專利名稱：基因重組人膠原蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組膠原蛋白及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是一種生物高分子物質(zhì)，是維持肌膚和組織器官的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，也是修復(fù)各損傷組織的重要物質(zhì)。主要存在于人和動(dòng)物的皮、骨、軟骨、牙齒、肌腱、韌帶和血管中，是結(jié)締組織中重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體的功能。膠原蛋白對(duì)維護(hù)細(xì)胞、組織、器官的正常生理功能和損傷修復(fù)有重要作用。膠原蛋白可以給予含有膠原蛋白的皮膚層所必需的養(yǎng)分，使皮膚中的膠原蛋白活性加強(qiáng)，保持角質(zhì)層水分以及纖維結(jié)構(gòu)的完整性，改善皮膚細(xì)胞生存環(huán)境和促進(jìn)皮膚組織的新陳代謝，增加循環(huán)，達(dá)到滋潤(rùn)皮膚延緩老化，美容，消皺，養(yǎng)發(fā)的目的。生產(chǎn)膠原蛋白的傳統(tǒng)方法是利用酸、堿或酶來(lái)處理動(dòng)物組織(豬皮、牛皮、驢皮、魚皮/鱗等)，從中提取膠原蛋白。這些方法雖然成本低廉、回收率較高，但是制取的膠原蛋白均為分子量很小且長(zhǎng)度不等的混合膠原蛋白肽段，俗稱明膠，很難起到保濕、滋養(yǎng)的效果；提取工藝簡(jiǎn)單粗放，產(chǎn)物純度不佳，常有異味；動(dòng)物來(lái)源，無(wú)法擺脫生物安全隱患，極大的限制了傳統(tǒng)膠原在化妝品、食品、藥品等各類產(chǎn)品中的廣泛應(yīng)用；加工提取時(shí)產(chǎn)生巨量廢水嚴(yán)重傷害環(huán)境；技術(shù)門椹低，原料來(lái)源不易控制，造成皮鞋奶、毒膠囊橫行，食品、藥品安全隱患嚴(yán)重。為了解釋傳統(tǒng)動(dòng)物膠原的一系列問(wèn)題，許多學(xué)者開始著手應(yīng)用生物技術(shù)來(lái)生產(chǎn)重組膠原，因微生物培養(yǎng)的種種便利，利用重組微生物生產(chǎn)膠原逐漸成為主流。產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的，如范代娣應(yīng)用大腸桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)的重組類人膠原蛋白，并已成功應(yīng)用到化妝品領(lǐng)域。但是細(xì)菌表達(dá)體系具有內(nèi)毒素、熱原等生物安全問(wèn)題，使得產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢測(cè)成本高企，并存在隱患；表達(dá)的蛋白以包涵體形式存在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)物純化困難、回收率受限制；另外原核表達(dá)系統(tǒng)比較低級(jí)，不能完成表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后加工修飾，使產(chǎn)物不具有生物活性。因此，越來(lái)越多的學(xué)者開始利用真核微生物生產(chǎn)重組膠原:張鳳龍等利用畢赤酵母合成幾乎完全人源性的重組膠原，應(yīng)用于化妝品。但其純化方法僅采用了超濾、凝膠過(guò)濾、離子交換等傳統(tǒng)非特異性的大分子分離技術(shù)，純度不夠高，雜蛋白和部分降解蛋白無(wú)法徹度去除，滿足不了微創(chuàng)美容、整形美容對(duì)純度的更高要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于針對(duì)上述現(xiàn)有重組膠原及其制備技術(shù)的不足，提供一種真核工程菌生產(chǎn)的完全人源化的重組膠原，其性能遠(yuǎn)優(yōu)于動(dòng)物膠原蛋白、原核微生物重組膠原；同時(shí)帶有特異性親和純化標(biāo)記，易于得到高純度產(chǎn)品?；蛑亟M人膠原蛋白全長(zhǎng)474個(gè)氨基酸，由兩段完全相同的人III型膠原片段串聯(lián)而成，C末端連接6個(gè)組氨酸殘基，其序列(SEQ ID N0.1)如下:AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARG 50 LAGPPGMPGPRGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA 100 GEPGRDGNPG SDGLPGRDGSPGGKGDRGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP 150 AGKS⑶RGES GPAGPAGAPG PAGSRGAPGPQGPRGDKGET GERGAAGIKG 200 HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAE FTAGNTGAPGSPGVSGPKGD 250 AGQPGEKGSP GAQGPPGAPG PLGIAGITGA RGLAGPPGMP GPRGSPGPQG
300
VKGESGKPGA NGLSGERGPP GPQGLPGLAG TAGEPGRDGN PGSDGLPGRD 350GSPGGKGDRG ENGSPGAPGA PGHPGPPGPV GPAGKS⑶RG ESGPAGPAGA 400 PGPAGSRGAPGPQGPRGDKG ETGERGAAGI KGHRGFPGNP GAPGSPGPAG 450 QQGAIGSPGP ADHHHHHHTGLARF474
蛋白為單鏈結(jié)構(gòu)，其中I 229和233 461為相同的III型膠原肽段，兩段人III型膠原蛋白片段之間有EFT連接，233 461的人III型膠蛋白原片段后采用DHHHHHHTGLARF進(jìn)行修飾，其中463 468為親和純化標(biāo)記6His。 生產(chǎn)上述蛋白的基因重組工程菌及蛋白制備方法由下述步驟組成:
(一)、重組表達(dá)載體的構(gòu)建
從人新鮮胎盤中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)GenBank III型人膠原蛋白C0L3A1基因序列，設(shè)計(jì) PCR 擴(kuò)增引物 F (SEQ ID N0.2)、R (SEQ ID N0.3):
F: GAATCTGTGAATCATGCCCTACR: GAAGTCATAATCTCAT CGGTGTT
以cDNA為模版PCR擴(kuò)增C0L3A1基因，產(chǎn)物長(zhǎng)度為3295bp?；厥仗禺愋援a(chǎn)物連接于pGM-T 載體，得到質(zhì)粒 pGM-T- C0L3A1 ；
依照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中多重PCR的方法，以pGM-T- C0L3A1質(zhì)粒為模板，使用引物F1、F2、R進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，得到產(chǎn)物為722bp的產(chǎn)物C0L3，引物為:
(SEQ ID N0.4) Fl:AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG(SEQ ID N0.5) F2:TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT(SEQ ID N0.6) R: TTGAATTCTGCAGGTCCTGG 將產(chǎn)物C0L3和載體pPIC9K分別做EcoR 1、Xho I雙酶切，并經(jīng)T4 DNA連接酶連接成為 pPIC9K-C0L3 ；
以質(zhì)粒pPIC9K-C0L3為模板，設(shè)計(jì)引物，再次擴(kuò)增C0L3，同時(shí)添加6His標(biāo)記。弓丨物為:(SEQ ID N0.7) F:CCCGAATTCACTGCGGGTAACACTGGTGC(SEQ ID N0.8) R:AAAACCGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCTGCAGGTCCTGGACTG將二次擴(kuò)增產(chǎn)物C0L3-6His和質(zhì)粒pPIC9K-C0L3分別進(jìn)行EcoR 1、Age I雙酶切，并經(jīng)T4 DNA連接酶連接成為pPIC9K-C0L3-C0L3-6His。目標(biāo)蛋白的基因序列如下:
I GCGGGTAACA CTGGTGCTCC TGGCAGCCCT GGAGTGTCTG GACCAAAAGG 51 TGATGCTGGC CAACCAGGAG AGAAGGGATC GCCTGGTGCC CAGGGCCCAC 101 CAGGAGCTCC AGGCCCACTT GGGATTGCTG GGATCACTGG AGCACGGGGT 151 CTTGCAGGAC CACCAGGCAT GCCAGGTCCT AGGGGAAGCC CTGGCCCTCA 201 GGGTGTCAAG GGTGAAAGTG GGAAACCAGG AGCTAACGGT CTCAGTGGAG
權(quán)利要求
1.一種人源化基因重組膠原蛋白，其特征是序列如下:蛋白全長(zhǎng)474個(gè)氨基酸，其中I 229和233 461為相同的人III型膠蛋白原片段，兩段人III型膠原蛋白片段之間有EFT連接，233 461的人III型膠蛋白原片段后采用DHHHHHHTGLARF進(jìn)行修飾；其氨基酸序列如下:(SEQ ID N0.1) AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARG 50 LAGPPGMPGPRGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA 100 GEPGRDGNPG SDGLPGRDGSPGGK⑶RGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP 150 AGKS⑶RGES GPAGPAGAPG PAGSRGAPGPQGPRGDKGET GERGAAGIKG 200 HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAE FTAGNTGAPGSPGVSGPKGD 250 AGQPGEKGSP GAQGPPGAPG PLGIAGITGA RGLAGPPGMP GPRGSPGPQG300 VKGESGKPGA NGLSGERGPP GPQGLPGLAG TAGEPGRDGN PGSDGLPGRD 350GSPGGK⑶RG ENGSPGAPGA PGHPGPPGPV GPAGKS⑶RG ESGPAGPAGA 400 PGPAGSRGAPGPQGPRGDKG ETGERGAAGI KGHRGFPGNP GAPGSPGPAG 450 QQGAIGSPGP ADHHHHHHTGLARF474。
2.—種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述蛋白的工程菌，其特征在于該工程菌由下述步驟獲得: (1)克隆人III型膠蛋白基因 從人新鮮胎盤中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)GenBank III型人膠原蛋白COL3A1基因序列，設(shè)計(jì)基因PCR擴(kuò)增引物F、R:(SEQ ID N0.2) F: GAATCTGTGAATCATGCCCTAC(SEQ ID N0.3) R: GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT以cDNA為模版擴(kuò)增得到基因片段，產(chǎn)物長(zhǎng)度為3295bp ；` (2)構(gòu)建質(zhì)粒pPIC9K-COL3-COL3-6His 利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按產(chǎn)品說(shuō)明書，從普通的1.5%瓊脂糖凝膠上回收特異性條帶COL3A1 ;依照pGM-T克隆試劑盒說(shuō)明書，將COL3A1連接于pGM_T載體上，得到質(zhì)粒pGM-T-COL3Al ；以pGM-T_COL3Al質(zhì)粒為模板，以F1、F2、R為引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，得到產(chǎn)物COL3長(zhǎng)度為722bp，引物為:(SEQ ID N0.4) Fl:AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG(SEQ ID N0.5) F2:TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT(SEQ ID N0.6) R: TTGAATTCTGCAGGTCCTGG 將產(chǎn)物COL3和質(zhì)粒pPIC9K分別做EcoR 1、Xho I雙酶切，并經(jīng)T4 DNA連接酶連接成為質(zhì)粒 pPIC9K-C0L3 ； 以質(zhì)粒pPIC9K-C0L3為模板，再次擴(kuò)增C0L3得到C0L3_6His，引物為:F:CCCGAATTCACTGCGGGTAACACTGGTGC (SEQ ID N0.7)R:AAAACCGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCTGCAGGTCCTGGACTG (SEQ ID N0.8) 將二次擴(kuò)增產(chǎn)物C0L3-6His和質(zhì)粒pPIC9K-C0L3分別進(jìn)行EcoR1、AgeI雙酶切，并經(jīng)T4DNA連接酶連接成為質(zhì)粒pPIC9K-C0L3-C0L3-6His ； (3)基因重組構(gòu)建表達(dá)人III型膠蛋白的畢赤酵母基因工程菌 將制備得到的質(zhì)粒pPIC9K-C0L3-C0L3-6His用限制性內(nèi)切酶I線性化，并制備畢赤酵母 SMDl 168( Invitrogen)感受態(tài)細(xì)胞，電擊轉(zhuǎn)化 pPIC9K-C0L3-C0L3_6His 質(zhì)粒，以 G418梯度法挑選高拷貝陽(yáng)性克隆，得到畢赤酵母基因工程菌。
3.制備權(quán)利要求1所述蛋白的方法，其特征在于用BMGY培養(yǎng)基于30°C250rpm培養(yǎng)權(quán)利要求2所述的畢赤酵母基因工程菌16 18小時(shí)，至0D6(i(i=2 6 ;室溫下1500g 3000g離心5min，收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，使0D_=1.0左右，將所得的菌液置于三角瓶中，用雙層紗布封口，于30°C 250rpm繼續(xù)生長(zhǎng)；每24小時(shí)向培養(yǎng)基中添加甲醇至終濃度為1%開始誘導(dǎo)培養(yǎng)，直到100小時(shí)以上；發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集上清，在非變性條件下用N1-NTA His Bands樹脂(Merck)吸附重組膠原，漂洗流出雜質(zhì)，最后再洗脫重組膠原，收集洗脫液；洗脫液經(jīng)超濾系統(tǒng)(PALL)脫鹽、濃縮，濃縮液經(jīng)冷凍干燥制得基因重組人膠原蛋白。
4.一種編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因序列，其特征在于序列如下:(SEQ ID N0.9)
5.一種用于使用基因重組工程菌生產(chǎn)重組人源膠原蛋白時(shí)的重組膠原蛋白純化方法，其特征在于在進(jìn)行基因重組工程菌構(gòu)建過(guò)程中，在進(jìn)行重組人源膠原蛋白氨基酸序列設(shè)計(jì)時(shí)，使用附帶有蛋白質(zhì)修飾功能的核苷酸引物，對(duì)人源膠原蛋白氨基酸序列采用附加DHHHHHHTGLARF的方式進(jìn)行修飾，并在從工程菌發(fā)酵液中提取重組人源膠原蛋白時(shí)通過(guò)N1-NTA His.Bind樹脂吸附的方式純化。
6.一種用于權(quán)利要求5所述的，附帶有蛋白質(zhì)修飾功能的核苷酸引物，其特征在于根據(jù)人源膠原蛋白氨基酸序列設(shè)計(jì)核苷酸引物時(shí)，在C端增加設(shè)計(jì)6個(gè)用于表達(dá)組氨酸的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述用于在C端增加6個(gè)用于表達(dá)組氨酸的核苷酸序列是GTGGTGGTGGTGGTGGTG。
8.權(quán)利要求6所述的附帶有蛋白質(zhì)修飾功能的核苷酸引物，其特征在于其核苷酸序列為F:CCCGAATTCACTGCGGGTAACACTGGTGCR:AAAACCGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCTGCAGGTCCTGGACTG 。
9.權(quán)利要求1所述的基因重組人膠原蛋白在制備化妝品中的用途。
10.一種用于美容的外用護(hù)膚產(chǎn)品，其特征在于所制備的產(chǎn)品以水為溶劑，由以下質(zhì)量配比的原料組成: 基因重組人膠原蛋白0.01 1% 透明質(zhì)酸鈉0.01 ~ 0.1% β-葡聚糖0.01 1%` 霍霍巴酯0.01 0.5% 絲氨酸0.01 1% 山梨醇I 5% 甜菜堿I 5% 乳酸鈉0.1 3%。
11.一種用于美容的導(dǎo)入性產(chǎn)品，其特征在于分別由凍干粉和溶劑組成，凍干粉由以下質(zhì)量配比的無(wú)菌原料配制而成，并冷凍干燥: 基因重組人膠原蛋白0.1% 甘露醇5% ； 溶劑由0.05 %無(wú)菌透明質(zhì)酸鈉溶液組成。
全文摘要
一種由真核菌生產(chǎn)的人源化基因重組人膠原蛋白，全長(zhǎng)474個(gè)氨基酸，由兩段完全相同的人Ⅲ型膠原片段串聯(lián)而成，C端連接6個(gè)組氨酸殘基作為特異性親和純化標(biāo)記。基因重組人膠原蛋白性能優(yōu)于動(dòng)物膠原蛋白、原核工程菌重組膠原；帶有特異性親和純化標(biāo)記，易于得到高純度產(chǎn)品。
文檔編號(hào)A61K8/65GK103102407SQ201310033299
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者梁亮 申請(qǐng)人:西安益力欣生物科技有限公司