一種基于高通量測(cè)序構(gòu)建白血病微小殘留病灶bcr文庫的多重pcr引物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于高通量測(cè)序構(gòu)建白血病微小殘 留病灶BCR文庫的多重PCR引物和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白血?。╨eukemia)是以骨髓和/或外周血中幼稚細(xì)胞增多為特征的血液系統(tǒng)惡 性克隆性疾病。在初診時(shí)，病人體內(nèi)白血病細(xì)胞總數(shù)約為1〇 12,經(jīng)化療取得形態(tài)學(xué)的完全 緩解（CompleteRemission，CR)后，殘留的白血病細(xì)胞總數(shù)低于109,這種形態(tài)學(xué)方法難以 檢測(cè)、且體內(nèi)仍殘存著少量白血病細(xì)胞的狀態(tài)稱為白血病微小殘留?。╩inimalresidual diseaSe，MRD)。體內(nèi)殘留的MRD使急性T淋巴白血病患者有>50%復(fù)發(fā)率。因此要定期檢 測(cè)MRD，對(duì)設(shè)計(jì)個(gè)體化的治療方案顯得更為重要。
[0003] B細(xì)胞基因座上大量V、J基因片段在受體的合成中會(huì)產(chǎn)生各種多樣重排，在V-J， V-D和D-J接合體之間的核苷酸不依賴模板插入或刪除，與高頻變異類似，這進(jìn)一步增加了 受體潛在的多樣性。受體的這種潛在多樣性很難隨機(jī)產(chǎn)生相同的CDR3序列，從而使每個(gè) ⑶R3序列有效地成為一個(gè)B細(xì)胞克隆的唯一標(biāo)簽。因此對(duì)于B淋巴細(xì)胞IGH基因⑶R3區(qū) 域的序列組成進(jìn)行測(cè)序可以很好的反映BCR免疫組庫的組成及應(yīng)答狀況。
[0004] 目前臨床上MRD的主要檢測(cè)方法是：多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（multiparametricflow cytometry，mpFC)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。雖然mpFC對(duì)于復(fù)發(fā)疾病的檢測(cè)靈敏度為10 4,但 是復(fù)雜的多維數(shù)據(jù)依賴于實(shí)驗(yàn)人員分析，人為因素影響大，不利于臨床標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)。此外， 在化療后白血病抗原的表達(dá)水平對(duì)MRD的mpFC檢測(cè)具有干擾作用。依賴于分子手段可以提 高檢測(cè)MRD的靈敏度，可以達(dá)到10 5;然而，實(shí)時(shí)定量PCR需根據(jù)患者設(shè)計(jì)特殊的引物將多 樣性豐富的重排序列擴(kuò)增出來，其檢測(cè)費(fèi)用昂貴、勞動(dòng)力密集、很難形成標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程。
[0005] 得益于下一代高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，DNA和RNA測(cè)序平臺(tái)在基 因組學(xué)的各個(gè)方面發(fā)揮著突出的推動(dòng)作用。因此，提供一種基于高通量測(cè)序構(gòu)建白血病微 小殘留病灶BCR文庫的多重PCR引物和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于此，本發(fā)明提供了一種基于高通量測(cè)序構(gòu)建白血病微小殘留病灶BCR文庫的 多重PCR引物和方法。
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供了一種基于高通量測(cè)序構(gòu)建白血病微小殘留病灶BCR文 庫的多重PCR引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物為比SEQIDNO: 1~SEQID NO: 13所示的核苷酸序列多或少0~3個(gè)堿基的核苷酸序列組成的上游引物組；
[0008] 所述下游引物為比SEQIDN0:14~SEQIDN0:17所示的核苷酸序列多或少0~ 3個(gè)堿基的核苷酸序列組成的。
[0009] 如本發(fā)明所述的，"堿基"可代表核苷酸，比如，計(jì)數(shù)時(shí)，用lbp代表1個(gè)核苷酸。
[0010] 如本發(fā)明所述的，"多或少〇~3個(gè)堿基"，優(yōu)選為在對(duì)應(yīng)引物的3'端多或少0~ 3個(gè)堿基。
[0011] 本發(fā)明通過針對(duì)人BCR的可變區(qū)V區(qū)（variable)設(shè)置至少13條上游引物序列，針 對(duì)BCR的連接區(qū)（joining)J區(qū)設(shè)置至少4條下游引物序列，通過多重PCR擴(kuò)增目的片段， 獲得多重PCR產(chǎn)物構(gòu)建BCR高通量測(cè)序文庫。
[0012] 優(yōu)選地，所述上游引物為SEQIDNO: 1~SEQIDN0:13所示的核苷酸序列組成的 上游引物組，所述下游引物為SEQIDN0:14~SEQIDN0:17所示的核苷酸序列組成的下 游引物組。
[0013] 如本發(fā)明所述的，所述比SEQIDNO: 1~SEQIDN0:17所示的核苷酸序列多出的 1~3個(gè)堿基為與目的BCR互補(bǔ)的堿基。
[0014] 如本發(fā)明所述的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的，所述的"比SEQIDNO: 1~SEQID NO: 13或SEQIDNO: 14~SEQIDNO: 17所示的核苷酸序列多或少0~3個(gè)堿基的核苷酸 序列"為本領(lǐng)域技術(shù)人員在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，在如"SEQIDNO: 1~SEQIDN0:17所示的核 苷酸序列"的基礎(chǔ)上，適當(dāng)?shù)难娱L或截短PCR引物長度即可獲得（延長部分仍然與相應(yīng)的目 的片段互補(bǔ)）；
[0015] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的，若摸索的多重PCR引物組（"SEQIDNO: 1~SEQID NO: 17所示的核苷酸序列"）獲得了較佳的擴(kuò)增效果，在可預(yù)測(cè)范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)膶⒏鳁l引物延 長或截短0~3個(gè)堿基后所得多重PCR引物組，也可以獲得較佳的多重PCR擴(kuò)增效果。
[0016] 優(yōu)選地，所述下游引物的5'端和上游引物的5'端分別包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序 列為由6~8個(gè)核苷酸序列組成的序列條碼，其中，所述序列條碼之間至少有一個(gè)核苷酸不 同。
[0017] 本發(fā)明提供的帶標(biāo)簽序列的引物可以給待測(cè)樣品中的每個(gè)RNA分子或DNA分子都 加上了 一個(gè)標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列由ATCG四種基本堿基隨機(jī)組合，且所述標(biāo)簽序列互不 相同，例如，標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是八個(gè)時(shí)（本發(fā)明實(shí)施例中表示為8N標(biāo)簽序列），可以獲 得109個(gè)不同的標(biāo)簽序列組合；標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是七個(gè)時(shí)，可以獲得10 8個(gè)不同的標(biāo)簽 序列組合；標(biāo)簽序列的堿基個(gè)數(shù)是六個(gè)時(shí)，可以獲得1〇7個(gè)不同的標(biāo)簽序列組合，所述標(biāo)簽 序列的堿基個(gè)數(shù)是八個(gè)，或者七個(gè)，或者六個(gè)。
[0018] 第二方面，本發(fā)明提供了一種基于高通量測(cè)序構(gòu)建白血病微小殘留病灶BCR文庫 的多重PCR方法，包括如下步驟：
[0019] 取待測(cè)樣品；
[0020] 采用多重PCR反應(yīng)擴(kuò)增待測(cè)樣品獲得多重PCR產(chǎn)物，其中，多重PCR反應(yīng)采用的引 物組包括上游引物和下游引物，所述上游引物為3'端比SEQIDNO: 1~SEQIDN0:13所 示的核苷酸序列多或少〇~3個(gè)堿基的核苷酸序列組成的上游引物組；
[0021] 所述下游引物為3'端比SEQIDN0:14~SEQIDN0:17所示的核苷酸序列多或 少0~3個(gè)堿基的核苷酸序列組成的。
[0022] 優(yōu)選地，所述待測(cè)樣品為DNA樣品或RNA樣品。
[0023] 當(dāng)所述取待測(cè)樣品為DNA樣品時(shí)，進(jìn)行多重PCR的體系參照普通PCR體系進(jìn)行配 置；當(dāng)所述取待測(cè)樣品為RNA樣品時(shí)，要先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再合成第二鏈DNA，此時(shí)， 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的步驟相當(dāng)于一個(gè)循環(huán)的多重PCR(只采用上游引物組或下游引物組），合 成第二鏈DNA的步驟也相當(dāng)于一個(gè)循環(huán)的多重PCR(只采用下游引物組或上游引物組）。
[0024] 優(yōu)選地，所述待測(cè)RNA樣品為（優(yōu)選采用RNA試劑盒）提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞 獲得的總RNA。
[0025] 優(yōu)選地，當(dāng)待測(cè)樣品為RNA樣品，所述的采用多重PCR反應(yīng)，擴(kuò)增待測(cè)樣品，獲得多 重PCR產(chǎn)物的步驟為：先以下游引物組為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA;然后以合成的cDNA為模 板，加入上游引物組，進(jìn)行多重PCR，擴(kuò)增cDNA，獲得多重PCR產(chǎn)物。
[0026] 優(yōu)選地，當(dāng)待測(cè)樣品為RNA樣品，所述的采用多重PCR反應(yīng)，擴(kuò)增待測(cè)樣品，獲得多 重PCR產(chǎn)物的步驟為：先以上游引物組為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA;然后以合成的cDNA為模 板，加入下游引物組，進(jìn)行多重PCR，擴(kuò)增cDNA，獲得多重PCR產(chǎn)物。
[0027] 優(yōu)選地，所述上游引物為SEQIDNO: 1~SEQIDN0:13所示的核苷酸序列組成的 上游引物組，所述下游引物為SEQIDN0:14~SEQIDN0:17所示的核苷酸序列組成的下 游引物組。
[0028] 優(yōu)選地，所述多重PCR反應(yīng)的體系中，13條上游引物組成的上游引物組中，各上游 引物等摩爾混合；4條下游引物組成的下游引物組中，各下游引物等摩爾混合。
[0029] 優(yōu)選地，所述下游引物的5'端和上游引物的5'端分別包括標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序 列為由6~8個(gè)核苷酸序列組成的序列條碼，其中，所述序列條碼之間至少有一個(gè)核苷酸不 同。
[0030] 優(yōu)選地，所述多重PCR反應(yīng)的體系中，模板量為1~3ug/50ul體系。
[0031] 優(yōu)選地，所述多重PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?br>[0032]
[0033] 上述程序具體為：95°C預(yù)變性15min，94°C變性15s，65°C退火90s，72°C延伸30s， 循環(huán)25~30次，最后72°C后延伸lOmin。
[0034] 優(yōu)選地，所述多重PCR反應(yīng)結(jié)束后，電泳，割膠回收片段長度為100-150bp的DNA 片段。
[0035] 本發(fā)明提供的BCR高通量測(cè)序文庫能獲得的長度和數(shù)量豐富的BCR序列，有利于 BCR序列的多態(tài)性程度分析及BCR高克隆CDR3區(qū)長度多態(tài)性分布分析。
[0036] 優(yōu)選地，將所得多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行建庫后進(jìn)行高通量測(cè)序，并通過生物信息學(xué)分 析高通量測(cè)序結(jié)果。
[0037] 在高通量測(cè)序平臺(tái)的基礎(chǔ)上，通過對(duì)人BCR基因⑶R3區(qū)域進(jìn)行全面的生物信息學(xué) 分析，獲得了BCR在VDJ重組時(shí)的基因偏好性（usagepatterns)，基因組合、連接多樣性信 息，以及CDR3序列中氨基酸的偏好性（usagepatterns)、CDR3氨基酸序列的長度多樣性以 及連接處N端堿基的特性。正是這些因素形成數(shù)量龐大且種類多樣的BCR受體庫。
[0038] 第三方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)白血病微小殘留病灶BCR多樣性的試劑盒，包 括如第一方面所述的基于高通量測(cè)序構(gòu)建白血病微小殘留病灶BCR文庫的多重PCR引物。
[0039] 第四方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的基于高通量測(cè)序構(gòu)建白血病微小 殘留病灶BCR文庫的多重PCR引物或第二方面所述的基于高通量測(cè)序構(gòu)建白血病微小殘留 病灶BCR文庫的多重PCR方法在檢測(cè)白血病微小殘留病灶BCR多樣性中的應(yīng)用。
[0040] 本發(fā)明提供的基于高通量測(cè)序構(gòu)建白血病微小殘留病灶BCR文庫的多重PCR引物 及方法的有益效果為：1)獲得了人BCR序列；2)獲得了人特異性的BCRCDR3序列，尤其提 高了低拷貝數(shù)B細(xì)胞克隆的檢出率。
【附圖說明】
[0041] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的基因組及PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝