本發(fā)明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)的構建方法和應用。

背景技術：

手足口?。℉and-foot-mouth disease, HFMD）是一種由腸道病毒感染引起的傳染性疾病，多發(fā)于5歲以下嬰幼兒，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、厭食、哭鬧，在手、足、口腔黏膜、肛周等部位出現(xiàn)皰疹或潰瘍。手足口病通常具有自限性，多數(shù)患兒一周左右自愈，但少數(shù)患兒會出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、心肌炎、肺水腫等中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥，迅速進展為重癥手足口病，嚴重時可造成死亡。手足口病在我國高發(fā)，為我國公共健康帶來巨大威脅，2008年衛(wèi)生部將其納入丙類傳染病進行管理。

引發(fā)HFMD的腸道病毒有柯薩奇病毒A組2-10、12、16、24型，B組的1-5型以及腸道病毒71型（EV71）等，其中最主要的病原為EV71和柯薩奇病毒 A組16型（CA16）。通常 CA16引起的癥狀相對較輕但感染病例數(shù)量大，EV71更易引起神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥等重癥手足口病，而2012年以來的流行中CA6的分離率也日益增高。目前治療手足口病缺乏有效治療藥物，主要以對癥和支持治療為主。

CA16、EV71以及CA6均屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，為無包膜的正向單鏈RNA病毒，其衣殼為二十面體對稱結構，病毒衣殼由VP1、VP2、VP3和VP4構成，其中VP1是其主要的衣殼蛋白，同時也是病毒吸附蛋白，在病毒吸附和穿入過程中起決定作用，因此VP1又是病毒的中和抗原。手足口病疫情嚴重，而在預防手段方面針對EV71病毒的目前僅有滅活疫苗已上市，CA16尚無疫苗應用。

柯薩奇B組3型病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒I型、II型和III型病毒亦屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，腸道病毒屬的病毒在生物學特性上有相似之處。其中，腸道病毒屬的病毒在復制周期中，都是以基因組為模板，通讀轉錄成一條mRNA，并翻譯為前體蛋白，隨后在病毒蛋白酶的作用自切割形成多種病毒蛋白質(zhì)。在包裝階段，感染細胞中的病毒VP1、VP2、VP3和VP4會形成子代病毒衣殼，將子代基因組包裹并最終形成完整的子代病毒進行釋放。在包裝過程中，腸道病毒屬的病毒VP1功能相似，因此，如一個細胞被兩種以上的腸道病毒屬病毒感染，會發(fā)生表型混合的現(xiàn)象，即一種病毒的基因組會被另一種病毒的衣殼所包裹，這種病毒的衣殼和基因組來源于不同的腸道病毒。

腸道病毒屬病毒的表型混合現(xiàn)象，具有疫苗研究的潛在價值，但天然的表型混合實際操作過程中存在問題。兩種或兩種以上的腸道病毒同時細胞會引發(fā)干擾現(xiàn)象，使病毒的增殖效率降低，且不同病毒混合感染后的復制增殖效率不一，無法進行有效的質(zhì)控，而對于疫苗應用價值的毒株需要高復制效率，這也是目前疫苗研究領域均使用單型病毒各自增殖，然后將單獨制備的各型疫苗按需進行混合，而不使用多種病毒同時感染細胞來增殖病毒，不去利用表型混合機制。

用于“天然”表型混合的病毒，除了干擾現(xiàn)象和增殖效率不一的瓶頸外，如果是強毒株來源則需要進行滅活處理，制備為滅活疫苗，一方面其滅活疫苗的是利用已滅活無感染性的病毒衣殼，經(jīng)肌注后依靠體內(nèi)專職抗原提呈細胞加工處理后，激活機體產(chǎn)生免疫應答，為MHC-II類分子依賴的外源性抗原提呈，而自然條件下病毒感染更多的是以MHC-I類分子依賴的內(nèi)源性抗原提呈方式激活機體免疫，因此保護力不如基于減毒毒株的減毒活疫苗。另一方面，如使用的是減毒腸道病毒毒株來進行表型混合，一樣存在干擾現(xiàn)象和增殖效率不一的瓶頸，同時更為限制表型混合應用的是，多種減毒腸道病毒毒株混合感染細胞，由于毒株之間可以發(fā)生功能互補，且會發(fā)生非預期的基因重組，會極大加大減毒毒株回復毒力的風險。

因此，如將腸道病毒表型混合現(xiàn)象應用于腸道病毒疫苗研究和開發(fā)，需要建立一種安全、高效的表型混合系統(tǒng)的方法，能夠避免多種病毒同時感染所造成的干擾現(xiàn)象、增殖效率不一、非預期的基因重組、減毒毒株回復毒力，同時又比滅活疫苗免疫保護效果好。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術存在的上述缺陷，提供一種重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)的構建方法。

本發(fā)明的第二個目的是提供所述方法獲得的重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)。

本發(fā)明的第三個目的是提供所述混合系統(tǒng)的應用。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的：

一種重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)的構建方法，是構建VP1重組細胞系，將減毒腸道病毒株在VP1重組細胞系中進行感染擴增即得重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)；所述VP1重組細胞系為單獨或同時表達腸道病毒71型、柯薩奇病毒A組16型的VP1的一種或兩種的細胞系；所述減毒腸道病毒株選自柯薩奇病毒B組3型、腸道病毒71型或者脊髓灰質(zhì)炎病毒I型。

利用外源重組表達多種腸道病毒VP1蛋白的穩(wěn)定轉染細胞，擴增減毒腸道病毒，獲得含有多種不同腸道VP1病毒衣殼的減毒腸道病毒。該系統(tǒng)包括VP1重組細胞系和減毒腸道病毒毒株兩個部分。在該系統(tǒng)中，減毒腸道病毒毒株感染腸道病毒VP1重組表達細胞系后，例如，在病毒增殖的包裝階段，子代病毒會將其它腸道病毒的VP1混入子代病毒衣殼中。經(jīng)過增殖的子代病毒，其病毒核心為柯薩奇病毒B組3型減毒毒株基因組，而其表面病毒衣殼中的VP1是混裝的，含有來源于包括腸道病毒71型、柯薩奇病毒A組16型的VP1。所獲得的子代病毒可感染宿主，但由于病毒核心為減毒腸道病毒毒株的基因組，其在宿主中的復制和致病性受到限制；而子代病毒含有多種腸道病毒的VP1蛋白，且VP1是腸道病毒具有型特異性的中和抗原，因此，此種系統(tǒng)形成的子代病毒可激活宿主免疫，針對多種腸道病毒產(chǎn)生免疫保護。

優(yōu)選地，所述重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟：

S1. 擴增腸道病毒71型和/或柯薩奇病毒A組16型的VP1基因，連接至真核表達載體中，經(jīng)轉染、篩選后得VP1重組細胞系；

S2. 將重組減毒腸道病毒株感染S1得到的VP1重組細胞系即得。

本發(fā)明所述VP1重組細胞系和負載細胞因子基因的重組減毒腸道病毒株的制備方法均為分子生物學領域的常規(guī)技術。

優(yōu)選地，VP1重組細胞系的制備方法為提取相應病毒的RNA，利用polyA或隨機引物進行逆轉錄，得到cDNA。利用相應病毒的特異性引物，通過PCR擴增得到相應病毒的VP1基因，利用酶切連接將VP1基因片段插入真核表達載體中。真核表達載體可使用Neo或Puyo抗性基因，構建好的真核表達載體利用脂質(zhì)體轉染至真核細胞Vero細胞（或293、Hep2、HeLa等細胞）中，然后使用G418或嘌呤霉素進行篩選，經(jīng)免疫印跡鑒定和免疫熒光鑒定后，得到該表型混合系統(tǒng)的其中一部分，即VP1重組細胞系。

本發(fā)明還提供所述方法獲得的重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)。

如此，減毒腸道病毒株感染VP1重組細胞系，細胞病變后收獲子代病毒，獲得含有多種不同來源腸道病毒VP1衣殼、含有減毒腸道病毒毒株基因組核心的混合表型重組減毒毒株；此種系統(tǒng)形成的子代病毒可激活宿主免疫，針對多種腸道病毒產(chǎn)生免疫保護。

本發(fā)明還提供所述重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)在制備治療腸道病毒的疫苗方法的應用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)的構建方法，是構建VP1重組細胞系，將減毒腸道病毒株在VP1重組細胞系中進行感染擴增即得重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)；所述VP1重組細胞系為單獨或同時表達腸道病毒71型、柯薩奇病毒A組16型的VP1的一種或兩種的細胞系；所述減毒腸道病毒株選自柯薩奇病毒B組3型、腸道病毒71型或者脊髓灰質(zhì)炎病毒I型；減毒腸道病毒株感染VP1重組細胞系，細胞病變后收獲子代病毒，獲得含有多種不同來源腸道病毒VP1衣殼、含有減毒腸道病毒毒株基因組核心的混合表型重組減毒毒株；此種系統(tǒng)形成的子代病毒可激活宿主免疫，針對多種腸道病毒產(chǎn)生免疫保護，該表型混合系統(tǒng)具有實際和廣泛的應用價值。

附圖說明

圖1為CA16和EV71毒株VP1片段PCR擴增電泳圖；M：NEB 1kb DNA ladder；1：CA16毒株VP1片段PCR產(chǎn)物；2：EV71毒株VP1片段PCR產(chǎn)物。

圖2為CA16和EV71毒株VP1片段及真核表達載體pcFlag的酶切回收；M：NEB 1kb DNA ladder；1：CA16毒株VP1片段酶切產(chǎn)物；2：EV71毒株VP1片段酶切產(chǎn)物；3：pcFlag酶切產(chǎn)物。

圖3為CA16的VP1真核表達質(zhì)粒pcFlag-CA16-VP1和EV71的VP1真核表達質(zhì)粒pcFlag-EV71-VP1的菌落PCR鑒定；M：NEB 1kb DNA ladder；1-8：pcFlag-CA16-VP1菌落PCR產(chǎn)物；9-16：pcFlag-EV71-VP1菌落PCR產(chǎn)物。

圖4為pcFlag-CA16-VP1和 pcFlag-EV71-VP1的Hind III和Xho I雙酶切鑒定；M：NEB 1kb DNA ladder；1-2：pcFlag-CA16-VP1質(zhì)粒Hind III和Xho I雙酶切鑒定；9-16：pcFlag-EV71-VP1質(zhì)粒Hind III和Xho I雙酶切鑒定。

圖5為CA16和EV71重組VP1蛋白在細胞中表達的免疫熒光檢測。

具體實施方式

下面結合具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。

一、穩(wěn)定表達CA16和EV71的VP1的細胞的構建

臨床及實驗室確診的柯薩奇病毒A組16型（以下簡稱CA16）和腸道病毒71型（以下簡稱EV71）感染病例的標本，使用病毒RNA提取試劑盒分別提取感染病例的病毒RNA，利用SuperScript III逆轉錄酶和隨機引物，逆轉錄得到CA16和EV71的病毒cDNA。

以CA16和EV71病毒cDNA為模板，CA16-VP1基因的上游引物 ：5’- CCTAAGCTTTCTGGGTACTTTGACTATTACACC，下游引物5’- CAGCTCGAGTCATGTTGTTATCTTGTCTCTACTAC。EV71-VP1基因的上游引物 ：5’- CCTAAGCTTTATGCCCGAGATGGAGTGTTTGAC，下游引物5’- CAGCTCGAGTCATTTCCCAAGAGTGGTGATTGCTG。

擴增反應條件：94℃預變性3min后進入循環(huán)，94℃變性30s，52℃復性30s，72℃延伸2min，30個循環(huán)后72℃延伸5min。經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳，回收相應的產(chǎn)物片斷。PCR產(chǎn)物主帶大小約為1100bp左右，結果與預計相符（圖1）。

CA16和EV71毒株VP1 PCR產(chǎn)物，利用瓊脂糖凝膠電泳，回收預計大小的擴增主帶，利用Hind III和Xho I對VP1片段和pCMV-C-Flag 質(zhì)粒（簡稱pcFlag質(zhì)粒）進行雙酶切，酶切產(chǎn)物再次利用瓊脂糖凝膠電泳回收相應片段，CA16和EV71毒株VP1分別與pCMV-C-Flag 質(zhì)粒進行連接（圖2）。CA16和EV71毒株VP1分別與pCMV-C-Flag 質(zhì)粒進行連接，轉化感受態(tài)細胞后，經(jīng)抗性篩選的單菌落各挑選8個進行菌落PCR鑒定，如圖3所示，CA16的VP1真核表達質(zhì)粒pcFlag-CA16-VP1和EV71的VP1真核表達質(zhì)粒pcFlag-EV71-VP1的16個菌落均能擴增出相應的VP1片段。

經(jīng)菌落PCR鑒定陽性的菌落各挑取2個克隆進行細菌培養(yǎng)和質(zhì)粒提取，進行酶切鑒定，如圖4所示，經(jīng)Hind III和Xho I雙酶切后，均出現(xiàn)1100bp左右的VP1外源片段和約5kb的pcFlag載體片段。酶切鑒定的質(zhì)粒進行測序分析，結果完全正確，質(zhì)粒分別命名為pcFlag-CA16-VP1和 pcFlag-EV71-VP1。

293T細胞、RD細胞、Vero細胞均用DMEM（含10% FBS）在37℃、5% CO₂、水飽和條件下培養(yǎng)。轉染前，將生長至95%以上融合率的細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞生長20~24h至細胞密度達70~90%時進行轉染。轉染操作按照Lipofectamine 2000轉染試劑的操作手冊進行。

經(jīng)酶切和測序驗證的pcFlag-CA16-VP1和 pcFlag-EV71-VP1質(zhì)粒轉染293T和RD細胞，利用FLAG抗體進行免疫印跡檢測，在約32Kd的位置出現(xiàn)了預計大小條帶，表明真核表達質(zhì)?？稍?93T和RD細胞中表達出FLAG融合的VP1重組蛋白。

pcFlag-CA16-VP1和 pcFlag-EV71-VP1質(zhì)粒轉染293T細胞，利用免疫熒光檢測重組VP1的表達，如圖5所示，CA16和EV71重組VP1蛋白主要分布于細胞胞漿中。

將pcFlag-CA16-VP1和 pcFlag-EV71-VP1質(zhì)粒，以1：1的比例共轉染Vero細胞，轉染后72h使用G418進行篩選，經(jīng)過3周左右的篩選，獲得抗性細胞克隆，經(jīng)檢測得到穩(wěn)定表達CA16和EV71的VP1的Vero細胞系。

二、的重組減毒腸道病毒株的制備

減毒腸道病毒株可使用減毒的柯薩奇病毒B組3型、或減毒的腸道病毒71型、或減毒的脊髓灰質(zhì)炎病毒I型（Sabin疫苗株）。將減毒病毒在穩(wěn)定表達CA16和EV71的VP1的Vero細胞系進行感染，48h后收獲細胞上清，利用超速離心法獲得表型混合的重組腸道病毒。

SEQUENCE LISTING

<110> 汕頭大學醫(yī)學院

<120> 一種重組腸道病毒表型混合系統(tǒng)的構建方法和應用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> CA16-VP1基因的上游引物

<400> 1

cctaagcttt ctgggtactt tgactattac acc 33

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> CA16-VP1基因的下游引物

<400> 2

cagctcgagt catgttgtta tcttgtctct actac 35

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> EV71-VP1基因的上游引物

<400> 3

cctaagcttt atgcccgaga tggagtgttt gac 33

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> EV71-VP1基因的下游引物

<400> 4

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