本發(fā)明涉及滅活病毒技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種用于滅活重組桿狀病毒的方法。

背景技術(shù)：

重組昆蟲桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)自Smith GE等于1983年利用AcNPV成功表達(dá)人β干擾素以來，在30多年的時間里已有數(shù)千個基因在昆蟲細(xì)胞或幼蟲體內(nèi)得到高效表達(dá)。這些高活性的表達(dá)產(chǎn)物在人、禽的多種傳染病的防治、腫瘤疫苗、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞的增殖與分化、酶學(xué)等方面的研究發(fā)揮了不可替代的作用。因此它已被公認(rèn)為當(dāng)今基因工程四大表達(dá)系統(tǒng)(即桿狀病毒、大腸桿菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))之一。

VLPs(Virus Like Particles)是指含有某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，不含有病毒核酸，不能自主復(fù)制，其在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似，稱為似病毒顆粒。由于重組昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)易于篩選，安全性好，產(chǎn)物成本低，表達(dá)水平高，表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后加工與高等生物相似，可使蛋白產(chǎn)物保持天然結(jié)構(gòu)、生物活性和免疫活性，且易于大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白，因此被認(rèn)為是表達(dá)VLP的最佳表達(dá)系統(tǒng)。似病毒顆粒(VLPs)保留了天然病毒粒子的空間構(gòu)象和誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位，免疫性強(qiáng)。能激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。VLP作為一種新型疫苗，不僅克服了傳統(tǒng)疫苗的不足，也彌補(bǔ)了其他基因工程疫苗的缺憾，是目前最有發(fā)展前景、最安全的預(yù)防兼治療的候選疫苗。

傳統(tǒng)的滅活疫苗制備是先大量生產(chǎn)病原活病毒，然后用化學(xué)試劑殺死(滅活)這些病毒制成抗原，再乳化成疫苗。常用的滅活化學(xué)試劑是甲醛和β-丙內(nèi)酯。大量科學(xué)實驗已經(jīng)表明，這兩種化學(xué)試劑有害于人體健康，是潛在的人類和動物的致癌物質(zhì)。例如，對大鼠的研究表明，甲醛誘導(dǎo)其鼻腔的鱗狀細(xì)胞癌。對小鼠的實驗顯示，β-丙內(nèi)酯能誘導(dǎo)產(chǎn)生鱗狀細(xì)胞癌，淋巴瘤和肝細(xì)胞瘤。

似病毒顆粒(VLPs)疫苗屬基因工程苗，是用重組桿狀病毒作為載體來表達(dá)制備的。盡管重組桿狀病毒不是致病的病原體，但仍然需要在完成了似病毒顆?？乖闹苽浜螅瑢⑵錅缁钐幚?。重組桿狀病毒容易被滅活，目前最常用的方法是用二乙烯亞胺(BEI)來進(jìn)行處理。如拜耳公司用重組桿狀病毒生產(chǎn)的豬瘟病毒疫苗、勃林格殷格翰動物保健公司生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒2型VLP疫苗等均采用BEI滅活VLP上清中殘存的重組桿狀病毒。

二乙烯亞胺(BEI)滅活處理重組桿狀病毒也有其客觀不足之處：

1.二乙烯亞胺(BEI)需要由2-溴乙胺氫溴酸鹽(BEA)經(jīng)NaOH處理環(huán)化后獲得。只有二乙烯亞胺(BEI)具有殺滅重組桿狀病毒的作用。而BEA有一定的毒性，其環(huán)化處理需要在通風(fēng)櫥柜中進(jìn)行，增加了生產(chǎn)工序和成本。

2.二乙烯亞胺(BEI)滅活結(jié)束時，需要加入過濾除菌的硫代硫酸鈉(Na₂S₂O₃)來終止滅活反應(yīng)。因此當(dāng)整個滅活過程結(jié)束后，VLP上清液中有大量的白色沉淀析出，需要去除之，以便杜絕給后續(xù)的疫苗產(chǎn)品帶來潛在問題。

3.二乙烯亞胺(BEI)滅活需時較長，從而相對增加了疫苗制備的時間和成本。

因此，本發(fā)明則是要提供合適的滅活重組桿狀病毒的方法，即工藝簡單，省時省力，又能降低成本的有效滅活方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種滅活重組桿狀病毒的方法，該方法操作簡單易行，省時省力，安全環(huán)保，成本低。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種用于滅活重組桿狀病毒的方法，該方法為使所述重組桿狀病毒接觸氧化劑進(jìn)行滅活。

優(yōu)選地，所述氧化劑為過氧化氫溶液。

優(yōu)選地，所述過氧化氫溶液的濃度為0-20％(w/w)；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述過氧化氫溶液的濃度為0-1％(w/w)；最優(yōu)選的，所述過氧化氫溶液的濃度為0.03-0.3％(w/w)。

優(yōu)選地，所述重組桿狀病毒與氧化劑接觸的時間為0-48h；優(yōu)選地，所述病毒與氧化劑接觸的時間為0-24h，更優(yōu)選地所述病毒與氧化劑接觸的時間為5min、0.5h、3h或18h。

優(yōu)選地，所述重組桿狀病毒與氧化劑接觸的溫度為0-45℃；優(yōu)選地，所述病毒與氧化劑接觸的溫度為27℃、25℃或4℃。

優(yōu)選地，所述重組桿狀病毒為在制備似病毒顆粒疫苗抗原、亞單位蛋白疫苗抗原、疫苗輔助增強(qiáng)物、治療性蛋白復(fù)合劑中所用表達(dá)系統(tǒng)中的重組桿狀病毒及用重組桿狀病毒自身做為疫苗抗原、疫苗輔助增強(qiáng)物、治療性蛋白復(fù)合劑和各種檢測試劑。

優(yōu)選地，使用催化酶或化學(xué)抑制劑終止滅活重組桿狀病毒的反應(yīng)。

優(yōu)選地，所述催化酶為來源于各種動物、植物和微生物的催化酶；所述化學(xué)抑制劑為具有分解過氧化氫功能的催化劑。

優(yōu)選地，所述催化酶為牛肝源催化酶；所述化學(xué)抑制劑為二氧化錳。

優(yōu)選地，所述催化酶終止反應(yīng)的溫度為25-30℃。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明使用過氧化氫(H₂O₂)作為滅活劑，能有效地滅活重組桿狀病毒，操作工藝簡單易行，省時省力，安全環(huán)保，減少成本；與使用甲醛，丙內(nèi)酯，紫外線照射和/或加熱等方法滅活病原體相比較，過氧化氫最大的優(yōu)勢是不會破壞抗原蛋白的表位空間構(gòu)象，因而保證了疫苗抗原的有效性。用過氧化氫滅活VLP上清液中的重組桿狀病毒，不會使上清液產(chǎn)生大量的白色沉淀，保證了后續(xù)VLP疫苗產(chǎn)品的有效制備和使用；且過氧化氫商品價格便宜，低濃度使用很安全，對人畜無害。經(jīng)常應(yīng)用于人們?nèi)粘Ｉ詈歪t(yī)療外科手術(shù)等場合的消毒殺菌。

附圖說明

圖1為禽流感VLP上清樣品滅活后血凝效價比較的示意圖；

圖2為新城疫VLP上清樣品滅活后血凝效價比較的示意圖；

圖3桿狀病毒滴度示意圖；

圖4為過氧化氫滅活法不影響禽流感VLP疫苗的免疫原性的示意圖。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例1

過氧化氫(H₂O₂)滅活VLP上清液中的重組桿狀病毒，不會使上清液產(chǎn)生大量白色沉淀顆粒。

實驗步驟如下：

(1)按表1中的量，將昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液—Sf 900II新鮮培養(yǎng)液、VLP上清樣品一、VLP上清樣品二分別加入到做好標(biāo)記的1.5mL塑料管中，然后向各管中加入醫(yī)用濃度為3％(w/w)的過氧化氫溶液，再加入純凈水至終體積600μL，混勻，放在27℃孵育；

(2)當(dāng)孵育至18h，各管分別加入4μL牛肝源催化酶(Sigma)，混勻，終止滅活；

(3)取混勻好的各樣品100μL，分別加入到一個96孔板的各孔中，做好標(biāo)記，放入讀盤機(jī)，設(shè)OD600nm讀數(shù)。

實驗結(jié)果：

表1所列的OD值顯示，實驗組中，在加了過氧化氫溶液和牛肝源催化酶孵育后，無論是新鮮的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液Sf 900II還是VLP上清樣品一、VLP上清樣品二，與沒加過氧化氫溶液和牛肝源催化酶的空白對照組比較，OD值都沒有差異，說明無沉淀顆粒析出。

表1

實施例2

低濃度(本實施例中的低濃度為0-1％(w/w))的過氧化氫滅活法能保持VLP疫苗抗原蛋白的自然結(jié)構(gòu)。

實驗步驟如下：

(1)按表2所示的量，將禽流感VLP上清樣品，分別加入到做好標(biāo)記的1.5ml塑料管中，然后向各管中加入醫(yī)用濃度為3％(w/w)的過氧化氫溶液，再加入純凈水至終體積600μL，混勻，27℃孵育3h；

(2)另取一批1.5mL塑料管，完全重復(fù)上面的加樣方法，混勻后，27℃孵育18h；

(3)當(dāng)孵育至3h，向步驟(1)的各管中分別加入4μL牛肝源催化酶，混勻，終止滅活；

(4)當(dāng)孵育至18h，向步驟(2)的各管中分別加入4μL牛肝源催化酶，混勻，終止滅活；

(5)用1％(v/v)濃度的雞紅細(xì)胞檢查禽流感VLP抗原的血凝效價(HA血凝滴度測定)的步驟簡述如下：

將96孔微量板橫向放置：垂直方向稱列，如孔A1～H1稱為第一列；平行方向稱行，如A1～A12稱為A行；

取8道加樣器，向第一列的各孔中加入50μL的PBS溶液，最后的H1孔內(nèi)加100μL PBS作為紅細(xì)胞對照；

取100μL常用微量加樣器，向第一列除H1孔外的各孔中分別加入50μL滅活處理的樣品；

取8道加樣器，將第一列的各孔樣品向微量板的第二列至第十二列依次做50μL的二倍系列稀釋；

用8道加樣器，向每孔中加入50μL預(yù)先配置好的1％(v/v)雞紅細(xì)胞懸液，混勻，室溫放置30min，觀察紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，記錄結(jié)果。

表2

實驗結(jié)果：

表3為禽流感VLP上清樣品滅活后血凝效價比較；圖1為禽流感VLP上清樣品滅活后血凝效價比較的示意圖；表4為新城疫VLP上清樣品滅活后血凝效價比較；圖2為新城疫VLP上清樣品滅活后血凝效價比較的示意圖；圖1，圖2中的過氧化氫溶液的濃度單位為w/w％

表3、圖1和表4、圖2的實驗結(jié)果顯示，用低濃度0-1％(w/w)的過氧化氫溶液，在合適的時間內(nèi)，滅活VLPs上清液中的重組桿狀病毒，不會破壞所合成的抗原蛋白的自然結(jié)構(gòu)和有效功能。

表3

表4

實施例3

過氧化氫滅活禽流感VLP抗原上清液中重組桿狀病毒的有效濃度和滅活時間。

實驗步驟如下：

(1)按實施例2中的表2所示的量，將禽流感VLP上清樣品，分別加入到做好標(biāo)記的1.5mL塑料管中，然后向各管中加入醫(yī)用濃度為3％(w/w)的過氧化氫溶液，再加入純凈水至終體積600μL，混勻，27℃孵育3h；

(2)另取一批1.5mL塑料管，完全重復(fù)步驟(1)的加樣方法，混勻后，27℃孵育18h；

(3)當(dāng)孵育至3h，向步驟(1)的各管中分別加入4μL牛肝源催化酶，混勻，終止滅活；

(4)當(dāng)孵育至18h，向步驟(2)的各管中分別加入4μL牛肝源催化酶，混勻，終止滅活；

(5)MTT法檢測病毒滅活：

向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中加入100μL含5×10⁴個Sf9細(xì)胞的細(xì)胞懸液，27℃靜置30min；

取滅活后的各樣品上清，按10倍倍數(shù)逐次稀釋，然后接種于所述的96孔板內(nèi)，每孔10μL，每個樣品接種3孔；

同時設(shè)最后一行的12孔不接種作為空白細(xì)胞對照；

將細(xì)胞培養(yǎng)板置濕盒中27℃培養(yǎng)6日；

取出細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入10μLMTT溶劑(5mg/ml)；

室溫下?lián)u動孵育4小時，2000rpm/min離心10分鐘，棄上清，加入50μLDMSO，室溫下?lián)u動孵育20分鐘；

細(xì)胞培養(yǎng)板置于96孔板讀盤儀內(nèi)，設(shè)置OD570nm，讀取各孔溶液的光吸收值。

實驗結(jié)果：

表5為使用不同的滅活條件后，禽流感VLP抗原上清液中所存活的重組桿狀病毒濃度。圖3為使用不同的滅活條件后，禽流感VLP抗原上清液中所存活的重組桿狀病毒濃度的示意圖。結(jié)果顯示，用濃度為0.3％(w/w)的過氧化氫溶液，溫度設(shè)置為27℃，滅活時間為18h，能有效地滅活VLPs上清液中的重組桿狀病毒。同時保持了抗原蛋白的自然結(jié)構(gòu)和有效功能。圖3中過氧化氫溶液的濃度單位為w/w％。

表5

實施例4

過氧化氫滅活法不影響禽流感VLP疫苗的免疫原性。

實驗步驟如下：

(1)用禽流感VLP疫苗免疫SPF小雞：將3周齡的SPF雞25只分成3組，兩組實驗組，每組10只，第三組5只不接種，作為對照組；

實驗組一10只各頸部皮下注射用濃度為0.3％(w/w)的過氧化氫溶液滅活18h的禽流感VLP疫苗0.3mL，實驗組二10只各頸部皮下注射未經(jīng)滅活處理的禽流感VLP疫苗0.3mL；

接種后21日，每只雞分別采血，分離血清，用禽流感VLP檢測抗原進(jìn)行HI抗體測定；

(2)HI抗體測定：

將96孔微量板橫向放置：垂直方向稱列，如孔A1～H1稱為第一列；平行方向稱行，如A1～A12稱為A行；

除第一列外，每孔各加25μL的PBS，但H1孔內(nèi)加50μL的PBS作為紅細(xì)胞對照；

取100μL常用微量加樣器，向第一列除H1孔外的各孔中分別加入50μL采集來的各雞只的血清；

取8道加樣器，將第一列的各孔樣品向微量板的第二列至第十二列依次做25μL的二倍系列稀釋；

再用12道加樣器，依次向除H行的各孔中加入25μL預(yù)先配置好的4單位抗原，H行加25μL的PBS，混勻后室溫靜置30min；然后每孔加入1％(v/v)紅細(xì)胞懸液50μL混勻，至室溫孵育30min，觀察紅細(xì)胞凝集抑制試驗結(jié)果。

實驗結(jié)果：

圖4為過氧化氫滅活法不影響禽流感VLP疫苗的免疫原性的示意圖。

圖4的結(jié)果顯示，用0.3％(w/w)的過氧化氫溶液在27℃滅活18h的禽流感VLP抗原制備的疫苗免疫實驗小雞，能有效地刺激免疫系統(tǒng)應(yīng)答，產(chǎn)生保護(hù)抗體；滅活疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體量與不經(jīng)任何處理的禽流感VLP疫苗免疫結(jié)果相比較，沒有明顯差異。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。