一種豬飼料非淀粉多糖酶譜的快速篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種豬飼料非淀粉多糖酶譜的快速篩選方法，特別是涉及飼料非淀粉 多糖組分分析和利用體外模擬消化法快速優(yōu)化飼料非淀粉多糖酶譜的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 畜禽飼料的主體成分是碳水化合物，碳水化合物為動(dòng)物提供主要的能量。隨著 飼料成本持續(xù)上漲，不斷尋求較低廉的飼料原料（如：谷物類加工副產(chǎn)物，玉米DDGS，高粱 DDGS)部分替代傳統(tǒng)的玉米和豆柏飼料原料。然而，這些飼料原料常含有較高的非淀粉多 糖，這些非淀粉多糖一部分難以被動(dòng)物機(jī)體充分利用（Anguitaetal.，2006);另一部分 雖然可經(jīng)畜禽的大腸發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，提供能量，但這種方式功能的效率較低。目 前，通常采用添加非淀粉多糖酶改善養(yǎng)分的消化和發(fā)酵，從而提高飼料的利用率。非淀粉 多糖酶常包括木聚糖酶（Engbergetal.，2006 ;丁雪梅等，2009;Selleetal.，2003)、纖 維素酶（Nahmetal.，1985 ;陳曉春等，2005)、0 -葡聚糖酶（Philipetal.，1995;Yuet al.，1998)等。文獻(xiàn)資料顯示，非淀粉多糖酶提高畜禽飼料的能量效率不明顯，這與選擇的 非淀粉多糖酶的作用效果與飼糧組成、酶的活性、酶譜配伍以及酶促反應(yīng)環(huán)境密切相關(guān)。然 而，飼料選擇的非淀粉多糖酶的類型和配伍等不確定性，導(dǎo)致目前普遍對(duì)酶的添加具有一 定的盲目性和低效率性。
[0003] 分析飼料中非淀粉多糖組分是篩選飼料的外源添加酶的基礎(chǔ)，篩選飼料的最優(yōu)酶 譜的方法主要有體內(nèi)法（invivo)和體外法（invitro)。體內(nèi)法就是進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，常常 耗資、費(fèi)力、費(fèi)時(shí)，系統(tǒng)誤差和偶然誤差影響因素多。而體外法具有快速、簡(jiǎn)便、費(fèi)用低等優(yōu) 點(diǎn)，但目前體外法選擇的參數(shù)和條件常常缺乏理論的解釋，具有一定的隨意性（Coleset al.，2005)。因此，選取合理的體外模擬消化參數(shù)，模擬畜禽飼料的消化過(guò)程，針對(duì)不同飼料 非淀粉多糖成分特性，篩選與之相適應(yīng)的非淀粉多糖酶譜，對(duì)于充分發(fā)揮飼料潛能，提高飼 料利用率和增加養(yǎng)殖生產(chǎn)效益具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的技術(shù)解決問(wèn)題：為了克服目前飼料中非淀粉多糖酶添加的盲目性，提高 飼用酶制劑的功效，提供一種豬飼料非淀粉多糖酶譜的快速篩選方法，通過(guò)飼料非淀粉多 糖組分分析技術(shù)和體外法模擬動(dòng)物消化過(guò)程，使用飼料體外能值表征非淀粉多糖酶的作用 效果，快速獲取飼料最優(yōu)的非淀粉多糖酶譜。
[0005] 本發(fā)明的一種豬飼料非淀粉多糖酶譜的快速篩選方法，依次包括以下步驟：飼料 非淀粉多糖組分的分析、非淀粉多糖酶類型和劑量的設(shè)定、飼料胃腸道模擬消化、非淀粉多 糖酶譜的優(yōu)化，其中：
[0006] (1)飼料非淀粉多糖組分的分析：選取豬飼料放入粉碎機(jī)中，其中所述的飼料包 括配合飼料和組成配合飼料的原料；再將所述的粉碎機(jī)的轉(zhuǎn)速控制在8000~10000轉(zhuǎn)/分 鐘，粉碎時(shí)間為5~10分鐘；將粉碎后的飼料過(guò)0. 25~0. 42毫米篩；精確稱取飼料樣品， 測(cè)定配合飼料以及飼料原料的非淀粉多糖組分的含量；
[0007] (2)非淀粉多糖酶類型和劑量的設(shè)定：根據(jù)所述的配合飼料以及飼料原料的非淀 粉多糖組分，按照主成分分析結(jié)果，稱取目標(biāo)配合飼料，并在所述的飼料中添加3~7非淀 粉多糖酶，每種非淀粉多糖酶的添加劑量設(shè)置〇~900yg/g系列濃度梯度，制備出一系列 添加了不同濃度非淀粉多糖酶的豬飼料；
[0008] (3)胃腸道模擬消化：將所述的加酶飼料樣品置于三角瓶中，加入pH2. 0,摩爾質(zhì) 量比85 :6~90 :8的氯化鈉：氯化鉀的混合緩沖溶液；同時(shí)加入800~1400U/mL胃蛋白酶 液；其中飼料、緩沖液和胃蛋白酶液按照2 :10 :1~4 :12 :1重量百分比混合均勻；將所述 的混合均勻的飼料、緩沖液和胃蛋白酶液的三角瓶置于恒溫水浴搖床中，設(shè)定恒溫水浴搖 床溫度和搖床轉(zhuǎn)速，消化時(shí)間2~6h;待所述的模擬胃消化結(jié)束后，在所述的三角瓶中加入 pH6. 2~6.5摩爾質(zhì)量比為97 :14 :160~108 :16 :180的氯化鈉：氯化鉀：磷酸鹽的混合 緩沖溶液；同時(shí)加入單位酶活力比57 :7 :186 :2~76 :10 :264 :4 =胰蛋白酶：糜蛋白酶：淀 粉酶：脂肪酶的混合酶液；其中緩沖液和消化酶液的重量百分比范圍是60 :1~65 :1 ;繼續(xù) 設(shè)定恒溫水浴搖床溫度和搖床轉(zhuǎn)速，消化時(shí)間20~24h;
[0009] (4)非淀粉多糖酶譜的優(yōu)化：待模擬消化結(jié)束后，將消化殘?jiān)娓芍梁阒?，測(cè)定殘 渣體外消化能值，計(jì)算出添加每種非淀粉多糖酶的飼料體外消化能值，并根據(jù)非淀粉多糖 酶和體外消化能值的回歸關(guān)系，得出每種非淀粉多糖酶能提高目標(biāo)的飼料體外消化能值的 臨界點(diǎn)；將每種非淀粉多糖酶依據(jù)所述臨界點(diǎn)進(jìn)行編碼時(shí)，根據(jù)添加的多種非淀粉多糖酶 的種類，設(shè)置對(duì)應(yīng)數(shù)量的影響因子，每個(gè)影響因子設(shè)置5個(gè)水平，采用回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè) 計(jì)分析體外消化能值，并利用體外消化能值與非淀粉多糖酶添加劑量關(guān)系，表征出最優(yōu)的 非淀粉多糖酶譜；
[0010] 作為一個(gè)優(yōu)選的方式，所述步驟（1)中稱取豬飼料樣品量為100~250毫克；
[0011] 作為一個(gè)優(yōu)選的方式，所述步驟（2)中稱取豬飼料樣品量為1~2克；
[0012] 作為一個(gè)優(yōu)選的方式，所述步驟（3)中恒溫水浴搖床的轉(zhuǎn)速160~190rpm，溫度 37 ~4(TC;
[0013] 作為一個(gè)優(yōu)選的方式，所述步驟（4)中所述5個(gè)水平設(shè)置為-2.378、_1、0、1和 2. 378〇
[0014] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0015] (1)本發(fā)明以大量動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為依據(jù)，選取的體外模擬參數(shù)更加貼近動(dòng)物 的實(shí)際生理狀況，具有較好的模擬飼料在體內(nèi)消化過(guò)程的效果；
[0016] (2)本發(fā)明克服了以往篩選非淀粉多糖酶的盲目性，提高飼用酶制劑的功效，使用 快捷的體外手段模擬飼料在胃腸道的消化過(guò)程，并提出體外消化能值表征最優(yōu)酶譜，達(dá)到 了快速優(yōu)化非淀粉多糖酶譜的目的。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 本發(fā)明采用非淀粉多糖酶組分分析技術(shù)和體外模擬消化法，使用飼料體外能值表 征非淀粉多糖酶的作用效果，快速獲取飼料中添加的最優(yōu)非淀粉多糖酶譜。
[0019] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例詳細(xì)介紹本發(fā)明。但以下的實(shí)施例僅限于解釋本發(fā) 明，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)包括權(quán)利要求的全部?jī)?nèi)容，不僅僅限于本實(shí)施例。
[0020] 實(shí)施例1，
[0021] 如圖1所示，本發(fā)明具體實(shí)現(xiàn)方法可以如下方式實(shí)施：
[0022] 選取玉米-豆柏型配合飼料放入粉碎機(jī)中，其中所述的飼料包括玉米-豆柏型配 合飼料和組成配合飼料的玉米和豆柏原料；再將所述的粉碎機(jī)的轉(zhuǎn)速控制在8000~10000 轉(zhuǎn)/分鐘，粉碎時(shí)間為5~10分鐘；將粉碎后的飼料過(guò)0. 25~0. 42毫米篩；精確稱取 100~250毫克飼料樣品，測(cè)定配合飼料以及飼料原料的非淀粉多糖組分的含量；
[0023] 根據(jù)所述的配合飼料以及飼料原料的非淀粉多糖組分，按照主成分分析結(jié)果，稱 取玉米一一豆柏配合飼料1~2克，并在飼料中分別添加三種非淀粉多糖酶，即木聚糖酶、 纖維素酶、P_葡聚糖酶，每種非淀粉多糖酶添加劑量的濃度梯度水平分別設(shè)為〇、1〇〇、 200、300、400、500、600、700、800、900 1^/^，制備出一系列添加了不同濃度非淀粉多糖酶的 玉米一一豆柏配合飼料；
[0024] 將所述的加酶飼料樣品置于三角瓶中，加入摩爾質(zhì)量比85 :6~90 :8的氯化鈉： 氯化鉀的混合緩沖溶液（pH2. 0);同時(shí)加入800~1400U/mL胃蛋白酶液；其中飼料、緩沖 液和胃蛋白酶液按照2 :10 :1~4 :12 :1重量比混合均勻；將所述的混合均勻的飼料、緩沖 液和胃蛋白酶液的三角瓶置于恒溫水浴搖床中，設(shè)定搖床的轉(zhuǎn)速160~190rpm，溫度37~ 40°C，消化時(shí)間2~6h;待所述的模擬胃消化結(jié)束后，在所述的三角瓶中加入摩爾質(zhì)量比為 97 :14 :160~108 :16 :180的氯化鈉：氯化鉀：磷酸鹽的混合緩沖溶液（pH6. 2~6. 5);同 時(shí)加入單位酶活力比57 :7 :186 :2~76 :10 :264 :4 =胰蛋白酶：糜蛋白酶：淀粉酶：脂肪酶 的混合酶液；其中緩沖液和消化酶液的重量百分比范圍是60 :1~65 :1 ;繼續(xù)設(shè)定恒溫水 浴搖床溫度37~40°C，搖床轉(zhuǎn)速160~190rpm，消化時(shí)間20~24h;
[0025] 將消化殘?jiān)娓芍梁阒?，并測(cè)定殘?jiān)苤担?jì)算在不同濃度的每種非淀粉多糖酶 作用下日糧的體外消化能值；并根據(jù)非淀粉多糖酶和體外消化能值的回歸關(guān)系，得出木聚 糖酶、纖維素酶和P_葡聚糖酶能提高目標(biāo)日糧體外消化能值的臨界點(diǎn)分別為600, 700， 600yg/g。三種非淀粉多糖酶設(shè)為3個(gè)影響因子，每個(gè)因子設(shè)置5個(gè)水平，將每種非淀粉多 糖酶的臨界添加量編碼為〇,采用三元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，具體的設(shè)計(jì)因素及水平 見(jiàn)表1，建立體外消化能值與三種非淀粉多糖酶添加量的三元二次回歸方程，其方程為：玉 米-豆柏日糧的體外消化能值：
[0026] =a0+alxl+a2x2+a3x3+al2xlx2+al3xlx3+a23x2x3+allxl2+a22x22+a33x32 (a，回 歸方程系數(shù)；xl，木聚糖酶；x2,纖維素酶；x3,P-葡聚糖酶）。使用偏導(dǎo)數(shù)法求解回歸方程 中的非淀粉多糖酶譜組合以及各個(gè)非淀粉多糖酶添加劑量。
[0027]表 1 [0028]

[0029] 實(shí)施例2，
[0030] 選取小麥-豆柏型配合飼料放入微型粉碎機(jī)中，其中所述的飼料包括小麥-豆 柏型配合飼料和組成配合飼料的小麥和豆柏原料；再將所述的微型粉碎機(jī)的轉(zhuǎn)速控制在 8000~10000轉(zhuǎn)/分鐘，粉碎時(shí)間為5~10分鐘；將粉碎后的飼料過(guò)0. 25~0. 42毫米 篩；精確稱取100~250毫克飼料樣品，測(cè)定配合飼料以及飼料原料的非淀粉多糖組分的含 量；
[0031] 根據(jù)所述的配合飼料以及飼料原料的非淀粉多糖組分，按照主成分分析結(jié)果，稱 取小麥一一豆柏配合飼料1~2克，并在飼料中分別添加四種非淀粉多糖酶，即木聚糖酶、 纖維素酶、P_葡聚糖酶、果膠酶，每種非淀粉多糖酶添加劑量的濃度梯度水平分別設(shè)為〇、 100、200、300、