一種豬源成分摻假的快速試紙檢測(cè)方法
【專利摘要】一種豬源成分摻假的快速試紙檢測(cè)方法，屬于生物化工【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明包括如下步驟：（1）結(jié)合豬源性成分特異性核酸序列DNA的金納米粒子探針的制備，（2）檢測(cè)試紙的制備，（3）疑似豬源性成分特異性核酸序列DNA’’的提取及處理方法，（4）豬源成分摻假的快速試紙檢測(cè)。本發(fā)明利用金納米粒子堆積會(huì)發(fā)生顯色的光學(xué)性質(zhì)，結(jié)合特異性的豬源性核酸序列，建立了特異性豬源DNA序列的探針檢測(cè)體系，根據(jù)試紙條的層析顯色結(jié)果實(shí)現(xiàn)了豬源性成分的快速鑒別，當(dāng)樣品中含有10%及以上的豬源性成分即可被檢測(cè)出來(lái)，填補(bǔ)了現(xiàn)有的豬源性成分的快速鑒別技術(shù)空白，使得現(xiàn)場(chǎng)快速鑒別肉類摻假成為可能。
【專利說(shuō)明】一種豬源成分摻假的快速試紙檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種豬源成分摻假的快速試紙檢測(cè)方法，屬于生物化工【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]在利益的驅(qū)動(dòng)下，使用豬肉冒充牛肉的摻假事件層出不窮，針對(duì)肉類的造假和摻假，目前鑒別肉類摻假的檢測(cè)方法一般基于PCR技術(shù)，而常規(guī)的PCR檢測(cè)需要擴(kuò)增、電泳及酶切確證三步技術(shù)，從檢樣到報(bào)告結(jié)果，至少需要5個(gè)小時(shí)，缺少現(xiàn)場(chǎng)快速篩選的檢測(cè)手段，使得錯(cuò)檢、漏檢等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，極大地?fù)p害了國(guó)家利益和消費(fèi)者利益。因此，發(fā)明一種新型肉類成分快速鑒別方法，是當(dāng)前的迫切需要。
[0003]本發(fā)明利用特異性的豬源性核酸序列結(jié)合金納米粒子，并利用金納米粒子堆積顯色的特性，采用試紙法實(shí)現(xiàn)了豬源性成分的快速鑒別，當(dāng)樣品中含有10%及以上的豬源性成分即可被檢測(cè)出來(lái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的:提供一種豬源性成分摻假的快速試紙鑒別方法，使得現(xiàn)場(chǎng)快速鑒別成為可能。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種豬源成分摻假的快速試紙檢測(cè)方法，步驟為:
豬源性成分特異性核酸序列的選擇:
根據(jù)Genebank公布的豬線粒體基因的保守序列(GenBank:AF039170.1),選擇了5’-SH-CAA CTA GAT ACA TCT ACA TGA TTC ATT AC-3’這一能代表豬種屬的特異性序列片段DNA，其中CAA端修飾了巰基。片段長(zhǎng)度為29bp，約10nm，該核酸序列DNA及其生物素修飾的互補(bǔ)片段(DNA’)委托生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0006](I)結(jié)合豬源性成分特異性核酸序列DNA的金納米粒子探針的制備:
采用表面帶負(fù)電的金納米粒子，粒徑為5?30nm,濃度為3nmol/L,金納米粒子的合成方法為檸檬酸三鈉還原法，合成及處理步驟如下:量取IOOmL 0.lg/L的HAuCl4溶液加至三角燒瓶，攪拌加熱至沸騰，5 min后快速加入f 5mL 10g/L的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱30min，冷卻后，裝入分子量12000道爾頓的透析袋，用超純水透析2天，期間換水3次。取ImL金納米粒子溶液至1.5mL EP管，即為3nmol/L濃度的金納米粒子溶液，加入A26tl=0.27即濃度為10 μ g/mL的豬肉特異性核酸序列DNA探針10?50 μ L，振蕩混勻，將EP管置于水浴中溫育，時(shí)間為3?24h，水浴溫度為25飛(TC，此時(shí)核酸片段的巰基通過(guò)金硫鍵作用特異性的吸附在金納米粒子表面。
[0007](2)檢測(cè)試紙的制備:將DNA的互補(bǔ)片段DNA’修飾生物素，并按l?10nmol/L的濃度，噴在硝酸纖維素膜上，37°C干燥2h，貼在粘性塑料背板上，并在上下兩端分別貼上玻璃纖維膜和吸收濾紙，裁切成3mm寬度，即為檢測(cè)試紙。
[0008](3)樣品中核酸片段的提取和處理
取含有疑似豬肉成分的肉類，剪碎后，準(zhǔn)確稱取0.1g置于1.5mL EP管中，加入ImL組織裂解液(10 mM Tris-HCl (pH 7.5)，100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% SDS 和 0.4 mg/mL proteinase K),蓋上蓋子,將EP管置于沸水中煮，時(shí)間為10?30min,將EP管于5000rpm離心lOmin，吸取上清，上清中加入等體積抽提液(酚:氯仿:異戊醇體積比=25:24:1)，混勻，靜置5min，5000rpm離心lOmin，吸取上層水相上清液，上清液中加入等體積冰無(wú)水乙醇，輕輕搖勻，靜置15min，用吸頭小心吸取析出的DNA’’形成的白色絮狀物，用70%乙醇漂洗2次，加入100 μ L超純水溶解，將提取的DNA’ ’樣品進(jìn)行紫外檢測(cè)，確認(rèn)A26tlA28tl的數(shù)值在1.8?1.9，并用超純水調(diào)節(jié)DNA’ ’濃度，使其Α26(ι=2.7，此時(shí)DNA’ ’濃度約100 μ g/mL。
[0009](4)豬源成分摻假的快速試紙檢測(cè):
吸取提取處理得到的DNA’’樣品l(T50yL，加至I mL的金納米粒子探針體系，37°C溫育，時(shí)間為5?30min，將試紙條的玻璃纖維膜一端插入探針體系，探針溶液在毛細(xì)作用下，開始向試紙條上端流動(dòng)，如果DNA’ ’樣品中不含豬肉DNA，則修飾有特異性豬源成分DNA的金納米粒子會(huì)與硝酸纖維素膜上的互補(bǔ)DNA’進(jìn)行特異性結(jié)合，大量金納米粒子堆積在DNA’上，出現(xiàn)紅色可見條帶；反之DNA’’樣品中含有豬肉DNA時(shí)，則該DNA會(huì)與原先吸附在金納米粒子表面的特異性核酸序列DNA進(jìn)行特異性結(jié)合，金納米粒子探針就不會(huì)再與試紙條上的互補(bǔ)DNA’發(fā)生結(jié)合，此時(shí)硝酸纖維素膜上就不會(huì)出現(xiàn)可見條帶，說(shuō)明檢測(cè)的DNA’’樣品中含有豬肉DNA，且豬肉占的比例至少為10%。
[0010]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明利用特異性的豬源性核酸序列的互補(bǔ)片段，結(jié)合金納米粒子堆積顯色的光學(xué)性質(zhì)，采用試紙條法實(shí)現(xiàn)了豬源性成分的快速鑒別，使得現(xiàn)場(chǎng)快速鑒別肉類摻假成為可能。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1、豬源性DNA成分鑒別原理圖 圖2、實(shí)際摻假樣品鑒別圖
從左至右I?5分別測(cè)定了含有0%，2%，5%，10%，20%豬肉的樣品，從圖可見，當(dāng)樣品中含有10%豬肉時(shí)，試紙條幾乎不顯色，肉眼可以很容易判斷。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下述實(shí)例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0013]下述實(shí)例中所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0014]實(shí)施例1結(jié)合豬源性成分特異核酸序列DNA的金納米粒子探針及試紙條的建立 采用表面帶負(fù)電的IOnm金納米粒子,濃度為3nmol/L,具體合成及處理步驟如下:量取
IOOmL 0.lg/L的HAuCl4溶液加至三角燒瓶，攪拌加熱至沸騰，5 min后快速加入2mL、10g/L的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱30min，冷卻后，裝入分子量12000道爾頓的透析袋，用超純水透析2天,期間換水3次。取ImL金納米粒子溶液至1.5mL EP管，即為3nmol/L濃度的金納米粒子溶液，加入A26tl=0.27即濃度為10 μ g/mL的DNA探針30 μ L，振蕩混勻，將EP管置于37°C水浴中溫育12h，得到金納米粒子探針體系。
[0015]將序列DNA’按3 nmol/L的濃度，噴在硝酸纖維素膜上，37°C干燥2小時(shí)，貼在粘性塑料背板上，并在上下兩端分別貼上玻璃纖維膜和吸收濾紙，裁切成3mm寬度，即為檢測(cè)試紙。[0016]實(shí)施例2樣品中核酸片段的提取和處理
取含有疑似豬肉成分的肉類，剪碎后，準(zhǔn)確稱取0.1g置于1.5mL EP管中，加入ImL組織裂解液(10 mM Tris-HCl (pH 7.5)，100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% SDS, 0.4 mg/mLproteinase K)，蓋上蓋子，將EP管置于沸水中煮20min，將EP管于5000rpm離心lOmin，吸取上清。上清中加入等體積抽提液(酹:氯仿:異戍醇=25:24:1),混勻，靜置5min,5000rpm離心lOmin,吸取上層水相上清液,上清液中加入等體積冰無(wú)水乙醇，輕輕搖勻，靜置15min，用吸頭小心吸取析出的DNA’’形成的白色絮狀物，用70%乙醇漂洗2次，加入100 μ L超純水溶解，將提取的DNA’ ’樣品進(jìn)行紫外檢測(cè)，確認(rèn)A26tZA28tl的數(shù)值在1.8^1.9左右，并用超純水調(diào)節(jié)DNA’ ’濃度，使其Α26(ι=2.7，此時(shí)DNA’ ’濃度約100 μ g/mL。
[0017]實(shí)施例3試紙法檢測(cè)
吸取提取處理得到的DNA’’樣品30 μ L，加至I mL的金納米粒子探針體系，37°C溫育15min，將試紙條的玻璃纖維膜一端插入探針體系，探針溶液在毛細(xì)作用下，開始向試紙條上端流動(dòng)，如果DNA’ ’樣品中不含豬肉DNA，則修飾有特異性豬源成分DNA的金納米粒子會(huì)與硝酸纖維素膜上的互補(bǔ)序列DNA’進(jìn)行特異性結(jié)合，出現(xiàn)紅色可見條帶；反之DNA’ ’樣品中含有豬肉DNA時(shí)，則該DNA會(huì)與原先吸附在金納米粒子表面的特異性核酸序列DNA進(jìn)行特異性結(jié)合，金納米粒子探針就不會(huì)再與試紙條上的互補(bǔ)DNA’發(fā)生結(jié)合，此時(shí)硝酸纖維素膜上就不會(huì)出現(xiàn)可見條帶，說(shuō)明檢測(cè)的DNA’’樣品中含有豬肉DNA，且豬肉占的比例至少為10%。
【權(quán)利要求】
1.一種豬源成分摻假的快速試紙檢測(cè)方法，其特征在于步驟為: (O結(jié)合豬源性成分特異性核酸序列DNA的金納米粒子探針的制備: 采用粒徑為5~30nm,濃度為3nmol/L,表面帶負(fù)電的金納米粒子,用超純水透析,除去合成過(guò)程中過(guò)量的檸檬酸三鈉分子；取I mL金納米粒子溶液至1.5mLEP管，即得到3nmol/L濃度的金納米粒子溶液，加入A26tl=0.27即濃度為10 μ g/mL的豬肉特異性核酸序列DNA探針10-50 μ L，振蕩混勻，將EP管置于水浴中溫育，時(shí)間為3~24h，水浴溫度為25~60°C，此時(shí)核酸片段的巰基通過(guò)金硫鍵作用特異性的吸附在金納米粒子表面；
DNA:5’ -SH-CAA CTA GAT ACA TCT ACA TGA TTC ATT AC-3’ ； (2)檢測(cè)試紙的制備:將DNA的互補(bǔ)片段DNA’修飾生物素，并按10nmol/L的濃度，噴在硝酸纖維素膜上，37°C干燥2h，貼在粘性塑料背板上，并在上下兩端分別貼上玻璃纖維膜和吸收濾紙，裁切成3mm寬度，即為檢測(cè)試紙； (3)樣品中核酸片段的提取和處理 取含有疑似豬肉成分的肉類，剪碎后，準(zhǔn)確稱取0.1g置于1.5mL EP管中，加入ImL組織裂解液，組織裂解液組成為pH 7.5 的 10 mM Tris-HClUOO mM NaClUO mM EDTA、0.5% SDS和0.4 mg/mL proteinase K,蓋上蓋子,將EP管置于沸水中煮，時(shí)間為10~30min,將EP管于5000rpm離心IOmin,吸取上清,上清中加入等體積抽提液,抽提液組成為:酹:氯仿:異戊醇體積比=25:24:1，混勻，靜置5min，5000rpm離心lOmin，吸取上層水相上清液，上清液中加入等體積冰無(wú)水乙醇，輕輕搖勻，靜置15min，用吸頭小心吸取析出的DNA’’形成的白色絮狀物，用70%乙醇漂洗2次，加入IOOyL超純水溶解，將提取的DNA’’樣品進(jìn)行紫外檢測(cè)，確認(rèn)A26tlA28tl的數(shù)值在1.8^1.9，并用超純水調(diào)節(jié)DNA’ ’濃度，使其A26(l=2.7，此時(shí)DNA’ ’濃度為100 μ g/mL ； (4)豬源成分摻假的快速試紙檢測(cè): 吸取提取處理得到的DNA’’樣品10-50μ L，加至I mL的金納米粒子探針體系，37°C溫育，時(shí)間為5~30min，將試紙條的玻璃纖維膜一端插入探針體系，探針溶液在毛細(xì)作用下，開始向試紙條上端流動(dòng)，如果DNA’ ’樣品中不含豬肉DNA，則修飾有特異性豬源成分DNA的金納米粒子會(huì)與硝酸纖維素膜上的互補(bǔ)DNA’進(jìn)行特異性結(jié)合，出現(xiàn)紅色可見條帶；反之DNA’ ’樣品中含有豬肉DNA時(shí)，則該DNA會(huì)與原先吸附在金納米粒子表面的特異性核酸序列DNA進(jìn)行特異性結(jié)合，金納米粒子探針就不會(huì)再與試紙條上的互補(bǔ)DNA’發(fā)生結(jié)合，此時(shí)硝酸纖維素膜上就不會(huì)出現(xiàn)可見條帶，說(shuō)明檢測(cè)的樣品中含有豬肉DNA，且豬肉占的比例至少為10%。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK103487576SQ201310445819
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】王琴, 馮永巍, 田耀旗 申請(qǐng)人:無(wú)錫市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心