一種鋅指核酸酶介導(dǎo)的豬mstn基因突變序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鋅指核酸酶介導(dǎo)的豬MSTN基因突變序 列及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鋅指核酸酶（ZincFingerNuclease，ZFN)是一種由鋅指蛋白和FokI核酸內(nèi)切酶 的剪切結(jié)構(gòu)域重組形成的嵌合蛋白，其中鋅指蛋白可特異性結(jié)合目的靶序列，F(xiàn)okI核酸內(nèi) 切酶則負(fù)責(zé)對(duì)DNA序列進(jìn)行特異性剪切。當(dāng)兩個(gè)ZFN分別結(jié)合到位于DNA的雙鏈上間隔5 至7個(gè)堿基的目的靶序列后，可形成二聚體，進(jìn)而激活FokI核酸內(nèi)切酶的功能，使DNA在特 定位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈斷裂，再通過(guò)同源重組或非同源末端連接修復(fù)斷裂雙鏈。由于非同源末端 連接修復(fù)的可變性導(dǎo)致突變類型的不可預(yù)知性，因此通過(guò)篩選可以獲得靶基因多種突變類 型的細(xì)胞克隆。
[0003]MSTN又稱生長(zhǎng)分化因子-8(Growthdifferentiationfactor-8,GDF-8)，屬于轉(zhuǎn) 化生長(zhǎng)因子-0(Transforminggrowthfactor- 0，TGF- 0 )超家族，是骨豁肌發(fā)育的主要 負(fù)調(diào)控因子。該基因在不同物種間高度保守，而且在牛、人、羊及狗等物種上都發(fā)現(xiàn)了由于 MSTN自然突變而導(dǎo)致肌肉肥大，俗稱"雙肌"的現(xiàn)象。但到目前為止，未見(jiàn)由于豬的MSTN自 然或人工突變導(dǎo)致"雙肌"表型的報(bào)道。豬不僅是重要的肉食來(lái)源，而且由于其生理特性與 人類相似，又是非常好的疾病動(dòng)物模型。因此，對(duì)豬的MSTN進(jìn)行突變研究具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種DNA分子。
[0005] 本發(fā)明提供的DNA分子是如下1)或2)或3)的DNA分子：
[0006] 1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0007] 2)與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼相同蛋白質(zhì)的 DNA分子；
[0008] 3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼相同蛋白質(zhì)的DNA分 子。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述DNA分子的新用途。
[0010] 本發(fā)明提供了上述DNA分子在檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)豬的肌肉含量和/或瘦肉率和 /或脂肪含量中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明還提供了上述DNA分子在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)豬的肌肉含量和/或瘦 肉率和/或脂肪含量的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)豬的肌肉含量和/或瘦肉 率的方法。
[0013] 本發(fā)明提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)豬的肌肉含量和/或瘦肉率的方法包括如下 步驟：是檢測(cè)待測(cè)豬的兩條同源染色體上的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子是否發(fā)生 缺失和第3800位核苷酸分子是否由T突變?yōu)镚，以確定待測(cè)豬的基因型為野生型、雙等位基 因突變型還是單等位基因突變型，并根據(jù)所述待測(cè)豬的基因型確定所述待測(cè)豬的肌肉含量 和/或瘦肉率：基因型為雙等位基因突變型的待測(cè)豬的肌肉含量和/或瘦肉率高于或候選 高于基因型為單等位基因突變型的待測(cè)豬，基因型為單等位基因突變型的待測(cè)豬的肌肉含 量和/或瘦肉率高于或候選高于基因型為野生型的待測(cè)豬；
[0014] 所述雙等位基因突變型為兩條同源染色體的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分 子均發(fā)生缺失，且第3800位核苷酸分子均由T突變?yōu)镚的基因型；
[0015] 所述單等位基因突變型為一條同源染色體的MSTN基因第3782-3796位核苷酸 分子發(fā)生缺失且第3800位核苷酸分子由T突變?yōu)镚，且另一條同源染色體的MSTN基因第 3782-3796位核苷酸分子未發(fā)生缺失且第3800位核苷酸分子未由T突變?yōu)镚的基因型；
[0016] 所述野生型為兩條同源染色體的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子均未發(fā)生 缺失且第3800位核苷酸分子均未由T突變?yōu)镚的基因型；
[0017] 所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。
[0018] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)豬的脂肪含量的方法。
[0019] 本發(fā)明提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)豬的脂肪含量的方法包括如下步驟：是檢測(cè)待 測(cè)豬的兩條同源染色體上的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子是否發(fā)生缺失和第3800 位核苷酸分子是否由T突變?yōu)镚，以確定待測(cè)豬的基因型為野生型、雙等位基因突變型還是 單等位基因突變型，并根據(jù)所述待測(cè)豬的基因型確定所述待測(cè)豬的脂肪含量：基因型為雙 等位基因突變型的待測(cè)豬的脂肪含量低于或候選低于基因型為單等位基因突變型的待測(cè) 豬，基因型為單等位基因突變型的待測(cè)豬的脂肪含量低于或候選低于基因型為野生型的待 測(cè)豬；
[0020] 所述雙等位基因突變型為兩條同源染色體的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分 子均發(fā)生缺失，且第3800位核苷酸分子均由T突變?yōu)镚的基因型；
[0021 ] 所述單等位基因突變型為一條同源染色體的MSTN基因第3782-3796位核苷酸 分子發(fā)生缺失且第3800位核苷酸分子由T突變?yōu)镚，另一條同源染色體的MSTN基因第 3782-3796位核苷酸分子未發(fā)生缺失且第3800位核苷酸分子未由T突變?yōu)镚的基因型；
[0022] 所述野生型為兩條同源染色體的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子均未發(fā)生 缺失且第3800位核苷酸分子均未由T突變?yōu)镚的基因型；
[0023] 所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。
[0024] 上述方法中，所述檢測(cè)待測(cè)豬的兩條同源染色體上的MSTN基因第3782-3796位核 苷酸分子是否發(fā)生缺失和第3800位核苷酸分子是否由T突變?yōu)镚的方法為測(cè)序。
[0025] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種培育高瘦肉率和/或高肌肉含量和/或低脂肪含 量的豬的方法。
[0026] 本發(fā)明提供的培育高瘦肉率和/或高肌肉含量和/或低脂肪含量的豬的方法包括 選擇上述雙等位基因突變型或單等位基因突變型的豬進(jìn)行育種。
[0027] 本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)豬的肌肉含量和/或瘦肉 率和/或脂肪含量的方法。
[0028] 本發(fā)明提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)豬的肌肉含量和/或瘦肉率和/或脂肪含量包 括如下步驟：是檢測(cè)待測(cè)豬的兩條同源染色體上的MSTN基因?yàn)殡p等位基因突變型、單等位 基因突變型還是野生型；
[0029] 所述野生型為兩條同源染色體上的MSTN基因均為野生型MSTN基因；
[0030] 所述雙等位基因突變型為兩條同源染色體上的MSTN基因均為突變型MSTN基因；
[0031] 所述單等位基因突變型為一條同源染色體上的MSTN基因?yàn)橥蛔冃蚆STN基因，且 另一條同源染色體上的MSTN基因?yàn)橐吧蚆STN基因；
[0032] 所述突變型MSTN基因的序列如序列表中序列1所示；
[0033] 所述野生型MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。
[0034] 本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供一種制備高瘦肉率和/或高肌肉含量和/或低脂肪含 量的豬的方法。
[0035] 本發(fā)明提供的制備高瘦肉率和/或高肌肉含量和/或低脂肪含量的豬的方法包括 如下步驟：將豬的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子發(fā)生缺失且第3800位核苷酸分子 由T突變?yōu)镚，得到瘦肉率提高和/或肌肉含量提高和/或脂肪含量降低的豬。
[0036] 上述方法中，所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。
[0037] 本發(fā)明的第八個(gè)目的是提供一種將豬的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子發(fā) 生缺失且第3800位核苷酸分子由T突變?yōu)镚的方法或產(chǎn)品的新用途。
[0038] 本發(fā)明提供了將豬的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子發(fā)生缺失且第3800位 核苷酸分子由T突變?yōu)镚的方法或產(chǎn)品在制備瘦肉率提高和/或肌肉含量提高和/或脂肪 含量降低的豬中的應(yīng)用。
[0039] 上述應(yīng)用中，所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。
[0040] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供將豬的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子發(fā)生 缺失且第3800位核苷酸分子由T突變?yōu)镚的產(chǎn)品。
[0041] 本發(fā)明提供的將豬的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子發(fā)生缺失且第3800位 核苷酸分子由T突變?yōu)镚的產(chǎn)品包括TALENmRNA對(duì)和DonorDNA。
[0042] 上述產(chǎn)品中，所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。
[0043] 上述產(chǎn)品中，所述DonorDNA的序列如序列表中序列5所示；所述TALENmRNA對(duì) 是根據(jù)唯尚立德Talen試劑盒制備得到的一對(duì)TALENmRNA。
[0044] 上述產(chǎn)品中，所述TALENmRNA對(duì)是將Talen左臂和Talen右臂混合得到的，Talen 左臂和Talen右臂主要使用唯尚立德Talen試劑盒中的以下模塊制備得到的：從產(chǎn)品盒A 和產(chǎn)品盒B中選取以下模塊：GC1、T2、GT3、AA4、CC5、TT6、CC7、CA8和GG9制備Talen左臂； 從產(chǎn)品盒A和產(chǎn)品盒B中選取以下模塊：CA1、G2、TA3、AA4、CT5、CT6、TA7、CC8和AG9制備 Talen右臂。上述產(chǎn)品盒A和產(chǎn)品盒B均為唯尚立德Talen試劑盒中的產(chǎn)品。
[0045] 本發(fā)明利用鋅指核酸酶技術(shù)介導(dǎo)豬的肌肉生成抑制素（Myostatin，MSTN)基因發(fā) 生堿基缺失，造成移碼突變，導(dǎo)致翻譯提前終止無(wú)法形成MSTN功能蛋白，并獲得了MSTN基 因第3782-3796位核苷酸缺失且第3800位核苷酸由T突變?yōu)镚的突變序列。通過(guò)試驗(yàn)證 明：MSTN基因的第3782-3796位核苷酸缺失且第3800位核苷酸由T突變?yōu)镚的豬表現(xiàn)明 顯的雙肌表型，肌肉量和瘦肉率都顯著增加，脂肪含量明顯降低。
【附圖說(shuō)明】
[0046] 圖1為ZFN的特異結(jié)合位點(diǎn)和特異敲除靶位點(diǎn)序列。
[0047] 圖2為ZFN定點(diǎn)敲除MSTN基因載體圖。
[0048] 圖3為ZFN定點(diǎn)敲除MSTN特異位點(diǎn)原理圖。
[0049] 圖4為MSTN基因突變序列與野生型序列比對(duì)圖。
[0050] 圖5為三種基因型（MSTN+/+、MSTN+/、MSTN7)梅山豬MSTN基因cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的 瓊脂糖凝膠結(jié)果檢測(cè)圖。
[0051] 圖6為MSTN基因缺失突變后該基因的DNA、cDNA及氨基酸序列變化示意圖。
[0052] 圖7為MSTN基因在三種基因型（MSTN+/+、MSTN+/、MSTN7)梅山豬