 1所示。
2. 編碼如權(quán)利要求1所述小分子多肽的核苷酸序列。
3. -種如權(quán)利要求1所述的小分子多肽的應(yīng)用，其應(yīng)用于制備降低缺血后神經(jīng)元壞死 藥物。
4. 一種如權(quán)利要求1所述的小分子多肽的應(yīng)用，其應(yīng)用于制備降低缺血后神經(jīng)元凋亡 藥物。
5. -種如權(quán)利要求1所述的小分子多肽的應(yīng)用，其應(yīng)用于制備防治缺血性卒中藥物。
6. -種防治缺血性卒中的藥物，其特征在于，其活性成分包括如權(quán)利要求1所述的小 分子多肽，其為醫(yī)學(xué)上可接受的劑型，優(yōu)選為注射劑。
【文檔編號(hào)】A61P25/00GK104497106SQ201410734580
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】旺姍, 裴磊, 顏歡歡, 郭豫, 李 浩, 唐娜, 龐培, 魯友明 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)