用于檢測微小殘留病的方法、試劑以及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微小殘留病(MRD)診斷領(lǐng)域，其越來越多地應(yīng)用于評(píng)價(jià)患有血液惡性腫瘤患者的治療效力，例如B細(xì)胞前體急性淋巴細(xì)胞白血病(BCP-ALL)、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)和多發(fā)性骨髓瘤(MM)。所提供的獨(dú)特試劑組合物具有經(jīng)仔細(xì)選擇和徹底測試的抗體組合，對(duì)于≥8色流式細(xì)胞術(shù)染色以及對(duì)于10色和12色流式細(xì)胞術(shù)染色，其可達(dá)到至少10-4甚至低至10-5的靈敏度。本發(fā)明還提供了診斷試劑盒和用于檢測MRD的方法。
【專利說明】用于檢測微小殘留病的方法、試劑以及試劑盒
[0001] 本發(fā)明涉及癌癥診斷領(lǐng)域，更特別地涉及用于在治療期間和治療后監(jiān)測疾病發(fā)展 或者用于檢測微小播散性疾病的手段和方法。抑制細(xì)胞治療或細(xì)胞毒劑治療誘導(dǎo)大多數(shù)患 有淋巴樣惡性腫瘤患者中的緩解。然而，這些患者中的許多都會(huì)復(fù)發(fā)。顯然，雖然根據(jù)細(xì)胞 形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)它們達(dá)到了所謂的完全緩解，但是現(xiàn)有的抑制細(xì)胞治療或細(xì)胞毒劑治療方案不 能殺傷這些復(fù)發(fā)患者中的所有惡性細(xì)胞。因?yàn)榧?xì)胞形態(tài)學(xué)技術(shù)的檢出限不低于1%至5% 惡性細(xì)胞，所以顯然該技術(shù)僅可提供關(guān)于治療效力的表面信息，仍有多達(dá)10 1°的腫瘤細(xì)胞 潛在地留在體內(nèi)。
[0002] 需要靈敏度更高的技術(shù)來檢測"微小殘留?。╩inimal residual disease) "或微 小疾病（MRD)以獲得對(duì)誘導(dǎo)治療期間腫瘤塊的減少以及維持治療期間從一種或多于一種 組織中進(jìn)一步根除惡性細(xì)胞的更好理解。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測MRD通?；诮?jīng)由與惡性腫 瘤相關(guān)的表型特征來區(qū)別惡性細(xì)胞與正常白細(xì)胞，例如抗原的異常表達(dá)、過表達(dá)和跨系表 達(dá)。
[0003] 現(xiàn)有的4色和6色流式細(xì)胞術(shù)在多數(shù)患有血液惡性腫瘤（hematological malignancy)的患者中達(dá)到了 KT3(至KT4)的良好靈敏度。然而，應(yīng)注意在治療期間和治 療后以及在造血干細(xì)胞移植后，高頻正常再生細(xì)胞可妨礙血液、骨髓和其他體液（例如腦 脊髓液）中低頻惡性細(xì)胞的檢測。每種治療方案、每個(gè)治療階段、每段取樣時(shí)間的再生的程 度和模式存在差異，并且似乎取決于先前治療的強(qiáng)度：治療的強(qiáng)度越大，造血細(xì)胞的再生越 顯著。
[0004] 邏輯上，再生細(xì)胞的背景和藥物誘導(dǎo)的免疫表型偏移兩者均降低了現(xiàn)有4色和6 色流式細(xì)胞術(shù)MRD方法的靈敏性和特異性。這主要導(dǎo)致了以下方法：其中使用多種標(biāo)志物 的組合來評(píng)價(jià)患者的MRD或者另外使用一種或數(shù)種患者特異性的標(biāo)志物組合。認(rèn)識(shí)到需要 改進(jìn)MRD的診斷方法，本發(fā)明人著手于鑒定可用來獲得用于檢測MRD的更靈敏和更可靠測 定的另外的標(biāo)志物，特別地基于其中經(jīng)由多變量分析來組合多個(gè)標(biāo)志物信息的完全整合方 法。此外，該新方法不再限于個(gè)別患者，而是適用于特定疾病類別的每個(gè)患者，例如B細(xì)胞 前體急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-cell precursor acute lymphoblastic leukemia，BCP_ALL)、 B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病（B-cell chronic lymphocytic leukemia，B_CLL)和多發(fā)性骨 髓瘤（multiple myeloma，MM) 〇
[0005] 在仔細(xì)地選擇相關(guān)標(biāo)志物后，設(shè)計(jì)多色管中抗體的適當(dāng)組合并且選擇合適的熒光 染料（基于對(duì)亮度、補(bǔ)償、穩(wěn)定性等的需要）來開發(fā)抗體試劑集（set)。為了重塑（reshape) 并實(shí)現(xiàn)最佳功效，采用共有組（consensus panel)的廣泛多中心評(píng)價(jià)（extensive multicentric evaluation)對(duì)研宄進(jìn)行補(bǔ)充。本發(fā)明人仔細(xì)地選擇并且徹底地測試抗體組 合，設(shè)計(jì)了可達(dá)到KT4至KT 5靈敏度的新的彡8色染色。基于設(shè)計(jì)-測試-再設(shè)計(jì)-再測 試-再設(shè)計(jì)（等），已經(jīng)開發(fā)了針對(duì)每種疾病類別（例如BCP-ALL、B-CLL和MM)之熒光染 料綴合抗體的特異性組合。每位患者的一種或兩種多8色組合將允許以至少KT 4的靈敏度 仔細(xì)地進(jìn)行MRD監(jiān)測。所提供的10色和12色抗體組合甚至可更好地區(qū)別正常細(xì)胞和其惡 性對(duì)應(yīng)物，由此使得MRD檢測的靈敏度能夠低至10_ 5。
[0006] 我們在此提供了新的8色、10色和12色抗體組合，其用于檢測從患有以下疾病的 患者所分離樣品（例如，血液或骨髓）中的MRD :
[0007] -B細(xì)胞前體急性淋巴細(xì)胞白血病（BCP-ALL)
[0008] -B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血?。˙-CLL)或者
[0009] -多發(fā)性骨髓瘤（MM)和相關(guān)的衆(zhòng)細(xì)胞病（plasma cell disorder，PO)) 〇
[0010] 這些多色免疫染色可根據(jù)如Van Dongen等Leukemia 2012 ;26 :1908-1075和由 Kalina 等 Leukemia 2012 ;26 :1986-2010 所述的所謂的 EuroFlow 方案進(jìn)行。
[0011] 因此，本發(fā)明提供了用于對(duì)MRD進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測的獨(dú)特試劑組合物，其包 含至少八種不同的熒光染料綴合抗體的組合。特別地，所述試劑組合物用于檢測患有 BCP-ALUB-CLL或MM/P⑶患者的MRD。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物包含針對(duì)給定⑶ 抗原的單克隆抗體。CD代表簇命名并且是用于鑒定由單克隆抗體限定的特定細(xì)胞表面抗原 或細(xì)胞內(nèi)抗原的術(shù)語。針對(duì)所指定標(biāo)志物的（單克?。┛贵w可購自許多公司，包括Becton/ Dickinson (BD) Biosciences、Dako、Beckman Coulter，CYT0GN0S、Caltag、Pharmingen、 Exbic^ Sanq uiru Invitrogen 等。
[0012] 流式細(xì)朐術(shù)MRD檢測BCP-ALL
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于對(duì)人對(duì)象中的BCP-ALL細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞 術(shù)檢測的試劑組合物，其包含至少八種不同的熒光染料綴合抗體的組。BCP-ALL組包含針 對(duì)四種"核心標(biāo)志物"⑶10、⑶19、⑶20、⑶34和⑶45的抗體。優(yōu)選地，所述組還包含選自 針對(duì)⑶38、⑶81、CyIg μ和脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（NuTdT)之抗體的一種或更多種抗體。如果 所述組還包含一個(gè)或更多個(gè)選自以下的抗體集，則會(huì)獲得非常好的結(jié)果：(a)針對(duì)CD66c和 ⑶123的抗體集；(b)針對(duì)⑶304和⑶73的抗體集；以及（c)針對(duì)SmIg κ和SmIg λ的抗體 集，其中使每一個(gè)集內(nèi)的抗體與相同的熒光染料綴合。在一個(gè)特定方面中，所述BCP-ALL組 包含針對(duì) CDKK CD19、CD20、CD34、CD45 的抗體，選自針對(duì) CD38、CD81、CyIg μ、NuTdT 之抗 體的一種或更多種抗體以及選自以下的兩個(gè)或更多個(gè)抗體集：(a)針對(duì)CD66c和CD123的 抗體集；(b)針對(duì)⑶304和⑶73的抗體集；以及（c)針對(duì)SmIg κ和SmIg λ的抗體集，其中 使每一個(gè)集內(nèi)的抗體與相同的熒光染料綴合。
[0014] 例如，試劑組合物包含針對(duì)以下標(biāo)志物組合之一的不同的熒光染料綴合抗體：
[0015] (i)CD20、CD45、CD81、CD66c、CD123、CD34、CD19、CDlO 和 CD38,其中使針對(duì) CD66c 和CD123的抗體與相同的熒光染料綴合；
[0016] (ii)CD20、CD45、CD81、CD304、CD73、CD34、CD19、CDlO 和 CD38,其中使針對(duì) CD304 和CD73的抗體與相同的熒光染料綴合；
[0017] (iii)CD20、CD45、NuTdT、SmIgK、SmIgA、CyIgy、CD19、CD34 和 CD10,其中使針 對(duì)SmIg κ和SmIg λ的抗體與相同的熒光染料綴合。例如參見圖IA的8色BCP-ALL MRD。
[0018] 作為另一個(gè)實(shí)例，其包含針對(duì)標(biāo)志物⑶20、⑶45、⑶81、NuTdT、⑶34、⑶19、⑶10和 CD38的不同的熒光染料綴合抗體，以及選自以下的一個(gè)或更多個(gè)抗體集：（a)針對(duì)CD66c和 ⑶123的抗體集；(b)針對(duì)⑶304和⑶73的抗體集；以及（c)針對(duì)SmIg κ和SmIg λ的抗 體集，其中使每一個(gè)集內(nèi)的抗體與相同的熒光染料綴合。例如參見圖IB的10色管，其包含 針對(duì)標(biāo)志物 CD20、CD45、CD81、NuTdT、CD66c、CD123、CD304、CD73、CD34、CD19、CDlO 和 CD38 的抗體。
[0019] 在另一個(gè)特定方面中，所述組合物包含針對(duì)標(biāo)志物⑶20、⑶45、⑶81、NuTdT、 CD66c、CD123、CD304、CD73、SmIg κ、SmIg λ、CyIg μ、CD34、CD19、CDlO 和 CD38 的熒光染料 綴合抗體的組合，其中使針對(duì)CD66c/CD123、CD304/CD73和SmIg κ /SmIg λ中每一個(gè)集的抗 體與相同的熒光染料綴合。例如參見圖IC的12色管。
[0020] 本發(fā)明所用的用來綴合針對(duì)所述標(biāo)志物之抗體的適當(dāng)熒光染料在本領(lǐng)域中是已 知的。應(yīng)當(dāng)理解，試劑組合物內(nèi)所用的熒光染料應(yīng)當(dāng)通過流式細(xì)胞術(shù)來彼此區(qū)分。針對(duì)亮 度、有限的光譜重疊和有限的補(bǔ)償需求、穩(wěn)定性等來優(yōu)先選擇熒光染料（參見=Kalina等 Leukemia 2012 ：26 :1986-2010)〇
[0021] 以下的熒光染料的組特別用于根據(jù)本發(fā)明的BCP-ALL試劑組合物：（I)Pacific blue(PacB)，brilliant violet 421(BV421)或Horizon V450，（2)pacific orange(PacO)、 Horizon V500(HV500)、BV510、Khrome orange (KO)或 0C515，（3)異硫氰酸熒光素（FITC) 或Alexa488,（4)藻紅蛋白（PE)，（5)多甲藻素葉綠素蛋白/花菁5. 5(PerCP-Cy5. 5)，PerCP 或PE-TexasRed，（6)藻紅蛋白/花菁7(PE-Cy7)，（7)別藻藍(lán)蛋白（APC)或Alexa647,以及 (8)別藻藍(lán)蛋白 /hilite 7(APC-H7)、APC-Cy7、Alexa680、APC-A750、APC-C750 或 Alexa700〇 在多輪測試之后，本發(fā)明人觀察到如果選擇以下的熒光染料，則可獲得非常好的結(jié)果： Pacific Blue、brilliant violet 421 或 Horizon V450、Pac0 或 Horizon V500、FITC、PE、 PerCP-Cy5. 5、PE-Cy7、APC 和 APC-H7 或 APC-A750 或 APC-C750。在一個(gè)特定方面中，本發(fā)明 提供了在表1、圖1A、圖IB或圖IC中示出的試劑組合物。
[0022] 表1用于BCP-ALL MRD檢測的示例性試劑組合物
[0023] 圖IA本發(fā)明8色BCP-ALL MRD組的標(biāo)志物組合物
【權(quán)利要求】
1. 一種用于對(duì)人對(duì)象中的B細(xì)胞前體ALL@CP-ALL)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測的試劑組合 物，其包含至少八種不同的巧光染料綴合抗體的組，所述組至少包含針對(duì)核屯、標(biāo)志物CD10、 CD19、CD20、CD34 和 CD45 的抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑組合物，其中所述組還包含選自針對(duì)CD38XD81、切Igy 和脫氧核巧酸轉(zhuǎn)移酶（NuTdT)之抗體的一種或更多種抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑組合物，其中所述組還包含一個(gè)或更多個(gè)選自W下 的抗體集： (a)針對(duì)CD66C和CD123的抗體集； 化）針對(duì)CD304和CD73的抗體集；W及(C)針對(duì)SmIgK和SmIgA的抗體集。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑組合物，其中使每一個(gè)集內(nèi)的抗體與相同的巧光染料綴 合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的試劑組合物，其包含針對(duì)W下標(biāo)志物組合之一 的不同的巧光染料綴合抗體： (i) CD20、CD45、CD81、CD66C、CD123、CD34、CD19、CD10 和 CD38,其中使針對(duì) CD66C 和 CD123的抗體與相同的巧光染料綴合； (ii) CD20、CD45、CD81、CD304、CD73、CD34、CD19、CD10 和 CD38,其中使針對(duì) CD304 和 CD73的抗體與相同的巧光染料綴合； (iii) CD20、CD45、NuTdT、SmIgK、SmIgA、切Igy、CD19、CD：M 和 CD10,其中使針對(duì) SmIgK和SmIgA的抗體與相同的巧光染料綴合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑組合物，其包含針對(duì)標(biāo)志物CD20、CD45、CD81、NuTdT、 CD66c、CD123、CD304、CD73、CD34、CD19、CD10和CD38的不同的巧光染料綴合抗體，W及選 自W下的一個(gè)或更多個(gè)抗體集： (a)針對(duì)CD66C和CD123的抗體集； 化）針對(duì)CD304和CD73的抗體集；W及 (C)針對(duì)SmIgK和SmIgA的抗體集，其中使每一個(gè)集內(nèi)的抗體與相同的巧光染料綴 么 口 〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑組合物，其包含針對(duì)標(biāo)志物CD20、CD45、CD81、NuTdT、 〔066。、〔0123、〔0304、〔073、51111肖1〇、51111肖^、切1肖^、〔0：34、〔019、〔010和〔038的不同的巧 光染料綴合抗體，其中使針對(duì)CD66c/CD123、CD304/CD73和Smig K /Smig A中每一個(gè)集的抗 體與相同的巧光染料綴合。
8. -種用于對(duì)人對(duì)象中的慢性淋己細(xì)胞白血病（CLL)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測的試劑 組合物，其包含至少八種不同的巧光染料綴合抗體的組，所述組至少包含針對(duì)核屯、標(biāo)志物 CD5、CD27、CD79b、CD3、CD200、CD81 和 CD19 的抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑組合物，其中將CD22和/或受體酪氨酸激酶樣孤兒受體 1 (R0R1)用作另外的標(biāo)志物，優(yōu)選與CD43和CD38組合。
10. -種用于對(duì)人對(duì)象中的MM或PCD進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測的試劑組合物，其包含至少 八種不同的巧光染料綴合抗體的組，所述組至少包含針對(duì)核屯、標(biāo)志物CD138、CD38、CD56和 〔019的抗體，其補(bǔ)充有選自〔027、〔0117、〔081、〔0229、〔045、切1肖1〇和切1肖\的至少四種 另外的標(biāo)志物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑組合物，其中CD45是第五標(biāo)志物，優(yōu)選與標(biāo)志物 CD27、CD117和CD81組合或與標(biāo)志物CD229、切IgK和切IgA組合。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的試劑組合物，其包含針對(duì)W下標(biāo)志物組合之一的不同 的巧光染料綴合抗體： (iv)CD45、CD138、CD38、CD56、CD27、CD19、CD117 和CD81 (V)CD45、CD138、CD38、CD56、CD229、CD19、切IgK和切Ig入 (vi) CD138、CD27、CD38、CD56、CD45、CD19、CD117 和 CD81 (vii) CD138、CD27、CD38、CD56、CD229、CD19、Cylg K和切Ig入 (￥111)〔0138、〔027、〔038、〔056、〔045、〔019、切1肖1〇和切1徑入。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑組合物，其包含針對(duì)標(biāo)志物CD138、CD27、CD38、CD56、 CD45、CD19、CD117、CD81的不同的巧光染料綴合抗體W及選自W下的一個(gè)或兩個(gè)抗體集； (a)針對(duì)CD229和CD28的抗體集； 化）針對(duì)切IgK和切IgA的抗體集。
14. 一種用于對(duì)微小殘留?。∕RD)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測的診斷試劑盒，其包含根據(jù)權(quán) 利要求1至13所述的至少一種試劑組合物，任選地帶有使用說明書、緩沖劑和/或?qū)φ諛?品。
15. -種用于檢測含有細(xì)胞的生物樣品中微小殘留?。∕RD)的多色流式細(xì)胞術(shù)方法， 所述細(xì)胞優(yōu)選為淋己細(xì)胞，所述方法包括W下步驟： (i) 用根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的試劑組合物對(duì)樣品進(jìn)行染色， (ii) 對(duì)所述樣品進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)； (iii) 就由存在于所述試劑組合物中的抗體所檢測的選定標(biāo)志物的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞設(shè)口； W及 (iv) 基于所述多個(gè)標(biāo)志物的表達(dá)譜來區(qū)分正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中步驟（iv)包括多變量分析，優(yōu)選主成分分析 (PCA)〇
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK104471393SQ201380037624
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月14日
【發(fā)明者】雅各布斯·約翰內(nèi)斯·瑪麗亞·萬東恩, 何塞·阿爾貝托·奧爾方德馬托斯克瑞亞埃韋爾, 朱安·亞歷杭德羅·弗洛雷斯蒙特羅, 茱莉亞·瑪麗亞·阿爾梅達(dá)帕拉, 文森特·亨利庫斯·約翰內(nèi)斯·萬德費(fèi)爾登, 塞巴斯蒂安·博埃特赫爾, 朗托尼·威廉·朗格拉克, 埃斯特爾·邁斯特日科娃, 托馬斯·什切潘斯基, 馬蒂亞斯·里特根, 保羅·約根·蒙泰羅達(dá)席爾瓦盧西奧 申請(qǐng)人:鹿特丹伊拉斯姆斯大學(xué)醫(yī)療中心