一種王不留行總皂苷的提取、純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種王不留行總皂苷的提取、純化方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]王不留行為石竹科植物麥藍(lán)菜Vaccaria segetalis (Neck.) Garcke.的種子。種子含多種總皂苷，其中王不留行總皂苷由棉根總皂苷元、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、鼠李糖組成。另含異肥皂草甙，酸解時其甙元肥皂草素一部分脫水而生成牡荊素。又含棉子糖及一種化合物，水解得葡萄糖。此外，含淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、灰分；預(yù)測有生物堿和香豆精類的反應(yīng)。
[0003]總皂苷(saponins)又稱皂素，是廣泛存在于植物界的一類特殊的甙類，它的水溶液振搖后可生產(chǎn)持久的肥皂樣的泡沫，因而得名。經(jīng)現(xiàn)代研宄證明，總皂苷具有的藥理作用:1、雙向調(diào)節(jié)免疫作用；2、抗缺氧和抗疲勞作用；3、抗低溫應(yīng)激作用；4、抗脂質(zhì)氧化作用；5、對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用；6、抗致突變作用；7、對腎有調(diào)節(jié)作用，補(bǔ)腎。
[0004]高速逆流色譜技術(shù)是一種不用任何同態(tài)載體的液、液色譜技術(shù)，其原理是基于組分在旋轉(zhuǎn)螺旋管內(nèi)的相對移動而互不混溶的兩相溶劑間分布不同而分離，其分離效率和速度可以與HPLC相媲美。HSCCC分離效率高，產(chǎn)品純度高，不存在載體對樣品的吸附和污染，制備量大和溶劑消耗少，操作簡單，能從極復(fù)雜的混合物中分離出特定的組分。被廣泛應(yīng)用天然產(chǎn)物分離制備中。
[0005]目前，國內(nèi)很少見王不留行總皂苷提取方法的相關(guān)專利報道。在現(xiàn)有公開專利“一種同時分離王不留行黃酮苷和王不留行總皂苷的分離方法”(專利號201210512777.7 )中采用的工藝步驟為:用含水有機(jī)溶劑來提取王不留行脫脂干粉，并將提取液過濾，濃縮，干燥后繼續(xù)用大孔樹脂進(jìn)行分離和制備，洗脫液經(jīng)濃縮，干燥而成，該法溶劑使用量大，所得王不留行總皂苷純度低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種王不留行總皂苷的提取、純化方法，此法操作簡單，所得產(chǎn)品純度高。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，一種王不留行總皂苷的提取、純化方法通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
1)取干燥的王不留行粉碎，過20-60目篩；
2)稱取一定量的粗粉，加入重量體積比為1:0.5~1的蒸餾水浸潤，并加入粗粉重量
0.1%~0.3%的生物酶在pH值4~5，溫度為45~50°C的條件下酶解l~3h ；
3)酶解結(jié)束，加入料液比為1:1~3、60%~80%的乙醇進(jìn)行超聲提取l~3h，過濾，收集濾液，濾渣重復(fù)提取1~2次；
4)收集提取液減壓濃縮至原體積的1/5~1/3，收集濃縮液，加入濃縮液體積2~4倍的乙醚攪拌，靜置分層，棄去上層，收集下層； 5)下層溶液采用高速逆流色譜純化，根據(jù)圖譜收集目標(biāo)成分，回收試劑，減壓干燥即得王不留行總皂苷。
[0008]步驟2)中所述的生物酶為果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶中的一種或兩種以上的混合物。
[0009]步驟3)中所述超聲提取的頻率為20~50KHz，溫度為40~55°C。
[0010]步驟5)中所述的高速逆流色譜分離的溶劑體系為乙酸乙酯-甲醇-水溶劑系統(tǒng)，混合比例2-4:1-3:6-10，取下相做固定相，上相做流動相。
[0011]本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)為:1、采用了生物酶酶解輔助超聲提取的提取方法，提取效率高，溶劑用量少，對環(huán)境污染小；2、采用了高速逆流色譜法純化，方法簡便易操作，溶劑用量小，樣品無損失，制備量大，可連續(xù)制備，而且無污染。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0013]實(shí)施例1:
取干燥的王不留行粉碎，過20目篩；稱取100g的粗粉，加入重量體積比為1:0.5的蒸餾水浸潤，并加入粗粉重量0.1%的果膠酶在pH值為4，溫度為45°C的條件下酶解Ih ;酶解結(jié)束，加入料液比為1:1、60%的乙醇在頻率為20KHz，溫度為40°C的條件下超聲提取3h，過濾，收集濾液，濾渣重復(fù)提取I次；收集提取液減壓濃縮至原體積的1/5，收集濃縮液，加入濃縮液體積2倍的乙醚攪拌，靜置分層，棄去上層，收集下層；下層溶液以乙酸乙酯-甲醇-水溶劑系統(tǒng)，混合比例2:1:6，取下相做固定相，上相做流動相，采用高速逆流色譜純化，根據(jù)圖譜收集目標(biāo)成分，回收試劑，減壓干燥即得王不留行總皂苷。經(jīng)HPLC檢測，含量為 95.2%ο
[0014]實(shí)施例2:
取干燥的王不留行粉碎，過40目篩；稱取100g的粗粉，加入重量體積比為1:0.5的蒸餾水浸潤，并加入粗粉重量0.2%的纖維素酶在pH值為5，溫度為50°C的條件下酶解2h ;酶解結(jié)束，加入料液比為1:2、70%的乙醇在頻率為30KHz，溫度為50°C的條件下超聲提取2h，過濾，收集濾液，濾渣重復(fù)提取2次；收集提取液減壓濃縮至原體積的1/4，收集濃縮液，加入濃縮液體積3倍的乙醚攪拌，靜置分層，棄去上層，收集下層；下層溶液以乙酸乙酯-甲醇-水溶劑系統(tǒng)，混合比例3:2:8，取下相做固定相，上相做流動相，采用高速逆流色譜純化，根據(jù)圖譜收集目標(biāo)成分，回收試劑，減壓干燥即得王不留行總皂苷。經(jīng)HPLC檢測，含量為 96.5%ο
[0015]實(shí)施例3:
取干燥的王不留行粉碎，過60目篩；稱取100g粗粉，加入重量體積比為1:1的蒸餾水浸潤，并加入粗粉重量0.3%的半纖維素酶在pH值為5，溫度為50°C的條件下酶解3h ;酶解結(jié)束，加入料液比為1:3、80%的乙醇在頻率為50KHz，溫度為55°C超聲提取lh，過濾，收集濾液，濾渣重復(fù)提取2次；收集提取液減壓濃縮至原體積的1/3，收集濃縮液，加入濃縮液體積4倍的乙醚攪拌，靜置分層，棄去上層，收集下層；下層溶液以乙酸乙酯-甲醇-水溶劑系統(tǒng)，混合比例4:3:10，取下相做固定相，上相做流動相采用高速逆流色譜純化，根據(jù)圖譜收集目標(biāo)成分，回收試劑，減壓干燥即得王不留行總皂苷。經(jīng)HPLC檢測，含量為95.8%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種王不留行總皂苷的提取、純化方法，其特征在于包括以下步驟: 1)取干燥的王不留行粉碎，過20-60目篩； 2)稱取一定量的粗粉，加入重量體積比為1:0.5~1的蒸餾水浸潤，并加入粗粉重量0.1%~0.3%的生物酶在pH值4~5，溫度為45~50°C的條件下酶解l~3h ； 3)酶解結(jié)束，加入料液比為1:1~3、60%~80%的乙醇進(jìn)行超聲提取l~3h，過濾，收集濾液，濾渣重復(fù)提取1~2次； 4)收集提取液減壓濃縮至原體積的1/5~1/3，收集濃縮液，加入濃縮液體積2~4倍的乙醚攪拌，靜置分層，棄去上層，收集下層； 5)下層溶液采用高速逆流色譜純化，根據(jù)圖譜收集目標(biāo)成分，回收試劑，減壓干燥即得王不留行總皂苷。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種王不留行總皂苷的提取、純化方法，其特征在于步驟2)中所述的生物酶為果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶中的一種或兩種以上的混合物。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種王不留行總皂苷的提取、純化方法，其特征在于步驟3)中所述超聲提取的頻率為20~50KHz，溫度為40~55°C。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種王不留行總皂苷的提取、純化方法，其特征在于步驟5)中所述的高速逆流色譜分離的溶劑體系為乙酸乙酯-甲醇-水溶劑系統(tǒng)，混合比例2-4:1-3:6-10，取下相做固定相，上相做流動相。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種王不留行總皂苷的提取、純化方法。其制備過程如下：取干燥的王不留行粉碎，過20-60目篩；稱取一定量的粗粉，加入重量體積比為1：0.5~1的蒸餾水浸潤，并加入粗粉重量0.1%~0.3%的生物酶酶解；酶解結(jié)束，加入料液比為1：1~3、60%~80%的乙醇進(jìn)行超聲提取，過濾，收集濾液，濾渣重復(fù)提取1~2次；收集提取液減壓濃縮至原體積的1/5~1/3，收集濃縮液，加入乙醚攪拌，靜置分層，棄去上層，收集下層；下層溶液采用高速逆流色譜純化，根據(jù)圖譜收集目標(biāo)成分，回收試劑，減壓干燥即得王不留行總皂苷。本方法高效、快速、應(yīng)用范圍廣，適合高純度王不留行總皂苷的生產(chǎn)。
【IPC分類】A61K36/36
【公開號】CN104940268
【申請?zhí)枴緾N201510265056
【發(fā)明人】劉東鋒, 楊成東
【申請人】南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年5月22日