專利名稱：畢赤酵母表達重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蛋白工程技術領域，具體涉及一種畢赤酵母表達重組類人膠原蛋白的 生產(chǎn)方法。
背景技術：
膠原蛋白是體內(nèi)含量最多的一種蛋白質(zhì)，約占人體蛋白質(zhì)的25% 33%，其廣泛 分布于機體各個組織器官，如皮膚、骨骼、軟骨、角膜、血管等，尤其在人體的皮膚和結(jié)締組 織中，含有大量的膠原蛋白。膠原蛋白作為一種結(jié)締組織的粘合物質(zhì)，對維護細胞、組織、器 官的正常生理功能有重要作用。膠原蛋白作為天然的生物資源，已廣泛的應用在生物醫(yī)藥、化妝品、食品等行業(yè) 中。目前，市場對膠原蛋白的需求量越來越大，其主要來源是利用酸堿法從動物機體中提取 獲得，但這種膠原蛋白雖然產(chǎn)量較高，但其具有水溶性差、純度低，在臨床上易出現(xiàn)排斥反 應且存在病毒隱患等缺點，從而抑制了膠原蛋白在各行業(yè)的應用。隨著生物技術的發(fā)展，人 們利用轉(zhuǎn)基因及基因重組技術表達膠原蛋白也獲得了成功，如利用哺乳類細胞、昆蟲細胞 表達系統(tǒng)及大腸桿菌表達系統(tǒng)等，哺乳類細胞、昆蟲細胞表達系統(tǒng)雖然能夠表達結(jié)構復雜 的真核細胞蛋白成分，但操作復雜，表達水平低，規(guī)模化生產(chǎn)成本較高，不易普遍推廣使用， 而大腸桿菌表達系統(tǒng)雖然表達量較高，但存在著易形成包涵體，產(chǎn)生較多雜蛋白等問題，從 而導致后期的純化困難，回收率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于針對上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種工藝簡單， 蛋白產(chǎn)率高、收率高及純度高，且能達到完全脫色的目的，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的畢赤 酵母表達重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法。本發(fā)明所用菌種是巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris C13，該菌種已于2010年12 月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏中心地址北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101)，保藏編號為CGMCC No.4437。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是一種畢赤酵母表達重組類人膠 原蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法采用巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris C13，保藏 編號CGMCC No. 4437為菌種，包括一級種子培養(yǎng)，二級種子培養(yǎng)，發(fā)酵罐培養(yǎng)和誘導表達， 對誘導表達后的發(fā)酵液進行離心，收集離心后的上清液依次進行濃縮、凝膠柱層析、沉淀脫 色、離子交換層析和超濾脫鹽，得到重組類人膠原蛋白。上述的畢赤酵母表達重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，所述凝膠柱層析的凝膠層析 柱填料為Sephacryl S-100。上述的畢赤酵母表達重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，所述沉淀脫色過程中調(diào)節(jié)粗 蛋白液PH值為4.0。
上述的畢赤酵母表達重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，所述離子交換層析過程中， 離子交換柱填料為DEAE Sepharose FF,以pH值為8. O的50mmol/L的Tris-HCl緩沖液配制 上樣液，以PH值為8. O的洗脫液洗脫，所述洗脫液中含有50mmol/L的Tris-HCl和0. 5mol/ L 的 NaCl。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點本發(fā)明采用巴斯德畢赤酵母基因工程菌表 達重組類人膠原蛋白，酵母是單細胞真核生物，它既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于 基因工程操作和高密度發(fā)酵等特性，同時又具有適于真核生物基因產(chǎn)物正確折疊的細胞內(nèi) 環(huán)境和糖鏈加工系統(tǒng)，使表達產(chǎn)物具有天然結(jié)構和生物活性，而且畢赤酵母均為分泌型表 達，更利于后期的純化，另外，畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基采用無機鹽，其配制簡單、價格低廉，適 合大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明和其它純化方法相比，工藝簡單，目的蛋白產(chǎn)率高，回收率達到 60%以上，純度達95%以上，且能達到完全脫色的目的，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)重組類人 膠原蛋白。本發(fā)明涉及的生物材料為巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris C13，其保藏日期為 2010年12月8日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏中心 地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101)， 保藏編號為CGMCC No. 4437。下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明技術方案做進一步的詳細說明。


圖1為本發(fā)明發(fā)酵液離心后上清液的HPLC檢測圖。圖2為本發(fā)明DEAE陰離子層析后洗脫液的HPLC檢測圖。圖3為本發(fā)明發(fā)酵液純化前后的SDS-PAGE電泳圖。
具體實施例方式畢赤酵母表達重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法包括一級種子培養(yǎng)，二級種子培養(yǎng)， 發(fā)酵罐培養(yǎng)和誘導表達，對誘導表達后的發(fā)酵液進行離心，收集離心后的上清液依次進行 濃縮、凝膠柱層析、沉淀脫色、離子交換層析和超濾脫鹽，得到重組類人膠原蛋白。1、菌種巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris C13，保藏編號CGMCCNo. 4437，保藏日 期2010年12月8日；2、培養(yǎng)基
(1)種子培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基，組成為
酵母浸出粉10g/L胰蛋白胨20g/L
PH6. 0磷酸鉀緩沖溶液100mmol/LYNB13. 4g/L
Biotin0. 2mg/L甘油10mL/Lo
(2)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為
甘油40g/LK2SO418.2g/L
H3PO426. 7mL/LCaSO4 · 2H200.93g/L
MgSO414. 9g/LKOH4. 13g/L
PTMl4. 35mL ；
其中PTMl組成為CuSO4 · 5H20 6. Og/L KI0.088g/LMnSO4 · H2O 3. Og/LNa2MoO4 · 2H200. 2g/LH3BO30. 02g/L CoCl2 · 6H200. 5g/LZnCl220. Og/L FeSO4 · 7H2065. Og/LBiotin0. 2g/LH2SO45.0mL/L。3、發(fā)酵(1) 一級種子培養(yǎng)將甘油保存的菌種接種至含有300mL種子培養(yǎng)基的搖瓶中，30°C，250r/min培養(yǎng) 24小時 36小時；(2) 二級種子培養(yǎng)將一級種子液全部轉(zhuǎn)接入含有4L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，30°C培養(yǎng)，用氨水調(diào) 節(jié)并控制PH值為5. 0，溶氧控制在20% 30%，培養(yǎng)至OD600達到2. 0 6. 0 ；(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)和誘導表達將二級種子液轉(zhuǎn)入含有30L發(fā)酵培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，30°C培養(yǎng)，用氨水調(diào)節(jié)并 控制PH值為5. 0，通氣量為55L/min，攪拌速率為650r/min，當溶氧陡然上升時(預示培養(yǎng) 基中的甘油已耗盡，此階段耗時約20小時)，開始流加補甘油，pH值控制為5. 0，溶氧控制 在20%以上，補甘油6小時后饑餓1小時使甘油耗盡，然后開始甲醇誘導，誘導階段溫度為 28°C, pH值控制在5. 0，溶氧控制在20% 40%左右，甲醇補料速度從3. 6mL/h/L(lL發(fā)酵 液中Ih補加3. 6mL甲醇)逐漸增大到8. 0mL/h/L(lL發(fā)酵液中Ih補加8. OmL甲醇)，誘導 36小時 48小時后達到平臺期，誘導7 后出罐；4、將出罐后的發(fā)酵液利用大容量冷凍離心機離心去除菌體，收集上清液，將上清 液超濾濃縮至5L左右，并過濾去除機械雜質(zhì)；5、采用kphacryl S-100凝膠裝柱，取3L Sephacryl S-100凝膠裝于規(guī)格為 SOcmX 12cm的純化柱中，用去離子水平衡2 3個柱體積，上SOOmL濃縮樣品，流速為40mL/ min，去離子水洗脫，用核酸蛋白儀檢測，收集蛋白峰；6、用稀HCl調(diào)節(jié)粗蛋白液(收集液)的pH值至4.0，靜置沉淀脫色，收集上清液；7、將沉淀脫色后收集的上清液以pH值為8. 0的50mmol/L的Tris-HCl緩沖液配 制成上樣液，陰離子填料選用DEAE Sepharose FF,用10倍柱體積的pH值為8. 0的洗脫液 洗脫，收集目標蛋白溶液；所述洗脫液為含有50mmol/L Tris-HCl和0. 5mol/L NaCl的水溶 液；8、用截留分子量為50KDa的超濾膜組件對陰離子交換層析收集的目標蛋白溶液 進行脫鹽并濃縮；9、真空冷凍干燥得到重組類人膠原蛋白。經(jīng)檢測，本發(fā)明的目的蛋白(重組類人膠原蛋白)的回收率達到60%以上，純度達 到95%以上，利用雙縮脲法測定純化之后膠原蛋白濃度，蛋白表達量可達到5. Og/L。和其 它純化方法相比，本發(fā)明工藝簡單，蛋白產(chǎn)率、收率及純度高，且能達到完全脫色的目的，適 合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)重組類人膠原蛋白。圖1為本發(fā)明發(fā)酵液離心后上清液的HPLC檢測圖，圖中目標峰為重組類人膠原蛋白，同時含有雜蛋白(檢測柱型號=Shodex Protein KW-802. 5，流動相50mM PBS (pH7. 0)+0. 3M NaCl，流速1. Oml/min)。圖2為本發(fā)明DEAE陰離子層析后洗脫液的HPLC檢測圖，圖中峰為重組類人 膠原蛋白，波峰單一，純度較高(檢測柱型號=Shodex ProteinKW-802. 5，流動相50mM PBS (pH7. 0)+0. 3M NaCl，流速1. Oml/min)。圖3為本發(fā)明發(fā)酵液純化前后的SDS-PAGE電泳圖，圖中M代表蛋白Marker，1為 純化前蛋白，2為純化后蛋白。
權利要求
1.一種畢赤酵母表達重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法采用巴斯德 畢赤酵母Pichia pastoris C13，保藏編號CGMCC No. 4437為菌種，包括一級種子培養(yǎng)，二 級種子培養(yǎng)，發(fā)酵罐培養(yǎng)和誘導表達，對誘導表達后的發(fā)酵液進行離心，收集離心后的上清 液依次進行濃縮、凝膠柱層析、沉淀脫色、離子交換層析和超濾脫鹽，得到重組類人膠原蛋 白。
2.根據(jù)權利要求1所述的畢赤酵母表達重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于， 所述凝膠柱層析的凝膠層析柱填料為kphacryl S-IOO0
3.根據(jù)權利要求1所述的畢赤酵母表達重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于， 所述沉淀脫色過程中調(diào)節(jié)粗蛋白液PH值為4. 0。
4.根據(jù)權利要求1所述的畢赤酵母表達重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于， 所述離子交換層析過程中，離子交換柱填料為DEAE SepharoseFF,以pH值為8. 0的50mmol/ L的Tris-HCl緩沖液配制上樣液，以pH值為8. 0的洗脫液洗脫，所述洗脫液中含有50mmol/ L 的 Tris-HCl 和 0. 5mol/L 的 NaCl。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種畢赤酵母表達重組類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，該方法采用巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris C13，保藏編號CGMCC No.4437為菌種，包括一級種子培養(yǎng)，二級種子培養(yǎng)，發(fā)酵罐培養(yǎng)和誘導表達，對誘導表達后的發(fā)酵液進行離心，收集離心后的上清液依次進行濃縮、凝膠柱層析、沉淀脫色、離子交換層析和超濾脫鹽，得到重組類人膠原蛋白。本發(fā)明和其它純化方法相比，工藝簡單，目的蛋白產(chǎn)率高，回收率達到60％以上，純度達95％以上，且能達到完全脫色的目的，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)重組類人膠原蛋白。
文檔編號C12P21/02GK102146426SQ20101060221
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權日2010年12月23日
發(fā)明者侯增淼, 張鳳龍, 聶蘇秦 申請人:陜西九州生物醫(yī)藥科技園發(fā)展有限公司