一種豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的制備方法及其用途,屬于生物材料 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近幾十年來我國女性乳腺癌發(fā)病率持續(xù)飄升,目前已成為我國婦女第一大惡性腫 瘤,同時(shí)由于皮膚軟組織腫瘤、外傷、先天崎形、深度燒傷后及慢性潰瘍等疾病也會(huì)造成不 同程度軟組織缺損,直接影響患者的外形美觀乃至功能,對(duì)患者的生活質(zhì)量造成直接的影 響;加之人體形體的美學(xué)再塑需求旺盛;根據(jù)美國整形外科醫(yī)師協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì),2012年美國共 進(jìn)行28. 6萬次隆乳術(shù),在全美整形術(shù)中排名第一;而軟組織填充W 200萬次在微整形術(shù)中 排名第二??梢娎硐氲能浗M織缺損修復(fù)材料市場需求巨大。根據(jù)BCC2012年1月發(fā)布的報(bào)告 顯示,全球?qū)M織工程和再生醫(yī)學(xué)相關(guān)醫(yī)用產(chǎn)品的市場在2011年達(dá)到598億美元,2016年 預(yù)計(jì)能達(dá)到897億美元,復(fù)合年增長率(Compounded annual growth rate, CAGR)為8. 4%。 而BCC發(fā)布的報(bào)告稱2011年全球?qū)φ蜗嚓P(guān)材料的市場在240萬公噸,而2016年預(yù)計(jì)將 達(dá)到460萬公噸,復(fù)合年增長率為13. 8%。
[0003] 脂肪組織是軟組織缺損修復(fù)重建,特別是女性乳房修復(fù)重建理想的填充物,但我 國組織工程產(chǎn)業(yè)化總體正處于臨床前研究階段,研究產(chǎn)品多集中于骨、軟骨、皮膚、角膜等, 脂肪等軟組織領(lǐng)域研究相對(duì)滯后,但是需求持續(xù)增長,因此具有廣闊的發(fā)展空間和市場需 求。
[0004] 然而,因脂肪組織上具有多種免疫原性物質(zhì),直接用于機(jī)體會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反 應(yīng),副作用強(qiáng),需要采用脫細(xì)胞方法脫去其免疫原性物質(zhì)。
[0005] 脫細(xì)胞的方法包括物理法、化學(xué)法、酶法,化學(xué)法包括酸堿處理、非離子去垢劑處 理、離子去垢劑處理、兩性離子去垢劑助理、=磯酸鹽處理、低滲和高滲液處理、馨合劑處 理。其中,物理法和化學(xué)法中的非離子去垢劑吹了、低滲和高滲液處理較為溫和,對(duì)細(xì)胞外 基質(zhì)的影響較小,但是脫細(xì)胞不徹底;化學(xué)法中離子去垢劑可W有效脫細(xì)胞,但是對(duì)細(xì)胞外 基質(zhì)有影響;而酶法處理可W有效脫細(xì)胞,且對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的影響較小,但是存在價(jià)格昂 貴,成本高,難W工業(yè)應(yīng)用的缺陷。
[0006] 由于脂肪組織的特殊性,目前報(bào)道的脂肪脫細(xì)胞方法均采用了膜酶、DNA酶來處 理,可W有效脫細(xì)胞和維持細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu),但是酶的價(jià)格昂貴,導(dǎo)致生產(chǎn)成本太高,難 W大工業(yè)應(yīng)用,同時(shí),整個(gè)處理時(shí)間過長,通常需要處理5天或更長時(shí)間。
[0007] 急需一種成本低廉、處理時(shí)間短的脫細(xì)胞方法,制備脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)制備方 法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[000引為了解決上述問題,本發(fā)明提供了一種新的制備豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的方 法。
[0009] 本發(fā)明制備豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的方法,包括如下步驟:
[0010] (1)取新鮮豬皮下脂肪,清洗,剪碎,加水或者生理鹽水,勻漿,離屯、,得沉淀,PBS 溶液或水漂洗;
[0011] (2)將沉淀粉碎,用SDS溶液漂洗,再用PBS溶液或水漂洗,離屯、,得沉淀;
[001引 做將沉淀用異丙醇溶液漂洗,再用PBS溶液或水漂洗,即可。
[0013] 漂洗;是指用水或者溶液反復(fù)洗漆。
[0014] 步驟(1)中,剪碎至大小為(0. 5 ?1. 5) cmX (0. 5 ?1. 5) cmX (0. 5 ?1. 5) cm。
[0015] 優(yōu)選地,剪碎至大小為IcmXlcmXlcm。
[0016] 步驟(1)中,勻漿前,所述水或生理鹽水的用量為皮下脂肪體積的0.5?2倍。優(yōu) 選地,所述水或生理鹽水的用量為皮下脂肪體積的1倍。
[0017] 步驟(1)中,所述勻漿的轉(zhuǎn)速為10000?15000巧m,時(shí)間為3?7min。優(yōu)選地,所 述勻漿的轉(zhuǎn)速為120(K)巧m,時(shí)間為5min。
[001引步驟(1)中,所述離屯、的轉(zhuǎn)速為3000?4000巧m,時(shí)間為3?7min。優(yōu)選地,所述 離屯、的轉(zhuǎn)速為3500巧m,時(shí)間為5min。
[0019] 步驟(2)中,所述粉碎是球磨粉碎,球磨的轉(zhuǎn)速為2000?3000r/s,時(shí)間為3? 7min。優(yōu)選地,所述球磨的轉(zhuǎn)速為2500/s,時(shí)間為5min。
[0020] 步驟(2)中,所述SDS溶液的濃度為0. 25 %?1 %。
[0021] 優(yōu)選地,所述SDS溶液的濃度為0. 5 %。
[002引步驟(2)中,所述SDS溶液漂洗的時(shí)間為2?化。
[0023] 優(yōu)選地,所述SDS溶液漂洗的時(shí)間為祉。
[0024] 步驟(3)中,所述異丙醇溶液的濃度為80?100 %。
[0025] 優(yōu)選地,所述異丙醇溶液的濃度為100%。
[0026] 步驟(3)中,所述異丙醇溶液的漂洗時(shí)間為1?化。
[0027] 優(yōu)選地,所述異丙醇溶液的漂洗時(shí)間為化。
[002引本發(fā)明還提供了前述任意一項(xiàng)方法制備得到的豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料。
[0029] 本發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn),本發(fā)明采用SDS溶液、異丙醇溶液,在特定工藝條件下, 結(jié)合特定的前處理步驟,在有效脫細(xì)胞的同時(shí),可W有效維持基質(zhì)材料的=維結(jié)構(gòu)和多孔 結(jié)構(gòu),孔徑平均大小為61. 16um,可用于體內(nèi)修復(fù),取得了意料不到的技術(shù)效果。
[0030] 本發(fā)明方法制備的豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料脫細(xì)胞徹底,S維結(jié)構(gòu)良好,同時(shí), 本發(fā)明使用的試劑便宜,整個(gè)工藝時(shí)間僅僅1化左右,生產(chǎn)成本低廉,工業(yè)應(yīng)用前景良好。
[0031] 顯然,根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容,按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段,在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下,還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0032] W下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】,對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0033] 圖1脫細(xì)胞鑒定。a肥染色:豬脂肪組織(100幻;b;DAPI染色;豬脂肪組織 (100幻;C;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料(100幻;d本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材 料(200幻;
[0034] 圖2脫脂程度鑒定。a ;豬脂肪組織(100幻;b ;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料 (100 幻;
[003引圖3掃描電鏡。a ;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料;b ;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì) 胞基質(zhì)材料;C ;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料膠原纖維完整,無斷裂。
[0036] 圖4天狼星紅染色。a ;天狼星紅染色100X ;b天狼星紅染色200X ;
[0037] 圖5實(shí)驗(yàn)方法。a ;術(shù)前備皮;b ;示皮下筋膜腔;C ;水化完全的本發(fā)明豬脂肪組織 無細(xì)胞基質(zhì)材料;d ;縫合皮膚;
[003引圖6本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的體內(nèi)降解。a ;皮下植入3天;b ;皮下植 入1周;C ;皮下植入2周;d ;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料皮下植入4周;e ;各觀察時(shí) 間點(diǎn)本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料橫徑變化;
[0039] 圖7免疫組織化學(xué)染色。a ;本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料植入3天,材料周 邊(200幻;b:本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料植入3天,材料中央(200幻;C:本發(fā)明豬 脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料植入1周,材料周邊(200幻;d:本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材 料植入1周,材料中央(200幻;e:本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料植入2周,材料周邊 (200幻;f:本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料植入2周,材料內(nèi)部(200幻;g:4周,材料內(nèi) 部(200幻;h;4周,材料內(nèi)部(200幻;
[0040] 圖8CD68陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察;
[0041] 圖9組織標(biāo)本制作方法流程圖;
[0042] 圖10切片脫蠟和水化過程流程圖;
[00創(chuàng)圖11肥染色流程圖;
[0044] 圖12DAPI染色流程圖;
[0045] 圖13新鮮脫細(xì)胞基質(zhì)冰凍切片的制備流程圖;
[0046] 圖14天狼星紅染色流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 實(shí)施例1本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的制備方法
[0048] 1、制備方法
[0049] (1)取新鮮皮下脂肪,使用生理鹽水漂洗,去除脂肪表面血跡及其他雜質(zhì);
[0050] 似將脂肪組織剪碎至1cm X 1cm X 1cm大小,脂肪組織與生理鹽水按體積比1:1進(jìn) 行勻漿(12000巧m,5min)。將勻漿后獲得的溶液W 3500巧m,5min進(jìn)行離屯、,棄掉上層油脂; [0化1] (3)將離屯、獲得的下層材料使用PBS溶液漂洗后球磨儀打粉(250化/s,5min);
[0化2] (4)室溫下使用0. 5 % SDS溶液漂洗粉末狀材料化,大量PBS溶液漂洗至無泡沫, 離屯、(3500巧m,5min);
[0化3] 巧)100%異丙醇溶液漂洗粉末狀材料化脫脂,大量PBS溶液漂洗,直至材料無異 味,即可。
[0化4] 制備粉末狀材料后,可將粉末放入不同的模具中,凍干制成不同形狀的豬脂肪組 織源性無細(xì)胞基質(zhì)材料,包裝后環(huán)氧己燒消毒。
[0055] 實(shí)施例2本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的制備方法
[0056] 1、制備方法
[0057] (1)取新鮮皮下脂肪,使用水漂洗,去除脂肪表面血跡及其他雜質(zhì);
[0化引 (2)將脂肪組織剪碎至0. 5cmX0. 5cmX0. 5cm大小,脂肪組織與生理鹽水按體積 比1:0. 5進(jìn)行勻漿(10000;rpm,3min)。將勻漿后獲得的溶液W 3000;rpm,3min進(jìn)行離心棄 掉上層油脂;
[0化9] (3)將離屯、獲得的下層材料使用PBS溶液漂洗后球磨儀打粉(200化/s,3min);
[0060] (4)室溫下使用0. 25 % SDS溶液漂洗粉末狀材料化,大量PBS溶液漂洗至無泡沫, 離屯、;
[0061] (5) 80 %異丙醇溶液漂洗粉末狀材料比脫脂,大量PBS溶液漂洗,直至材料無異 味,即可。
[0062] 制備粉末狀材料后,可將粉末放入不同的模具中,凍干制成不同形狀的豬脂肪組 織源性無細(xì)胞基質(zhì)材料,包裝后環(huán)氧己燒消毒。
[0063] 實(shí)施例3本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的制備方法
[0064] 1、制備方法
[00化](1)取新鮮皮下脂肪,使用水漂洗,去除脂肪表面血跡及其他雜質(zhì);
[0066] (2)將脂肪組織剪碎至1. 5cmX 1. 5cmX 1. 5cm大小,脂肪組織與生理鹽水按體積 比1:2進(jìn)行勻漿(15000巧m,7min)。將勻漿后獲得的溶液W 4000巧m,7min進(jìn)行離屯、,棄掉 上層油脂;
[0067] (3)將離屯、獲得的下層材料使用PBS溶液漂洗后球磨儀打粉(300化/s,7min);
[0068] (4)室溫下使用1 % SDS溶液漂洗粉末狀材料化,大量PBS溶液漂洗至無泡沫,離 屯、;
[0069] 巧)100%異丙醇溶液漂洗粉末狀材料化脫脂,大量PBS溶液漂洗,直至材料無異 味,即可。
[0070] 制備粉末狀材料后,可將粉末放入不同的模具中,凍干制成不同形狀的豬脂肪組 織源性無細(xì)胞基質(zhì)材料,包裝后環(huán)氧己燒消毒。
[0071] 實(shí)施例4本發(fā)明豬脂肪組織無細(xì)胞基質(zhì)材料的參數(shù)篩選
[0072] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0073] 實(shí)驗(yàn)分組;
[0074] 組 1