一種豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的制備方法及其用途，屬于生物材料 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近幾十年來我國女性乳腺癌發(fā)病率持續(xù)飄升，目前已成為我國婦女第一大惡性腫 瘤，同時(shí)由于皮膚軟組織腫瘤、外傷、先天崎形、深度燒傷后及慢性潰瘍等疾病也會(huì)造成不 同程度軟組織缺損，直接影響患者的外形美觀乃至功能，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成直接的影 響；加之人體形體的美學(xué)再塑需求旺盛；根據(jù)美國整形外科醫(yī)師協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2012年美國共 進(jìn)行28. 6萬次隆乳術(shù)，在全美整形術(shù)中排名第一；而軟組織填充W 200萬次在微整形術(shù)中 排名第二?？梢娎硐氲能浗M織缺損修復(fù)材料市場需求巨大。根據(jù)BCC2012年1月發(fā)布的報(bào)告 顯示，全球?qū)M織工程和再生醫(yī)學(xué)相關(guān)醫(yī)用產(chǎn)品的市場在2011年達(dá)到598億美元，2016年 預(yù)計(jì)能達(dá)到897億美元，復(fù)合年增長率（Compounded annual growth rate, CAGR)為8. 4%。 而BCC發(fā)布的報(bào)告稱2011年全球?qū)φ蜗嚓P(guān)材料的市場在240萬公噸，而2016年預(yù)計(jì)將 達(dá)到460萬公噸，復(fù)合年增長率為13. 8%。
[0003] 脂肪組織是軟組織缺損修復(fù)重建，特別是女性乳房修復(fù)重建理想的填充物，但我 國組織工程產(chǎn)業(yè)化總體正處于臨床前研究階段，研究產(chǎn)品多集中于骨、軟骨、皮膚、角膜等， 脂肪等軟組織領(lǐng)域研究相對(duì)滯后，但是需求持續(xù)增長，因此具有廣闊的發(fā)展空間和市場需 求。
[0004] 然而，因脂肪組織上具有多種免疫原性物質(zhì)，直接用于機(jī)體會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反 應(yīng)，副作用強(qiáng)，需要采用脫細(xì)胞方法脫去其免疫原性物質(zhì)。
[0005] 脫細(xì)胞的方法包括物理法、化學(xué)法、酶法，化學(xué)法包括酸堿處理、非離子去垢劑處 理、離子去垢劑處理、兩性離子去垢劑助理、=磯酸鹽處理、低滲和高滲液處理、馨合劑處 理。其中，物理法和化學(xué)法中的非離子去垢劑吹了、低滲和高滲液處理較為溫和，對(duì)細(xì)胞外 基質(zhì)的影響較小，但是脫細(xì)胞不徹底；化學(xué)法中離子去垢劑可W有效脫細(xì)胞，但是對(duì)細(xì)胞外 基質(zhì)有影響；而酶法處理可W有效脫細(xì)胞，且對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的影響較小，但是存在價(jià)格昂 貴，成本高，難W工業(yè)應(yīng)用的缺陷。
[0006] 由于脂肪組織的特殊性，目前報(bào)道的脂肪脫細(xì)胞方法均采用了膜酶、DNA酶來處 理，可W有效脫細(xì)胞和維持細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但是酶的價(jià)格昂貴，導(dǎo)致生產(chǎn)成本太高，難 W大工業(yè)應(yīng)用，同時(shí)，整個(gè)處理時(shí)間過長，通常需要處理5天或更長時(shí)間。
[0007] 急需一種成本低廉、處理時(shí)間短的脫細(xì)胞方法，制備脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)制備方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的制備豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的方 法。
[0009] 本發(fā)明制備豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的方法，包括如下步驟：
[0010] (1)取新鮮豬皮下脂肪，清洗，剪碎，加水或者生理鹽水，勻漿，離屯、，得沉淀，PBS 溶液或水漂洗；
[0011] (2)將沉淀粉碎，用SDS溶液漂洗，再用PBS溶液或水漂洗，離屯、，得沉淀；
[001引 做將沉淀用異丙醇溶液漂洗，再用PBS溶液或水漂洗，即可。
[0013] 漂洗；是指用水或者溶液反復(fù)洗漆。
[0014] 步驟（1)中，剪碎至大小為（0. 5 ?1. 5) cmX (0. 5 ?1. 5) cmX (0. 5 ?1. 5) cm。
[0015] 優(yōu)選地，剪碎至大小為IcmXlcmXlcm。
[0016] 步驟（1)中，勻漿前，所述水或生理鹽水的用量為皮下脂肪體積的0.5?2倍。優(yōu) 選地，所述水或生理鹽水的用量為皮下脂肪體積的1倍。
[0017] 步驟（1)中，所述勻漿的轉(zhuǎn)速為10000?15000巧m，時(shí)間為3?7min。優(yōu)選地，所 述勻漿的轉(zhuǎn)速為120(K)巧m，時(shí)間為5min。
[001引步驟（1)中，所述離屯、的轉(zhuǎn)速為3000?4000巧m，時(shí)間為3?7min。優(yōu)選地，所述 離屯、的轉(zhuǎn)速為3500巧m，時(shí)間為5min。
[0019] 步驟（2)中，所述粉碎是球磨粉碎，球磨的轉(zhuǎn)速為2000?3000r/s，時(shí)間為3? 7min。優(yōu)選地，所述球磨的轉(zhuǎn)速為2500/s，時(shí)間為5min。
[0020] 步驟（2)中，所述SDS溶液的濃度為0. 25 %?1 %。
[0021] 優(yōu)選地，所述SDS溶液的濃度為0. 5 %。
[002引步驟（2)中，所述SDS溶液漂洗的時(shí)間為2?化。
[0023] 優(yōu)選地，所述SDS溶液漂洗的時(shí)間為祉。
[0024] 步驟（3)中，所述異丙醇溶液的濃度為80?100 %。
[0025] 優(yōu)選地，所述異丙醇溶液的濃度為100%。
[0026] 步驟（3)中，所述異丙醇溶液的漂洗時(shí)間為1?化。
[0027] 優(yōu)選地，所述異丙醇溶液的漂洗時(shí)間為化。
[002引本發(fā)明還提供了前述任意一項(xiàng)方法制備得到的豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料。
[0029] 本發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明采用SDS溶液、異丙醇溶液，在特定工藝條件下， 結(jié)合特定的前處理步驟，在有效脫細(xì)胞的同時(shí)，可W有效維持基質(zhì)材料的=維結(jié)構(gòu)和多孔 結(jié)構(gòu)，孔徑平均大小為61. 16um，可用于體內(nèi)修復(fù)，取得了意料不到的技術(shù)效果。
[0030] 本發(fā)明方法制備的豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料脫細(xì)胞徹底，S維結(jié)構(gòu)良好，同時(shí)， 本發(fā)明使用的試劑便宜，整個(gè)工藝時(shí)間僅僅1化左右，生產(chǎn)成本低廉，工業(yè)應(yīng)用前景良好。
[0031] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0032] W下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0033] 圖1脫細(xì)胞鑒定。a肥染色：豬脂肪組織（100幻；b;DAPI染色；豬脂肪組織 (100幻；C;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料（100幻；d本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材 料（200幻；
[0034] 圖2脫脂程度鑒定。a ;豬脂肪組織（100幻；b ;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料 (100 幻；
[003引圖3掃描電鏡。a ;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料；b ;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì) 胞基質(zhì)材料；C ;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料膠原纖維完整，無斷裂。
[0036] 圖4天狼星紅染色。a ;天狼星紅染色100X ;b天狼星紅染色200X ;
[0037] 圖5實(shí)驗(yàn)方法。a ;術(shù)前備皮；b ;示皮下筋膜腔；C ;水化完全的本發(fā)明豬脂肪組織 無細(xì)胞基質(zhì)材料；d ;縫合皮膚；
[003引圖6本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的體內(nèi)降解。a ;皮下植入3天；b ;皮下植 入1周；C ;皮下植入2周；d ;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料皮下植入4周；e ;各觀察時(shí) 間點(diǎn)本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料橫徑變化；
[0039] 圖7免疫組織化學(xué)染色。a ;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料植入3天，材料周 邊（200幻；b:本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料植入3天，材料中央（200幻；C:本發(fā)明豬 脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料植入1周，材料周邊（200幻；d:本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材 料植入1周，材料中央（200幻；e:本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料植入2周，材料周邊 (200幻；f:本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料植入2周，材料內(nèi)部（200幻；g:4周，材料內(nèi) 部（200幻；h;4周，材料內(nèi)部（200幻；
[0040] 圖8CD68陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察；
[0041] 圖9組織標(biāo)本制作方法流程圖；
[0042] 圖10切片脫蠟和水化過程流程圖；
[00創(chuàng)圖11肥染色流程圖；
[0044] 圖12DAPI染色流程圖；
[0045] 圖13新鮮脫細(xì)胞基質(zhì)冰凍切片的制備流程圖；
[0046] 圖14天狼星紅染色流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 實(shí)施例1本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的制備方法
[0048] 1、制備方法
[0049] (1)取新鮮皮下脂肪，使用生理鹽水漂洗，去除脂肪表面血跡及其他雜質(zhì)；
[0050] 似將脂肪組織剪碎至1cm X 1cm X 1cm大小，脂肪組織與生理鹽水按體積比1:1進(jìn) 行勻漿（12000巧m，5min)。將勻漿后獲得的溶液W 3500巧m，5min進(jìn)行離屯、，棄掉上層油脂； [0化1] (3)將離屯、獲得的下層材料使用PBS溶液漂洗后球磨儀打粉（250化/s，5min);
[0化2] (4)室溫下使用0. 5 % SDS溶液漂洗粉末狀材料化，大量PBS溶液漂洗至無泡沫， 離屯、（3500巧m，5min);
[0化3] 巧）100%異丙醇溶液漂洗粉末狀材料化脫脂，大量PBS溶液漂洗，直至材料無異 味，即可。
[0化4] 制備粉末狀材料后，可將粉末放入不同的模具中，凍干制成不同形狀的豬脂肪組 織源性無細(xì)胞基質(zhì)材料，包裝后環(huán)氧己燒消毒。
[0055] 實(shí)施例2本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的制備方法
[0056] 1、制備方法
[0057] (1)取新鮮皮下脂肪，使用水漂洗，去除脂肪表面血跡及其他雜質(zhì)；
[0化引 （2)將脂肪組織剪碎至0. 5cmX0. 5cmX0. 5cm大小，脂肪組織與生理鹽水按體積 比1:0. 5進(jìn)行勻漿（10000;rpm，3min)。將勻漿后獲得的溶液W 3000;rpm，3min進(jìn)行離心棄 掉上層油脂；
[0化9] (3)將離屯、獲得的下層材料使用PBS溶液漂洗后球磨儀打粉（200化/s，3min);
[0060] (4)室溫下使用0. 25 % SDS溶液漂洗粉末狀材料化，大量PBS溶液漂洗至無泡沫， 離屯、；
[0061] (5) 80 %異丙醇溶液漂洗粉末狀材料比脫脂，大量PBS溶液漂洗，直至材料無異 味，即可。
[0062] 制備粉末狀材料后，可將粉末放入不同的模具中，凍干制成不同形狀的豬脂肪組 織源性無細(xì)胞基質(zhì)材料，包裝后環(huán)氧己燒消毒。
[0063] 實(shí)施例3本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的制備方法
[0064] 1、制備方法
[00化](1)取新鮮皮下脂肪，使用水漂洗，去除脂肪表面血跡及其他雜質(zhì)；
[0066] (2)將脂肪組織剪碎至1. 5cmX 1. 5cmX 1. 5cm大小，脂肪組織與生理鹽水按體積 比1:2進(jìn)行勻漿（15000巧m，7min)。將勻漿后獲得的溶液W 4000巧m，7min進(jìn)行離屯、，棄掉 上層油脂；
[0067] (3)將離屯、獲得的下層材料使用PBS溶液漂洗后球磨儀打粉（300化/s，7min);
[0068] (4)室溫下使用1 % SDS溶液漂洗粉末狀材料化，大量PBS溶液漂洗至無泡沫，離 屯、；
[0069] 巧）100%異丙醇溶液漂洗粉末狀材料化脫脂，大量PBS溶液漂洗，直至材料無異 味，即可。
[0070] 制備粉末狀材料后，可將粉末放入不同的模具中，凍干制成不同形狀的豬脂肪組 織源性無細(xì)胞基質(zhì)材料，包裝后環(huán)氧己燒消毒。
[0071] 實(shí)施例4本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的參數(shù)篩選
[0072] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0073] 實(shí)驗(yàn)分組；
[0074] 組 1