本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種新型廣譜溶菌酶的高通量篩選方法。
背景技術：
溶菌酶(lysozyme，ec3.2.1.17)又稱胞壁質酶(muramidase)，能特異性水解原核細菌細胞壁中的主要成分肽聚糖，分解微生物的細胞壁，使細菌失去細胞壁的保護并在胞內高滲透壓的作用下破裂死亡，從而達到殺菌目的。1921年，著名英國細菌學家alexanderfleming在人的鼻液中發(fā)現(xiàn)了溶菌酶，后證實溶菌酶廣泛存在于鳥類和禽類的蛋清內、哺乳動物的各器官組織和體液內、植物以及軟體動物和昆蟲體內。
溶菌酶作為高等有機體組織及體液中最強大的抗菌劑之一，是生物機體對抗外源病原菌侵襲的重要防御因子。如人溶菌酶是一種小分子堿性球蛋白，它由上皮細胞和單核-巨噬細胞分泌，可識別和破壞病原菌的細胞結構，并通過信號級聯(lián)反應吸引白細胞集中到感染部位，最終消滅侵染人體的病原菌。此外，溶菌酶還可與帶負電荷的病毒蛋白直接結合，和dna-rna脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活。在植物中，如無花果的鮮汁中均含有豐富的溶菌酶，推測其與植物的抗病毒作用密切關系。另一方面，溶菌酶也廣泛存在于微生物中，如各種細菌和噬菌體。噬菌體溶菌酶與噬菌體侵染過程中細菌細胞壁的分解有關。細菌溶菌酶的主要功能是參與細胞生長分裂形態(tài)改變等與細胞壁相關的代謝過程。因此，細菌不會對溶菌酶這種細菌中廣泛含有的自溶素(autolysin)，產生真正意義上的抵抗性，這對于解決日益嚴峻的細菌耐藥性問題，減少抗生素濫用具有重要意義。
雖然溶菌酶的作用強大，但其對革蘭氏陰性菌的裂解效果并不好。這是由于細菌細胞壁構成不同所導致的。革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由肽聚糖構成，肽聚糖層數(shù)較多且較厚，含有少量磷壁酸，而革蘭氏陰性菌外層主要由脂多糖(lps)構成，內層才含有少量肽聚糖。而溶菌酶的主要作用位點為細胞壁中的肽聚糖，水解β-1,4糖苷鍵，故其對于革蘭氏陰性菌的作用效果不是很理想。
在日常生活當中，人們所接觸到的很多致病菌，如大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎桿菌、痢疾桿菌和產氣莢膜桿菌等，都屬于革蘭氏陰性菌。為了得到對革蘭氏陰性菌具有高殺菌活性的溶菌酶，可以對溶菌酶進行定向進化，構建溶菌酶基因隨機突變文庫，再從中篩選出對革蘭氏陰性菌殺菌效果較強的溶菌酶。
定向轉化過程中，一方面，所需的突變體文庫數(shù)量龐大，需采用高通量方法以提高篩選效率；另一方面，溶菌酶對革蘭氏陰性菌裂解效果差，需采用衡量指標較敏感、可有效反映裂解效果的篩選手段。而現(xiàn)有的篩選方法如平板抑菌圈法、牛津杯法等，無法很好的同時滿足以上兩點要求。因此，亟需構建一種靈敏可靠、易操作的高通量篩選方法，用于新型廣譜溶菌酶突變體的篩選。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足提供一種新型廣譜溶菌酶的高通量篩選方法，該方法通過fret熒光蛋白對與位點特異性蛋白酶的級聯(lián)使用，提高了檢測的靈敏性，同時利用熒光酶標儀和96微孔板可以實現(xiàn)溶菌酶的高通量檢測。
為此，本發(fā)明提供了一種新型廣譜溶菌酶的高通量篩選方法，其包括以下步驟：
a，將目標溶菌酶的基因突變文庫在真核細胞中進行分泌表達，獲得含不同活性目標溶菌酶的發(fā)酵液；
b，將含不同活性目標溶菌酶的發(fā)酵液分別加入到反應體系中進行反應，篩選出對革蘭氏陰性菌殺菌活性高的溶菌酶；
其中，所述反應體系包括：胞內表達“供體熒光蛋白-蛋白酶的識別位點-受體熒光蛋白”的革蘭氏陰性菌、蛋白酶和蛋白酶反應緩沖液。
在本發(fā)明中，根據(jù)反應過程中供體熒光蛋白的信號強度增長速度，判斷發(fā)酵液中的溶菌酶對革蘭氏陰性菌殺菌活性；具體地，反應過程中供體熒光蛋白的信號強度增長越快，發(fā)酵液中的溶菌酶對革蘭氏陰性菌殺菌活性越高。
在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的蛋白酶為具有識別序列特異性的蛋白酶；在本發(fā)明的一些具體實施例中，所述的蛋白酶為tev蛋白酶、腸激酶或凝血因子xa；在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施例中，所述的蛋白酶為tev蛋白酶。
在本發(fā)明的另一些實施方式中，所述tev蛋白酶的識別位點的氨基酸序列為：glu-asn-leu-tyr-phe-gln-gly。
在本發(fā)明的一些實施方式中，所述目標溶菌酶基因突變文庫的構建方法為易錯pcr和/或dna改組。
在本發(fā)明中，由于供體熒光蛋白的發(fā)射光譜與受體熒光蛋白的吸收光譜重疊，因此當供體熒光蛋白與受體熒光蛋白之間的距離在10nm以內時，會發(fā)生能量轉移現(xiàn)象，供體熒光蛋白的能量轉移至受體熒光蛋白上，使供體蛋白熒光強度要比它單獨存在時低得多，而受體蛋白熒光強度大大增強。
在本發(fā)明的一些具體實施例中，所述的供體熒光蛋白為青色熒光蛋白，所述的受體熒光蛋白為黃色熒光蛋白。
在本發(fā)明的一些具體實施方式中，所述真核細胞為畢赤酵母。
在本發(fā)明的另一些具體實施方式中，所述方法還包括以下步驟：
c，對篩選出的對革蘭氏陰性菌殺菌活性高的溶菌酶進行復篩，根據(jù)反應過程中供體熒光蛋白的信號強度增長速度，驗證溶菌酶的活性。
本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明所述篩選方法通過fret熒光蛋白對與位點特異性蛋白酶的級聯(lián)，借助檢測熒光信號，顯著提高了檢測的靈敏度，可有效地發(fā)現(xiàn)陽性突變，找到優(yōu)良突變基因；同時該方法可利用熒光酶標儀和96微孔板實現(xiàn)溶菌酶的高通量檢測。
具體實施方式
為使本發(fā)明容易理解，下面將詳細說明本發(fā)明。
本發(fā)明所述篩選方法基于熒光共振能量轉移技術(fret)，即兩個熒光蛋白分子距離極近(10nm以內)時，如果供體熒光蛋白的發(fā)射光譜與受體熒光蛋白的吸收光譜重疊，則會發(fā)生能量轉移現(xiàn)象，供體熒光蛋白的能量轉移至受體熒光蛋白上，使供體蛋白熒光強度要比它單獨存在時低得多，而受體蛋白熒光強度大大增強。以青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白為例，青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白是一對可以發(fā)生fret效應的蛋白，其中青色蛋白的發(fā)射光譜與黃色蛋白的吸收光譜重疊。
用蛋白酶的識別位點作為linker序列，例如，采用tev蛋白酶的識別位點作為linker序列將青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白連接，使青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白形成距離極近的fret熒光蛋白對，即“青色熒光蛋白-tev蛋白酶的識別位點-黃色熒光蛋白”。tev蛋白酶的識別位點是由glu-asn-leu-tyr-phe-gln-gly七個氨基酸構成。
反應前，由于linker序列(tev蛋白酶的識別位點)的作用，青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白距離極近，青色熒光蛋白的能量轉移至黃色熒光蛋白上，此時檢測信號呈現(xiàn)青色熒光信號弱、黃色熒光信號強；當將含溶菌酶的發(fā)酵液加入反應液中，若溶菌酶對底物菌種(革蘭氏陰性菌)有較好的殺菌活性，則細菌發(fā)生裂解并釋放內部的fret熒光蛋白對。該蛋白對的tev蛋白酶的識別位點被反應液中的tev蛋白酶特異性識別并分解，得到獨立的青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白，fret現(xiàn)象消失，使得青色熒光信號增強。因此，可以通過定量測定青色熒光蛋白信號強度的增長速度，來判定溶菌酶對革蘭氏陰性菌的殺菌活性。
本發(fā)明所涉及的新型廣譜溶菌酶的高通量篩選方法的具體操作如下：
(1)構建表達目標溶菌酶基因突變文庫的真核細胞：
目標溶菌酶的具體種類可根據(jù)實際需要選擇。編碼目標溶菌酶的基因序列通過核酸數(shù)據(jù)庫查找并進行全基因合成，得到原始目標溶菌酶基因序列。構建目標溶菌酶基因隨機突變文庫主要通過易錯pcr和dna改組(也稱dna洗牌)兩種手段實現(xiàn)。
1)易錯pcr具體操作步驟如下：
針對原始目標溶菌酶基因序列設計含有酶切位點的引物，通過調整pcr反應體系的配比及反應條件，如改變反應體系中金屬離子的濃度、增加pcr反應循環(huán)次數(shù)等，進行易錯pcr擴增，使易錯pcr產物中的基因序列發(fā)生點突變，從而引起氨基酸改變。
2)dna改組具體操作步驟如下：
選取與原始目標溶菌酶基因具有同源性的其他溶菌酶基因序列，數(shù)目可以根據(jù)實際需要所選擇。每種基因序列各取20μl混合，加入0.2u的dnasei，16℃下酶切15min后立即加入6μledta，轉移至75℃水浴，酶失活10min。將酶切后的混合體系進行瓊脂糖凝膠電泳，選取合適的方法，將所需大小的片段進行膠回收。若模板基因為2000bp左右，則切取100-200bp處膠塊，選用膠回收試劑盒進行膠回收；若模板基因為1000bp左右，則切取50bp左右處膠塊，由于片段長度小，電泳時選取低熔點瓊脂糖進行電泳，切取的膠塊溶在3倍體積的te溶液中，利用酚氯仿抽提，再進行乙醇沉淀，回收小片段dna。
將回收后的片段dna作為無引物pcr的模板，進行無引物pcr，利用基因重組的原理，使片段dna互為引物進行pcr，體系配比如下：1μlpfu酶，5μlbuffer，10μldntp，5μl片段dna，29μl超純水，共50μl。pcr程序為：94℃5min，94℃30s，46℃1min，72℃30s，50個循環(huán)，72℃10min。其中72℃延伸時間根據(jù)實際需要選定。對無引物pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收原始目標溶菌酶基因大小的片段。
根據(jù)幾種同源基因設計含有相同酶切位點的引物，加入所設計的引物，利用上一步無引物pcr產物作為模板，進行有引物pcr。按常規(guī)pcr體系配比，按照正常pcr反應條件進行pcr反應。將有引物pcr產物再進行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收原始目標溶菌酶基因大小的片段。
將易錯pcr或dna改組后的產物進行雙酶切，將表達載體也采用同樣的酶進行雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳，回收所需大小片段，取5μl回收產物再次進行電泳，根據(jù)條帶亮度確定目的基因和表達載體比例，配制連接體系，16℃連接過夜，構建重組質粒。
將重組質粒轉入top10感受態(tài)細胞中，然后將轉入重組質粒的感受態(tài)細胞懸液全部涂于平板上，每個直徑90mm的平板上涂布100-200μl轉入重組質粒的感受態(tài)細胞懸液，37℃培養(yǎng)16h左右。用無菌水將生長好的菌株從平板上沖下，形成菌懸液，回收菌懸液，利用提質粒試劑盒提取菌懸液中的重組質粒。
將重組質粒轉入真核生物感受態(tài)細胞中，例如畢赤酵母感受態(tài)細胞，將轉入重組質粒的真核生物感受態(tài)細胞懸液全部平分涂于平板上，靜置培養(yǎng)，獲得含目標溶菌酶基因突變文庫的真核細胞。
(2)構建胞內表達“供體熒光蛋白-蛋白酶的識別位點-受體熒光蛋白”的革蘭氏陰性菌：
所采用的供體熒光蛋白為青色熒光蛋白，受體熒光蛋白為光色熒光蛋白，蛋白酶為tev蛋白酶；
通過ncbi數(shù)據(jù)庫查找出青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白的基因序列，加入tev蛋白酶的識別位點基因作為中間linker序列，設計出兩端帶有限制性酶切位點的“青色熒光蛋白-tev蛋白酶的識別位點-黃色熒光蛋白”fret熒光蛋白對基因序列，通過人工進行合成。將fret熒光蛋白對基因和革蘭氏陰性菌胞內表達載體均進行雙酶切，電泳后回收片段進行連接，構建重組質粒。
將重組質粒導入革蘭氏陰性菌感受態(tài)細胞中，誘導發(fā)酵表達，通過sds-page鑒定fret熒光蛋白對成功在菌種中得到表達。離心收集菌體，棄上清，加入無菌水重懸菌種，再離心后加入無菌水，使其形成具有特定濃度的菌懸液。
(3)篩選對革蘭氏陰性菌殺菌活性高的溶菌酶：
將成功分泌表達目標溶菌酶基因突變文庫的酵母體系，逐孔轉入裝有酵母培養(yǎng)基的96深孔板中，在深孔板中進行誘導發(fā)酵，獲得含目標溶菌酶的發(fā)酵液。
每孔吸取100μl發(fā)酵液，并將其逐孔對應地轉移入透明的酶標板中，每孔再加入100μl純水，混勻后在酶標儀中測得每孔發(fā)酵液的od600值。
向胞內表達“青色熒光蛋白-tev蛋白酶的識別位點-黃色熒光蛋白”的革蘭氏陰性菌的菌懸液中，加入tev蛋白酶及tev蛋白酶緩沖液，加入量根據(jù)檢測量所需計算(檢測時，每孔加入150μl菌懸液、0.8μltev蛋白酶緩沖液和0.5μltev蛋白酶)，混勻后形成底物混合液，向熒光酶標板中每孔加入151μl底物混合液。
然后向熒光酶標板中每孔加入50μl發(fā)酵液(最后兩孔不加入發(fā)酵液，只加入底物混合液作為陰性對照)，立即吸打1-2次后，放入酶標儀中進行檢測，激發(fā)波長為433nm，發(fā)射波長為475nm，每隔1min檢測一次，共檢測45min，反應4h后，再檢測10min，每隔1min檢測一次。
篩選指標的處理分析如下：
反應前45min以時間(min)為橫坐標、青色熒光信號強度值為縱坐標做圖，檢測反應開始時的穩(wěn)定性。如果反應穩(wěn)定，即反應趨勢平緩上升，則可以求前10min熒光信號強度平均值，同時求反應4h后10min內的平均值。兩個平均值之差再除以每孔發(fā)酵液的od600值，即熒光信號強度差值/od600(青色熒光蛋白的信號強度增長速度)，以此數(shù)據(jù)對突變溶菌酶酶活的高低進行排序，同時將各孔的數(shù)據(jù)與陰性對照孔的數(shù)據(jù)進行比對。其中青色熒光信號增長越快且高于對照孔數(shù)值的，表示發(fā)酵液中的溶菌酶對革蘭氏陰性菌殺菌活性越高。
對篩選出的含對革蘭氏陰性菌殺菌活性高的溶菌酶的陽性酵母進行放大培養(yǎng)和復篩，根據(jù)反應過程中青色熒光蛋白的信號強度增長速度，驗證溶菌酶的活性。提取最終得到的陽性酵母的全基因組，擴增目的基因并進行測序，得到具有高革蘭氏陰性菌殺菌活性的新型溶菌酶的基因序列。
本發(fā)明中所述的“柞蠶溶菌酶基因”為經密碼子優(yōu)化后的柞蠶溶菌酶基因。
實施例
為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結合實施例來進一步詳細說明本發(fā)明，這些實施例僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應用范圍。本發(fā)明中所使用的原料或組分若無特殊說明均可以通過商業(yè)途徑或常規(guī)方法制得。
實施例1：構建柞蠶溶菌酶基因突變文庫
柞蠶是一種北方經濟昆蟲，柞蠶溶菌酶(aplyz)具有適應溫度范圍廣、最適溫度較低等特性，具有良好的應用價值。由ncbi數(shù)據(jù)庫中查找到柞蠶溶菌酶基因序列，成熟肽序列共363bp，由公司進行全基因合成，合成后的基因序列如下：
aagtggtttaccaaatgtggtctagtgcacgagctgaggagacaaggcttcgacgagagcctaatgagagactgggtctgtttggttgagaacgaaagcagcagatatactaataaaatcggtaaagtgaataagaatggttctcaagactacggtttgttccagatcaatgacaaatattggtgtagtaagacctccacccccggaaaggattgcaatgtgacttgtaatcaattgttgactgacgatattacagttgctgctacctgtgcgaagaagatttacaagagacataagtttaacgcttggtacggatggttaaaccactgtcaacactctcttccagacattagcgactgttaa；
根據(jù)要連接的表達載體ppiczαa和上述柞蠶溶菌酶基因序列，選擇noti和xhoi兩種限制性內切酶，設計含有酶切位點的上下游引物，引物序列如下：
aplyz-f：tctactcgagaaaagaaagtggtttacca
aplyz-r：tcgctgacaattcgccggcgtatat
首先進行正常pcr，擴增柞蠶溶菌酶基因，與t載體連接后留存菌種，后選用易錯pcr和dna改組兩種方法構建柞蠶溶菌酶的基因突變文庫。
易錯pcr的具體操作步驟如下：
以柞蠶溶菌酶基因為模板，加入設計好的上下游引物，調整體系配比以及反應條件，進行易錯pcr，反應體系配比如下：
pcr反應條件為94℃預變性3min，94℃變性1min，56℃退火30s，72℃延伸30s，共50個循環(huán)。1％瓊脂糖凝膠電泳45min，凝膠成像儀檢測并記錄結果。
dna改組的具體操作步驟如下：
選取與柞蠶溶菌酶基因序列具有同源性的人源溶菌酶基因4(lyzl4)的基因和人源溶菌酶基因6(lyzl6)的基因，對柞蠶溶菌酶基因進行改組。其中，人源溶菌酶基因4的基因序列如下：
gaattcctcgagtacatcttaggtagatgtactgtcgcaaagaaactgcatgacggaggtctggattacttcgaaggatactctcttgagaattgggtgtgcttggcctattttgagtctaagttcaatccaatggccatatatgaaaatactagagagggttataccggatttggattgtttcagatgagaggtagtgattggtgcggtgaccatggtagaaacagatgtcatatgtcatgttccgcattattgaacccaaaccttgaaaaaactattaagtgcgctaaaactattgttaagggtaaagaaggtatgggtgcttggcctacctggtctagatattgtcaatacagtgatacattggctagatggctagacggatgtaagctttaagcggccgc
人源溶菌酶基因6的基因序列如下：
gaattcctcgagtctttgatttctagatgcgatttggctcaagttttgcagttggaggacttggacggtttcgagggttactctttgtctgactggttgtgcttggccttcgtcgagtctaagttcaacatctctaagatcaacgagaacgccgacggatctttcgactacggattgttccagatcaactctcactactggtgcaacgactacaaatcttactctgagaacttgtgccatgtcgattgccaggacttgttgaacccaaacttgttggctggaatccattgcgccaagagaatcgtctctggagccagaggaatgaacaactgggtcgagtggagattgcactgctctggtagacctttgttctattggttgaccggttgcagattgagatgagcggccgc
根據(jù)柞蠶溶菌酶基因序列、人源溶菌酶基因4基因序列和人源溶菌酶基因6基因序列設計含有相同酶切位點的引物。設計引物如下：
柞蠶溶菌酶基因、人源溶菌酶基因4、人源溶菌酶基因6各取20μl進行混合，加入6μl的dnasei緩沖液，加入0.2u左右的dnasei，酶切15min，加入10μledta，75℃酶失活10min。酶切后的混合體系采用1.5％低熔點瓊脂糖凝膠電泳45min，凝膠成像儀檢測并記錄結果。
選取50bp左右處條帶，在紫外燈下將膠塊切下，加入3倍體積te溶液，放入70℃水浴中至凝膠熔化，加入等體積的平衡酚抽提一次，12000rpm離心10min取上清轉入另一pe管中，去除多余的瓊脂。用等體積的酚:(氯仿:異戊醇)(1:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提一次，取上清。
加入總體積1/10的乙酸鈉(ph5.2)，再加入三倍體積預冷的無水乙醇，混勻后在-20℃冰箱中冷凍過夜。將離心管取出，放入預冷的4℃離心機，13000rpm高速離心15min，將上清盡可能吸除干凈后，向兩離心管中各加入1ml75％的冰凍乙醇，13000rpm，離心10min。重復加入1ml75％的冰凍乙醇，再次除鹽。室溫下自然風干，向兩支離心管中各加入13μl去離子水溶解dna，后從離心管中各取3μldna溶液跑電泳檢查乙醇沉淀后回收效果。
以回收的小片段dna產物為模板，不加引物，利用同源重組，使小片段之間互相作為模板，進行無引物pcr，體系如下：
pcr反應條件為94℃預變性5min，94℃變性30s，46℃退火1min，72℃延伸30s，共50個循環(huán)，最后72℃延伸10min。對無引物pcr產物采用1％瓊脂糖凝膠電泳45min，凝膠成像儀檢測并記錄結果，并利用膠回收試劑盒回收400bp左右處dna。為了增加片段的豐富性，可再次利用dnasei進行酶切并無引物pcr，再次回收。
利用無引物pcr產物為模板，加入上述的六種引物，進行有引物pcr，體系如下：
pcr反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性1min，55.5℃退火30s，72℃延伸30s，共33個循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴增產物采用1％瓊脂糖凝膠電泳45min，凝膠成像儀檢測并記錄結果，并利用膠回收試劑盒回收400bp左右處dna。
選用noti和xhoi限制性內切酶，對易錯pcr產物和dna改組產物以及表達質粒ppiczαa進行雙酶切。雙酶切后對體系進行電泳，回收所需大小片段，再次將膠回收產物進行電泳，根據(jù)條帶亮度判斷濃度比例，將目的基因和表達質粒連接過夜，構成重組表達質粒。
將重組質粒轉入top10感受態(tài)細胞中，后將轉入重組質粒的感受態(tài)細胞懸液全部涂于平板上，每個直徑90mm的平板上涂布100-200μl轉入重組質粒的感受態(tài)細胞懸液，37℃培養(yǎng)16h左右。用無菌水將生長好的菌株從平板上沖下，形成菌懸液，回收菌懸液，利用提質粒試劑盒提取菌懸液中的重組質粒。
實施例2：將重組表達質粒轉入畢赤酵母細胞
畢赤酵母表達系統(tǒng)是一種良好的真核表達系統(tǒng)，結合ppiczαa表達質?？梢詫崿F(xiàn)良好的胞外表達。
畢赤酵母感受態(tài)細胞制備具體操作步驟如下：
(1)挑取ypds平板上的畢赤酵母gs115單克隆接種于10mlypd液體培養(yǎng)基中，為保證通氣量，用6層紗布封口，30℃，250rpm培養(yǎng)過夜。
(2)按1％的接種量轉接于含50mlypd液體培養(yǎng)基的250ml帶擋板錐形瓶中。30℃，250rpm震蕩培養(yǎng)約20h至od600為1.3-1.5。
(3)將菌液移入預冷的50ml的離心管中，冰浴至少30min，使細胞充分冷卻，4℃，4000rpm，離心5min收集細胞。
(4)小心棄上清液，用50ml冰預冷的無菌去離子水重懸菌體，4℃，4000rpm，離心5min。
(5)用25ml冰預冷的無菌去離子水再次重懸菌體。
(6)小心棄上清，用5ml冰預冷的1mol/l的山梨醇溶液重懸細胞菌體，4℃，4000rpm，離心5min。
(7)小心棄上清液，用1ml山梨醇重懸菌體，按每管80μl分裝備用。
重組質粒電轉化入畢赤酵母gs115感受態(tài)細胞的具體步驟如下：
(1)將10μl線性化的重組質粒ppiczαa-aplyz加入80μl畢赤酵母gs115感受態(tài)細胞中，冰上預冷10min。
(2)將電轉儀的電轉電壓調節(jié)到1.5kv。
(3)將冰浴后的混合液加入到0.2cm預冷的電轉杯中，輕扣幾下，使混合液沉到電轉杯底部，輕輕拭去電轉杯外的水。
(4)將電轉杯放入電轉儀中，電擊時間約5.0ms，電擊結束后立即加入1ml預冷的1mol/l的山梨醇溶液。
(5)將電擊后的菌液移入無菌離心管中，30℃靜置培養(yǎng)1h后加入500μlypd液體培養(yǎng)基輕輕混勻，繼續(xù)靜置復蘇1h。
(6)復蘇液涂布于含較低濃度zeocin(100μg/ml)抗性的ypds篩選平板上，每個平板涂布200μl，將全部復蘇液涂完。
(7)30℃恒溫靜置培養(yǎng)48h。
實施例3：構建胞內表達“青色熒光蛋白-tev蛋白酶的識別位點-黃色熒光蛋白”的大腸桿菌
大腸桿菌是一種典型的革蘭氏陰性菌，方便得到，易操作易培養(yǎng)，細胞壁具有脂多糖外膜，溶菌酶對其裂解效果較差。
根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫中查找到的熒光蛋白基因和tev蛋白酶的識別位點基因序列，合成兩端分別含有xhoi、noci酶切位點的“青色熒光蛋白-tev蛋白酶的識別位點-黃色熒光蛋白”基因序列。利用兩種限制性內切酶分別對含有該蛋白對基因的克隆質粒和表達質粒pet28a進行雙酶切，電泳回收所需片段。配制連接體系，將熒光蛋白對基因和表達質粒pet28a過夜連接，構建重組表達質粒。
取出bl21(de3)感受態(tài)細胞在冰上融化1-2min，將過夜連接體系全部加入感受態(tài)細胞中，冰浴30min后轉入42℃水浴90s，立即轉入冰中2-3min后，每管加入900μllb培養(yǎng)基，37℃200rpm復蘇1h。將復蘇好的菌懸液吸取100μl涂于含有卡那霉素的lb平板上。
利用pet28a通用引物，對平板上長出菌落進行菌落pcr擴增，驗證成功轉入質粒的大腸桿菌，然后進行發(fā)酵，發(fā)酵具體步驟如下：
1)將成功轉入重組表達質粒的大腸桿菌轉入50ml含有適量卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基(錐形瓶，250ml規(guī)格)，37℃搖床培養(yǎng)至od600為0.4-1之間，最好為0.6，大約3h。
2)取現(xiàn)制的濃度為100mm的iptg0.5ml加入一組培養(yǎng)基中，使其工作濃度為1mm(由于pet28a含有t7lac啟動子，如果其他質粒含有t7啟動子，則將iptg工作濃度稀釋為0.4mm)；另一組培養(yǎng)基不加iptg，作對照，將兩組繼續(xù)搖床培養(yǎng)3h。
3)將錐形瓶在冰上放置5min后，4℃5000×g離心5min，棄上清，菌體用1/4容器體積經預冷的無菌水重懸菌種，再次離心，4℃5000×g離心5min。
4)無菌水重懸菌種。
實施例4：篩選對大腸桿菌殺菌活性高的新型柞蠶溶菌酶
將ypd平板上長好的帶有溶菌酶基因的畢赤酵母，挑入裝有1mlbmgy培養(yǎng)基的96深孔板中，一個菌種挑入一個孔中，培養(yǎng)3天后，4000rpm離心20min，棄上清，每孔加入1ml的bmmy培養(yǎng)基，加入20μl甲醇，每隔24h每孔加入20μl甲醇誘導發(fā)酵表達，發(fā)酵72h后停止發(fā)酵。
將表達好的發(fā)酵液每孔吸取100μl，孔孔對應的轉移入透明的正常96孔板后，每孔再加入100μl水，吹打混勻，放入酶標儀中測得od600值。
向胞內表達熒光蛋白對的大腸桿菌菌懸液中，加入tev蛋白酶及tev蛋白酶緩沖液，加入量根據(jù)檢測量所需計算(檢測時，每孔加入150μl菌懸液、0.8μltev蛋白酶緩沖液和0.5μltev蛋白酶)，混合好后形成底物混合液，向黑色96孔板中每孔加入151μl底物混合液。
向黑色96孔板中每孔加入50μl發(fā)酵液(最后兩孔不加入發(fā)酵液，只加入底物混合液作為陰性對照)，立即吸打1-2次，放入酶標儀中進行檢測，激發(fā)波長為433nm，發(fā)射波長為475nm，每隔1min檢測一次，共檢測45min中，反應4h后，再檢測10min，每隔1min檢測一次。
檢測后，將數(shù)據(jù)經前文所說方法分析處理，得到含對大腸桿菌殺菌活性高的溶菌酶的酵母菌種，將菌種擴大培養(yǎng)，誘導發(fā)酵，進行復篩，將數(shù)據(jù)經前文所說方法分析處理，驗證其活性。提取最終得到的陽性酵母的全基因組，擴增目的基因并進行測序，得到具有高革蘭氏陰性菌殺菌活性的新型溶菌酶的基因序列。
應當注意的是，以上所述的實施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的任何限制。通過參照典型實施例對本發(fā)明進行了描述，但應當理解為其中所用的詞語為描述性和解釋性詞匯，而不是限定性詞匯?？梢园匆?guī)定在本發(fā)明權利要求的范圍內對本發(fā)明作出修改，以及在不背離本發(fā)明的范圍和精神內對本發(fā)明進行修訂。盡管其中描述的本發(fā)明涉及特定的方法、材料和實施例，但是并不意味著本發(fā)明限于其中公開的特定例，相反，本發(fā)明可擴展至其他所有具有相同功能的方法和應用。
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<110>北京工商大學
<120>一種新型廣譜溶菌酶的高通量篩選方法
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<213>柞蠶溶菌酶上游引物
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<213>柞蠶溶菌酶下游引物
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<213>人源溶菌酶4上游引物
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<213>人源溶菌酶4下游引物
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<213>人源溶菌酶基因6上游引物
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<213>柞蠶溶菌酶基因
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<170>手工
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<213>tev蛋白酶識別位點
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