楸樹CabuAP3蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種楸樹CabuAP3蛋白及其編碼基 因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 楸樹（CatalpabungeiC.A.Mey.)是我國特有的紫葳科梓樹屬（Catalpa)植物， 高大落葉喬木，分布在我國的河北、河南、山東、山西、陜西、甘肅、江蘇、浙江、湖南等省份， 另外在廣西、貴州、云南等地也均有栽培。因其樹形通直，材質(zhì)致密，堅固耐用，用途廣泛，自 古就有"木王"之稱，是我國重要的珍貴用材樹種；同時，楸樹樹形優(yōu)美，花大色艷，具有較高 的觀賞價值，常作為庭院觀賞植物。
[0003] APETALA3(AP3)基因是參與調(diào)控擬南芥花瓣和雄蕊發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。在擬南 芥花發(fā)育過程中，AP3基因的轉(zhuǎn)錄活性主要局限在第2和第3輪花器官中，在萼片原基出現(xiàn) 時開始表達(dá)，在花瓣和雄蕊原基發(fā)生后達(dá)到很高的表達(dá)水平，開花后，其表達(dá)開始下降。此 外，SUP基因能抑制AP3基因在雌蕊中的表達(dá)，確立花器官中AP3基因表達(dá)的內(nèi)邊界，而AP3 基因初期表達(dá)主要依賴LFY和UF0轉(zhuǎn)錄因子，后期表達(dá)主要受AP3/PI蛋白復(fù)合體影響。同 時，AP3同源基因演化是引起被子植物花瓣多樣性的一個重要原因，其演化過程經(jīng)歷了一系 列復(fù)雜的亞功能和失去功能的事件。因此，AP3同源基因的功能分化與植物花瓣的多樣性 密切相關(guān)。
[0004] 楸樹為頂生傘狀花序，花蕾是圓球形，花兩性；開花時，花冠為2唇形，上唇2裂，下 唇3裂，下唇有兩條黃色的脈紋和紫色斑點；雄蕊5枚，著生在花冠的基部，可育雄蕊2枚位 于花冠下唇內(nèi)，退化的雄蕊3枚，著生在花冠上唇內(nèi)。由于楸樹花冠優(yōu)美色艷，同時楸樹花 器官發(fā)育過程中又存在雄蕊敗育和自花不育的現(xiàn)象，因此開展與楸樹花冠和雄蕊發(fā)育的分 子調(diào)控機制研究具有重要意義。
[0005] 目前已公布的AP3基因及其同源基因，多來源于模式植物或者草本植物，這些植 物多為一年生植物，花芽材料容易獲得。而楸樹作為多年生木本植物，樹型高大挺拔，營養(yǎng) 生長周期長，花芽材料較難獲得。同時，由于植物基因的非編碼區(qū)（UTR)序列對目的基因是 不可缺少的，并對目的基因具有調(diào)控作用，且序列高度不保守，因此無法通過傳統(tǒng)同源克隆 的方法獲得。傳統(tǒng)的同源克隆主要依靠保守的蛋白序列設(shè)計兼并引物，但是經(jīng)常出現(xiàn)序列 同源性較差、不同生物的堿基使用偏好等原因，很難獲得楸樹的AP3同源基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種楸樹CabuAP3蛋白及 其編碼基因與應(yīng)用。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種楸樹CabuAP3蛋白，所述蛋白的氨基 酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[0008] 本發(fā)明還提供了前述蛋白的編碼基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了含有前述編碼基因序列的載體。
[0010] 本發(fā)明還提供了所述載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0011] 所述載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0012] 將兩端包含酶切位點的楸樹CabuAP3蛋白的編碼基因序列構(gòu)建到pmdl8_T載 體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞得到pmd18-CabuAP3重組質(zhì)粒，雙酶切pmd18-CabuAP3 重組質(zhì)粒和PBI121質(zhì)粒，連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后，獲得表達(dá)載體 PBI121-CabuAP3〇
[0013] 本發(fā)明還提供了含有所述載體的工程菌。
[0014] 本發(fā)明還提供了用于克隆前述編碼基因序列的引物對，所述引物對包括：
[0015] CabuAP3-F:5' -CTCAAATCTAGAAAATCAATGGCTC-3' ；
[0016] CabuAPS-Rj' -GCGCCCGGGTTCATTTTATTCAAGC-3'。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種楸樹CabuAP3基因，其cDNA全長的核苷酸序列如SEQID No. 3所示。
[0018] 本發(fā)明還提供了楸樹CabuAP3基因在改造植物花器官中的應(yīng)用。
[0019] 具體為，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法將楸樹CabuAP3基因或前述編碼基因序列 轉(zhuǎn)入植物中。
[0020] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0021] 本發(fā)明首次提供了楸樹花瓣和雄蕊發(fā)育相關(guān)的CabuAP3蛋白及其編碼基因與應(yīng) 用。本發(fā)明提供的CabuAP3基因僅在楸樹的花瓣和雄蕊中表達(dá)，而在葉片、萼片和雌蕊中不 表達(dá)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法將CabuAP3基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入野生型擬南芥和擬南芥 ap3-3突變體中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥額外長出了 1個花瓣，說明CabuAP3基因具 有調(diào)控轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥花瓣數(shù)量增加的新功能，而轉(zhuǎn)基因擬南芥ap3_3突變體長出了 花絲狀結(jié)構(gòu)。利用楸樹CabuAP3基因表達(dá)載體獲得的植物變異材料，可用于植物育種和觀 賞，具有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0022] 圖1是本發(fā)明所述楸樹花瓣和雄蕊發(fā)育相關(guān)的CabuAP3基因cDNA的核苷酸序列 圖。
[0023] 圖2是本發(fā)明所述CabuAP3基因所編碼的蛋白的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域劃分圖。
[0024] 圖3是本發(fā)明實施例1楸樹花芽totalRNA的3'RACE和5'RACE電泳圖。其中， a是 3'RACE的電泳圖，M為DNAmarkerIII，1 為 3'RACEoutPCR產(chǎn)物，2 為 3'RACEinner PCR產(chǎn)物；b是 5'RACE的電泳圖，M為DNAmarkerIII，l為 5'RACEoutPCR產(chǎn)物，2 為 5'RACE innerPCR產(chǎn)物；c為CabuAP3 基因CDS的PCR電泳圖，M為DNA11^11?^111，1為含有〇31311八?3 基因⑶S的PCR產(chǎn)物。
[0025] 圖4是本發(fā)明實施例3楸樹CabuAP3基因組織特異性表達(dá)電泳圖。
[0026] 圖5是本發(fā)明實施例4楸樹CabuAP3基因的植物轉(zhuǎn)基因載體PBI121-CabuAP3構(gòu) 建示意圖。
[0027] 圖6是本發(fā)明實施例6轉(zhuǎn)基因前后的野生型擬南芥和擬南芥ap3_3突變體的花朵 照片。其中a是野生型擬南芥；b是轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥；c是擬南芥ap3_3突變體；d是轉(zhuǎn) 基因擬南芥ap3-3突變體。
【具體實施方式】
[0028] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0029] 實施例中所使用的試劑主要包括分子生物學(xué)實驗試劑和試劑盒等，均可通過商業(yè) 途徑獲得，具體包括：RNA提取試劑盒購自Aidlab生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收 試劑盒、質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖泻蛅oplO大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技有限公司； 3'-fullRACECoreSetVer. 2.0 試劑盒和 5'-fullRACEKit試劑盒，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、 LA-taqDNA聚合酶、EX-taqDNA聚合酶、dNTP、pmdl8_T載體、XbaI和SmaI限制性內(nèi)切 酶、T4DNA連接酶均購自TaKaRa(寶生物工程（大連））有限公司；DNAmarkerm購自中科 瑞泰（北京）生物科技有限公司；引物合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成； 測序工作均由華大基因科技股份有限公司完成。本發(fā)明實施例中所提供的方法如果沒有特 殊說明均為常規(guī)方法。
[0030] 實施例1 一個楸樹CabuAP3基因cDNA序列的克隆
[0031] 1、楸樹花芽totalRNA的提取
[0032] 采集楸樹新鮮的長度約5mm的花芽，放入凍存管中，立即放入液氮中快速冷凍 3h后，放入-80°C超低溫冰箱中備用。使用RNA提取試劑盒提取楸樹花芽的totalRNA: 從_80°C超低溫冰箱中取出楸樹花芽材料，放入加有2mLRLT裂解液和100yLPLANTaid 的研缽中，在室溫下，充分研磨；將上述研磨液轉(zhuǎn)移至2mL的eppendorf管中，13000rpm離 心10min后，吸取500yL上清液，轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管中；向上清夜加入250yL無水 酒精，吹打混勻；將上述液體轉(zhuǎn)移至吸附柱中，并將吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入 500yL漂洗液，13000rpm離