一種金線蓮苷的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物有效成分提取領(lǐng)域，尤其涉及一種金線蓮苷的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金線蓮為蘭科植物花葉開(kāi)唇蘭Anoectochilusroxburghii(Wall)Lindl，味甘，性 寒，歸肺、肝、腎、膀胱經(jīng)，具有清熱涼血，祛風(fēng)利濕，解毒的功效，主治肺熱咳嗽，咯血，尿血， 小兒急驚風(fēng)，黃疸，水腫，淋證，消渴，風(fēng)濕痹痛，跌打損傷，毒蛇咬傷，現(xiàn)代用于肝炎，腎炎， 膀胱炎，糖尿病，支氣管炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病。金線蓮主要分布在我國(guó)的福建、臺(tái)灣、云南 等省，在印度、日本、尼泊爾和斯里蘭卡等國(guó)也有分布。
[0003] 金線蓮其主要成分為糖苷、生物堿、留體、黃酮、?；撬帷被?、微量元素等。具相 關(guān)文獻(xiàn)表明金線蓮能直接作用于肝細(xì)胞膜，保護(hù)肝細(xì)胞膜的完整，防止有害物質(zhì)破壞肝細(xì) 胞膜，并防止肝細(xì)胞之病變性壞死。而起到這種作用的物質(zhì)主要為金線蓮苷，同時(shí)金線蓮苷 也為花葉開(kāi)唇蘭的特有化合物。
[0004]目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于金線蓮苷的具體提取工藝的研究，大多數(shù)是關(guān)于金線蓮黃酮苷 的提取工藝，主要采用常壓正相硅膠色譜和分子篩結(jié)合的分離方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種提取純度高，時(shí)間短、方法簡(jiǎn)單的金線蓮苷提取方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種金線蓮苷的提取方法，其特征在于，步驟為，
[0007] 提?。合扔?0-60°C石油醚索提2h后，再用甲醇索提2h;液相色譜金線蓮苷峰面 積1208-1432 ;獲得金線蓮苷提取液；
[0008] 濃縮：將獲得的提取液濃縮至干，再加入蒸餾水，靜置后除去水不溶物，得到處理 的甲醇提取液；
[0009] 粗分：使用D101大孔吸附樹(shù)脂柱對(duì)處理的甲醇提取液進(jìn)行分離；
[0010] 細(xì)分：使用加壓硅膠色譜柱對(duì)金線蓮苷粗提取物進(jìn)行細(xì)分處理；
[0011] 純化：再次使用D101大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行純化得到金線蓮純化物，純度多98%。
[0012] 進(jìn)一步，所述提取中，石油醚索提2h的溫度彡40°C;甲醇索提的溫度彡60°C;
[0013] 進(jìn)一步，所述濃縮為將獲得的提取液濃縮至干，加入3-5倍蒸餾水，于冰箱冷藏靜 置過(guò)夜后，抽濾除去甲醇不溶物，得到處理的甲醇提取液；
[0014] 進(jìn)一步，所述粗分為采用濕法上樣的方法，先用蒸餾水洗脫、再用8體積％甲醇洗 脫，最后100%甲醇洗脫來(lái)進(jìn)行分離，將8體積％甲醇洗脫劑洗脫的接樣瓶進(jìn)行薄層色譜顯 示有金線蓮苷紫紅色顯色反應(yīng)的樣品瓶合并濃縮，獲得金線蓮苷粗提取物。
[0015] 進(jìn)一步，所述粗分為采用濕法上樣的方法，先用蒸餾水洗脫2個(gè)柱體積、再用8體 積％甲醇洗脫2-3個(gè)柱體積，約40ml-50ml更換一個(gè)接樣瓶、最后100%甲醇洗脫2個(gè)柱體 積來(lái)進(jìn)行分離，將8體積％甲醇洗脫劑洗脫的接樣瓶進(jìn)行薄層色譜顯示有金線蓮苷紫紅色 顯色反應(yīng)的樣品瓶合并濃縮，獲得金線蓮苷粗提取物。
[0016] 進(jìn)一步，所述細(xì)分為采用干法上樣的方法，以樣品層：分離層柱長(zhǎng)比為1 :9(柱 長(zhǎng)比，按抽壓以后計(jì)），用洗脫劑洗脫分離，將洗脫的接樣瓶進(jìn)行薄層色譜顯示有金線蓮 苷紫紅色顯色反應(yīng)且無(wú)其他反應(yīng)的樣品瓶?jī)?nèi)液體合并、濃縮，獲得金線蓮苷化合物，純度 彡 95%〇
[0017] 進(jìn)一步，所述細(xì)分步驟中洗脫劑為體積比為8:2:0. 2為氯仿：甲醇：冰醋酸的混合 物；洗脫23個(gè)柱體積進(jìn)行分離。
[0018] 進(jìn)一步，所述純化為將獲得金線蓮苷化合物采用濕法上樣的方法，先用蒸餾水2 個(gè)柱體積、8體積％甲醇2-3個(gè)柱體積，將薄層色譜顯示有金線蓮苷紫紅色顯色反應(yīng)且無(wú)其 他反應(yīng)的樣品瓶合并濃縮，既得金線蓮純化物，純度多98%。
[0019] 本發(fā)明對(duì)金線蓮黃酮苷的提取采用的是大孔吸附樹(shù)脂和加壓正相硅膠色譜結(jié)合 的方法進(jìn)行分離，并由于金線蓮苷為內(nèi)酯類(lèi)化合物，在水中易受酸堿及高溫影響而酯鍵斷 裂的緣故，故各個(gè)環(huán)節(jié)都需考慮如何提高金線蓮苷的提取分離效果，力求達(dá)到最好的提取 工藝。圖5為金線蓮苷化合物結(jié)構(gòu)。
[0020] 本發(fā)明申請(qǐng)人通過(guò)多次試驗(yàn)證明，金線蓮苷在甲醇中的溶解性最好，在氯仿、石 油醚中溶解度較低，但是其甲醇提取液中雜質(zhì)較多，而且金線蓮苷為內(nèi)酯類(lèi)化合物，在水 中易受酸堿及高溫影響而酯鍵斷裂，不利于后面的分離純化，而且低溫索提的方法也加快 了提取時(shí)間。通過(guò)對(duì)設(shè)計(jì)的6種提取方案的進(jìn)行對(duì)比分析，最終以60-90°C石油醚索提 (T< 40°C)2h后，甲醇索提（T< 60°C)2h后所獲得的提取液的方案最優(yōu)，其金線蓮苷的 液相色譜峰面積在1208-1432,雖然略低于純甲醇的索提液1582-1732,但是采用面積歸一 法，可知金線蓮苷組分占總提取液的百分比為28. 3%，明顯高于甲醇索提液金線蓮苷組分 占總提取液的百分比14. 6%，利于之后的分離純化工作，而且時(shí)間較短。
[0021] 粗分離步驟中，申請(qǐng)人使用D101大孔吸附樹(shù)脂柱對(duì)處理的提取液進(jìn)行分離，采用 濕法上樣，并分別用蒸餾水、10%甲醇（v/V)、20%甲醇（v/v)，40%甲醇（v/v)，100%甲醇 溶液，每個(gè)濃度采用2個(gè)柱體積進(jìn)行洗脫，之后將各組分進(jìn)行濃縮，并用液相色譜對(duì)各組分 進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)金線蓮苷主要在10%甲醇（v/V)組分中，20%甲醇組分僅含有少量，認(rèn)定金 線蓮苷在< 10%甲醇（v/V)中被洗脫下來(lái)。故重新實(shí)驗(yàn)，以獲得金線蓮苷的最佳洗脫濃度， 再次采用蒸餾水、2%甲醇（v/v)、4%甲醇（v/v)，6%甲醇（v/v)，8%甲醇（v/v)、10%甲醇 (v/V)溶液，每個(gè)濃度采用2個(gè)柱體積進(jìn)行洗脫，之后將各組分進(jìn)行濃縮，并用液相色譜對(duì) 各組分進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)8%甲醇（v/v)組分的金線蓮苷含量較高，在薄層色譜板上有金線蓮 苷紫紅色顯色反應(yīng)，經(jīng)液相色譜檢測(cè)金線蓮苷占該組分百分比為88. 3-91. 2%，分離效果及 分離時(shí)間最佳。故選定D101大孔吸附樹(shù)脂最佳的分離提取方案為：先用蒸餾水洗脫2個(gè)柱 體積（主要是為了去除金線蓮中的多糖、蛋白等大分子物質(zhì)及離子）、再用8%甲醇（v/v)、 洗脫2-3個(gè)柱體積（獲得高濃度的金線蓮粗提取物）、100%甲醇洗脫2個(gè)柱體積（大孔吸 附樹(shù)脂的洗脫再生），將洗脫的接樣瓶進(jìn)行薄層色譜顯示有金線蓮苷紫紅色顯色反應(yīng)的樣 品瓶?jī)?nèi)液體合并、濃縮，獲得金線蓮苷粗提取物；所得金線蓮苷粗提取物在薄層色譜板中， Rf= 0. 96, 0. 83, 0. 07三處條帶為有波長(zhǎng)256nm和365nm的熒光反應(yīng)，Rf= 0. 26, 0. 11二 處斑點(diǎn)為分子碘熏的氧化還原反應(yīng)，Rf= 0. 88, 0. 25, 0. 18三處條帶為K0H/3, 5二硝基苯 甲酸的顯色反應(yīng)，Rf= 0. 25為金線蓮苷，其余二處為強(qiáng)心苷類(lèi)雜質(zhì)，接下來(lái)的分離過(guò)程就 是要把有熒光反應(yīng)的三個(gè)雜質(zhì)、2個(gè)還原性雜質(zhì)以及除金線蓮苷以外的二處強(qiáng)心苷類(lèi)雜質(zhì) 除去。主要通過(guò)薄層色譜板的Rf值來(lái)確定金線蓮苷在該洗脫液中的極性和洗脫時(shí)間，以調(diào) 整下一步分離提取過(guò)程中的洗脫劑配比。
[0022] 細(xì)分離步驟中，為了獲得高純度的金線蓮苷化合物，使用加壓硅膠色譜柱進(jìn)行處 理。將獲得的金線蓮苷粗提取物采用干法上樣，通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，以樣品層：分離層 =1 :9,洗脫劑氯仿：甲醇：冰醋酸（v/v/v) = 8:2:0. 2最佳。使用該洗脫劑洗脫2-3個(gè)柱 體積進(jìn)行分離，將洗脫的接樣瓶進(jìn)行薄層色譜顯示有金線蓮苷紫紅色顯色反應(yīng)且無(wú)其他反 應(yīng)的樣品瓶?jī)?nèi)樣品合并濃縮的樣品瓶合并、濃縮，獲得金線蓮苷化合物，純度多95%;
[0023] 純化步驟中，再次使用D101大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行純化，將獲得金線蓮苷化合物采用 濕法上樣的方法，先用蒸餾水2個(gè)柱體積（除去殘留的醋酸等水溶性雜質(zhì)）洗脫、8%甲醇 (v/v) 2-3個(gè)柱體積洗脫，將薄層色譜顯示有金線蓮苷紫紅色顯色反應(yīng)且無(wú)其他反應(yīng)的樣品 瓶合并濃縮，即得金線蓮純化物，淡黃色結(jié)晶，純度多98%。
[0024] 最后利用核磁共振碳譜、氫譜以及質(zhì)譜來(lái)確定此化合物為金線蓮苷，并通過(guò)高效 液相色譜確定其純度為98. 2%。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1是實(shí)施例1純化步驟后的金線蓮苷質(zhì)譜圖。
[0026] 圖2是實(shí)施例1純化步驟后的金線蓮苷核磁共振氫譜圖。
[0027] 圖3是實(shí)施例1純化步驟后的金線蓮苷核磁共振氫譜圖。
[0028] 圖4是實(shí)施例1純化步驟后的金線蓮苷核磁共振碳譜圖。
[0029] 圖5是金線蓮苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0030] 圖6是實(shí)施例1所用分體式連接加壓色譜柱設(shè)備的連接結(jié)構(gòu)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類(lèi)似的標(biāo)號(hào)表示相同或類(lèi)似的元件或具有相同或類(lèi)似功能的元件。下面通過(guò)參考附 圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例 中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明 書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0032] 本實(shí)施例可采用圖6的設(shè)備。
[0033] 圖6中，血壓加壓球（1)、皮管（2)、加壓頭（3)、梨型球漏斗（4)、色譜柱（5)通過(guò) 閥門(mén)1 (6)、閥門(mén)2 (7)、閥門(mén)3 (8)、閥門(mén)4 (9)依次相連組成；所述色譜柱（5)配聚四氟乙烯材 料的閥門(mén)，標(biāo)準(zhǔn)磨口內(nèi)徑/外徑：24/30;所述梨型球漏斗（4)配聚四氟乙烯材料的閥門(mén)，標(biāo) 準(zhǔn)磨口內(nèi)徑/外徑：24/30。其中所述色譜柱（5)的內(nèi)徑為27mm，長(zhǎng)度30cm或內(nèi)徑15mm，長(zhǎng) 度30cm。所述梨型球漏斗的體積為250ml或500ml。所述色譜柱中樣品層硅膠為100-200 目的分析純0. 6-0. 8cm厚（起吸附樣品的作用），上端鋪60-80目的分析純硅膠0. 5cm和 一團(tuán)棉花（起緩沖壓力直接接