本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于pgm高通量測序儀檢測幽門螺桿菌特異性基因、幽門螺桿菌耐藥基因和宿主藥物代謝酶cyp2c19基因的方法。

背景技術(shù)：

幽門螺桿菌(helicobacterpylori，簡稱hp)是一種定植在胃粘膜上皮與粘液之間的革蘭氏陰性螺旋狀桿菌。自marshall和warren首次用微需氧技術(shù)分離出幽門螺桿菌后，人們相繼發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌與慢性胃炎、消化道潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(malt)密切相關(guān)，幽門螺桿菌感染也是胃癌發(fā)生的重要誘因之一。

隨著抗生素的廣泛使用，幽門螺桿菌對抗生素的耐藥性逐年增加，傳統(tǒng)的幽門螺桿菌治療方案的根除率也在降低。目前幽門螺桿菌根除治療失敗的原因包括抗生素的選擇不當(dāng)、患者依從性差和ppi代謝差異等，其中細(xì)菌耐藥，尤其是克拉霉素耐藥是最主要的原因。

克拉霉素的耐藥機(jī)制為細(xì)菌23srrna核苷酸可變區(qū)v區(qū)突變導(dǎo)致核糖體構(gòu)象發(fā)生改變，使克拉霉素與幽門螺桿菌的親和力降低，從而不能夠有效的阻止細(xì)菌進(jìn)行蛋白質(zhì)合成，產(chǎn)生耐藥性。常見的突變有a2142g、a2143g、a2143c，也有一些其他的突變a2115g、g2141a、t2117c、t2182c、t2289c、g2224a、c2245t、c2611a等，其中以a2143g最為常見。喹諾酮的耐藥是由其作用靶位，革蘭氏陰性菌的dna旋轉(zhuǎn)酶(由gyra基因編碼，負(fù)責(zé)dna的裂解和重排)的變化導(dǎo)致的。當(dāng)gyra的喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)(qrdr)發(fā)生突變時(shí)，喹諾酮類藥物不能與之結(jié)合，從而不能影響dna的二級結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性。常見的突變有asn87lys、ala88val、asp91gly/asn/ala/tyr、ala97val四種，asp86asn較為少見，其中87和91突變在大多數(shù)的耐藥菌株中均有發(fā)現(xiàn)，并且與高耐藥性相關(guān)。有一項(xiàng)關(guān)于幽門螺桿菌的根除失敗案例指出克拉霉素耐藥是由患者體內(nèi)占較少比例的克拉霉素耐藥菌株導(dǎo)致的，目前還沒有較好的檢測方法來檢測患者體內(nèi)幽門螺桿菌的耐藥和敏感菌株的比例。

另一個(gè)影響幽門螺桿菌根除治療的因素與細(xì)胞色素p450同工酶cyp2c19的基因多態(tài)性有關(guān)，該基因類型決定了人體對某些ppi代謝的快慢。編碼正常酶活性的基因是cyp2c19*1，cyp2c19等位基因主要有*1，*2，*3......*17，其中最為常見的是等位基因*2和*3。cyp2c19基因的多態(tài)性可分為強(qiáng)代謝者(extensivemetabolizer，em)、中代謝者(intermediatemetabolizer，im)和弱代謝者(poormetabolizer，pm)。倘若對所有患者按照同一藥物劑量治療，不考慮其自身的代謝類型，可能會(huì)出現(xiàn)個(gè)體反應(yīng)和藥物毒副作用。因此，快速、準(zhǔn)確地確定患者cyp2c19基因型及代謝類型，對選擇針對性藥物及劑量并展開及時(shí)的治療干預(yù)是至關(guān)重要的。

目前幽門螺桿菌的常用檢測方法分為兩大類：一類是侵入式檢測方式，包括活組織切片染色法、快速尿素酶法、細(xì)菌培養(yǎng)法以及pcr的方法；另一類是非侵入式檢測技術(shù)，包括¹³c或¹⁴c-尿素酶呼氣試驗(yàn)、血清免疫學(xué)檢驗(yàn)以及糞便抗原檢測等。非侵入式檢測技術(shù)雖然無痛、方便但是容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果，特異性不高；侵入式檢測技術(shù)中，細(xì)菌培養(yǎng)的方法是最準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，被認(rèn)為是診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是具有檢測周期較長，培養(yǎng)復(fù)雜，容易產(chǎn)生污染等問題。因此迫切需要一種快速檢測幽門螺桿菌感染情況的方法。通過結(jié)合pgm測序，我們不僅可以很好的實(shí)現(xiàn)幽門螺桿菌耐藥性和宿主藥物代謝酶類型的檢測，而且可以同時(shí)解決通量低的問題，非常適用于科學(xué)和臨床檢測。

pgm測序儀主要的工作原理是通過dna聚合酶將一個(gè)核苷酸滲入到dna分子中時(shí)釋放出的一個(gè)h質(zhì)子，導(dǎo)致局部ph值發(fā)生變化，這種變化被離子傳感器檢測到，使得化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號。該法是直接檢測dna合成，不需要掃描，攝像機(jī)，熒光等環(huán)節(jié)，幾秒鐘就可檢測合成插入的堿基，大大縮短了運(yùn)行時(shí)間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是提供一種準(zhǔn)確、快速、檢測流程簡單的方法，可以同時(shí)檢測幽門螺桿菌特異性、耐藥基因和宿主cyp2c19基因多態(tài)性位點(diǎn)，并能夠更加科學(xué)、安全、快速、準(zhǔn)確指導(dǎo)幽門螺桿菌感染患者的用藥。

為實(shí)現(xiàn)以上目的，設(shè)計(jì)覆蓋vaca、23srrna、gyra、cyp2c19*2、cyp2c19*3基因待測區(qū)域的特異性引物，擴(kuò)增產(chǎn)物在180-220bp。

進(jìn)一步的，將各正向引物的5’端加上gcgtgtctccgactcag-bracode-gat-特異引物，各反向引物5’端加上cctctctatgggcagtcggtgat-特異引物。

進(jìn)一步的，將5對引物按照特定的比例合并，形成primerpool。

進(jìn)一步的，裂解胃黏膜組織樣本，同時(shí)提取宿主和幽門螺桿菌基因組。

進(jìn)一步的，利用primerpool擴(kuò)增出待測樣本耐藥區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物，并純化。

進(jìn)一步的，使用通用引物：a端：生物素-ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag，p1端：cctctctatgggcagtcggtgat進(jìn)行文庫制備、純化、定量；

進(jìn)一步的，通過onetouch2儀器和相關(guān)試劑進(jìn)行油包水?dāng)U增，再用iontorrentpgm測序儀進(jìn)行測序；對測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控和分析，濾去接頭等序列，比對耐藥區(qū)域和藥物代謝酶基因多態(tài)性位點(diǎn)，根據(jù)突變r(jià)eads/未突變r(jià)eads，計(jì)算出耐藥比例和藥物代謝酶類型。

本方法只需要簡單的對胃黏膜樣本進(jìn)行裂解處理，即可獲得幽門螺桿菌和宿主的全基因組。設(shè)計(jì)出幽門螺桿菌的特異性、耐藥和宿主藥物代謝酶cyp2c19基因，利用多重pcr技術(shù)將這些待測片段在一個(gè)pcr反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，結(jié)合通用引物的擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)待測樣本的文庫構(gòu)建，一次測序即可獲得幽門螺桿菌感染情況、耐藥情況及宿主藥物代謝酶cyp2c19基因多態(tài)性類型。該方法設(shè)計(jì)合理、操作流程簡單、檢測結(jié)果快速、準(zhǔn)確、通量極高，可以滿足不同科研和臨床的檢測需求，有利于指導(dǎo)臨床關(guān)于幽門螺桿菌的檢測和根除，為幽門螺桿菌感染治療提供分子基礎(chǔ)。

此外，本發(fā)明的方法配合使用lifetechnologies公司的個(gè)體化基因測序儀iontorrentpgm，此款測序儀相比較于其他測序儀具有更加簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、靈活的優(yōu)勢，整個(gè)建庫流程1天即可，測序也只需要3小時(shí)，相對于其他測序平臺更加快捷，還可以根據(jù)測序樣本的多少，選擇合適的芯片即可避免測序數(shù)據(jù)的浪費(fèi)，操作空間相當(dāng)靈活多變，非常適合科學(xué)研究和臨床檢測。

附圖說明

圖1是文庫質(zhì)控agilent2100檢測圖

圖2是克拉霉素耐藥位點(diǎn)分析圖

具體實(shí)施方式

為了使相關(guān)領(lǐng)域的科研人員和臨床工作人員能夠更好的理解本發(fā)明方案，下面結(jié)合實(shí)施方式和附圖予以詳細(xì)說明。但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施方式。

實(shí)施例1

設(shè)計(jì)覆蓋vaca、23srrna、gyra、cyp2c19*2、cyp2c19*3基因待測區(qū)域的特異性引物，擴(kuò)增產(chǎn)物在180-220bp，具體見表1。

表1基因待測區(qū)域的特異性引物

在上述設(shè)計(jì)好的引物的正向引物5’端加上gcgtgtctccgactcag-bracode-gat-特異引物，各反向引物5’端加上cctctctatgggcagtcggtgat-特異引物。其中barcode1的序列為ctaaggtaac，不同的樣本必須使用不同的barcode序列，以便樣本之間的區(qū)分，其余barcode序列在lifetechnologies公司的官方網(wǎng)站上均可查詢。具體見表2，其中紅色加粗部分為barcode1序列。

表2含barcode1序列的引物

3.primerpool中這些引物的混合比例為：23srrna∶cyp2c19*2∶cyp2c19*3∶gyra∶vaca＝2∶1∶1∶1.2∶1.5。

實(shí)施例2

提取胃黏膜中的基因組

(1)在無菌的2ml圓底ep管中，加入100μl組織裂解液和一個(gè)直徑3mm的無菌鋼珠；

(2)將胃黏膜組織從樣本保存液中取出，轉(zhuǎn)移至含有裂解液和鋼珠的2ml圓底ep管中；

(3)組織研磨儀研磨樣本，參數(shù)為室溫條件下50hz，60s；

(4)充分研磨后，短暫離心，將勻漿液體轉(zhuǎn)移至新的無菌1.5mlep管中；

(5)將含有勻漿組織的1.5mlep管置于95℃金屬浴中孵育10分鐘，中間可顛倒數(shù)次；

(6)迅速將ep置于4℃冰箱中孵育30分鐘；

(7)冰箱中取出ep管，12000轉(zhuǎn)離心，5分鐘，收集上清到新的ep管中，即可得到宿主和細(xì)菌的全基因組。

實(shí)施例3

目的片段的擴(kuò)增和純化

(1)用按照比例混合好的pcr引物配制如下反應(yīng)體系：反應(yīng)總體系20μl，其中2*phusionhfbufferpcrmastermix10μl，模板2μl，引物2μl，ddh2o6μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3分鐘，循環(huán)內(nèi)95℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，18個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5分鐘。

(2)在20μl擴(kuò)增產(chǎn)物中加入24μlagencourtampurexpbeads磁珠，吹打混勻，室溫放置5min。待液體變清，吸棄上清，緩慢加入200μl80％乙醇洗滌，30s后吸棄乙醇，并重復(fù)一次。乙醇揮發(fā)后，待磁珠中心開始干裂即加入40μl水進(jìn)行洗脫，室溫靜置5min。待液體變清，吸取35μl上清至新的潔凈離心管中，即得到純化后的pcr產(chǎn)物。

實(shí)施例4

測序文庫的構(gòu)建、純化、定量、質(zhì)控、測序

(1)利用pcr的方法完成文庫構(gòu)建，反應(yīng)總體系20μl，包括2*phusionhfbufferpcrmastermix10μl，純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物5μl，引物a+p1混合物2μl，ddh2o6μl，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3分鐘，循環(huán)內(nèi)95℃變性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，18個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5分鐘，10℃保存。

(2)取以上反應(yīng)中20μl擴(kuò)增產(chǎn)物加入24μlagencourtampurexpbeads磁珠吹打混勻，室溫放置5min。待液體變清，棄上清，緩慢加入200μl80％乙醇洗滌，30s后吸棄乙醇，并重復(fù)一次。乙醇揮發(fā)后，待磁珠中心開始干裂即加入40μllowte進(jìn)行洗脫，室溫靜置5min。待液體變清，吸取35μl上清至新的潔凈離心管中，即得到純化后的文庫產(chǎn)物。

(3)采用qpcr熒光定量的方法結(jié)合lifetechnologies的hid-ionampliseq^tmlibrarypreparation試劑盒進(jìn)行文庫的定量，簡單的操作流程如下：

1)標(biāo)準(zhǔn)對照文庫的稀釋，對標(biāo)準(zhǔn)的對照文庫進(jìn)行3次稀釋。std1：5μlcontrollibrary+45μlddh2o混合均勻，濃度為6.8pm；std2：5μlstd1+45μlddh2o混合均勻，濃度為0.68pm；std3：5μlstd2+45μlddh2o混合均勻，濃度為0.068pm；

2)將待測文庫的稀釋500倍，即2μl文庫+998μlddh2o，充分混合均勻；

3)qpcr反應(yīng)體系的配制：ionlibraryqpcrmix10μl+ionlibraryquantitationassay1μl+9μl待測稀釋文庫/稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品/陰性對照，所有的待測樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照都要做一個(gè)重復(fù)；

4)qpcr檢測，將反應(yīng)體系混合均勻后，即可進(jìn)行定量檢測，qpcr程序如下：50℃hold2min；95℃hold20s；循環(huán)內(nèi)95℃3s，60℃32s，40個(gè)循環(huán)。

5)根據(jù)qpcr結(jié)果得出的稀釋后的樣本濃度即可換算出原始樣本的濃度。

(4)文庫質(zhì)控主要是看文庫的大小和文庫的純度，擴(kuò)增子的大小要滿足預(yù)期pcr產(chǎn)物的大小，盡量要求無雜帶，以防數(shù)據(jù)的浪費(fèi)，具體的操作流程參考agilent2100bioanalyzer和其配套試劑盒highsensitivitydnakit&reagents的使用說明。agilent2100highsensitivitydnakit文庫質(zhì)控檢測圖參考圖1。

(5)質(zhì)控合格后的文庫，對文庫進(jìn)行富集和純化，具體的操作流程參照ionpgm^tmtemplateot2200kit的使用說明書。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)測序儀的使用和樣本的測序，按照ionpgm^tmsequencing200kitv2的說明書進(jìn)行，測序要求每個(gè)樣本的平均測序深度應(yīng)不低于1000x，每個(gè)樣本占用的數(shù)據(jù)量大約在1mb。

pgm測序結(jié)束后，通過數(shù)據(jù)的質(zhì)控濾去測序數(shù)據(jù)較差的reads、去掉接頭，對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，通過比對分析突變得到不同胃黏膜樣本的幽門螺桿菌的感染情況、耐藥情況以及宿主藥物代謝酶類型，深度發(fā)掘數(shù)據(jù)，計(jì)算突變菌株和未突變菌株的比例，可得到混合感染中耐藥和敏感菌株的比例，其中克拉霉素耐藥位點(diǎn)分析可參考圖2。