專利名稱：聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備細(xì)菌菌影的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓技術(shù)制備細(xì)菌菌影的方法及應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
菌影是一種近年在國(guó)外開展的新型疫苗和耙向藥物載體系統(tǒng)，它是將裂解基因在革蘭氏陰性細(xì)菌中表達(dá)，在細(xì)菌細(xì)胞膜和胞壁上可形成多個(gè)穿膜隧道，在滲透壓的作用下使細(xì)菌胞內(nèi)細(xì)胞漿和核酸成分降解為小片斷后被排出，繼而形成一種空的細(xì)菌外殼，即為"細(xì)菌膜影"。菌影能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性和非特異性的免疫應(yīng)答，包括T細(xì)胞的活化和粘膜免疫等，而且既能攜帶外源抗原，又能同時(shí)遞送核酸和其他藥物，所以它被認(rèn)為是非常有用的候選疫苗和滅活載體。菌影可以通過發(fā)酵而大量生產(chǎn)，加工容易，安全可靠，同時(shí)菌影表面存在很多受體，可以用來靶向作用于特異性的細(xì)胞和組織。目前，除大腸桿菌外，很多革蘭氏陰性菌均能在裂解基因E作用下產(chǎn)
生菌影，如胸膜肺炎放線桿菌，霍亂弧菌、溶血性巴氏桿菌、幽門螺桿菌和遲鈍愛德華氏菌等。菌影免疫原性好、佐劑作用明顯、還是良好的藥物與蛋白的靶向載體，制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，接種途徑多樣，使用安全，易于產(chǎn)業(yè)化推廣，使菌影成為當(dāng)今疫苗研究的熱點(diǎn)，也顯示了極具吸引力的應(yīng)用前景。
抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，分子量在
2000 7000左右，由20 60個(gè)氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)。世界上第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的抗菌肽是1980年由瑞典科學(xué)家G.Boman等人經(jīng)注射陰溝通桿菌及大腸桿菌誘導(dǎo)惜古比天蠶蛹產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽，定名為Cecr叩ins。此后數(shù)年間，人們相繼從細(xì)菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動(dòng)物乃至人類中發(fā)現(xiàn)并分離獲得具有抗菌活性的多肽。由于最初人們發(fā)現(xiàn)這類活性多肽對(duì)細(xì)菌具有廣譜高效殺菌活性，因而命名為"antibactetialpepiides，ABP"，
中文譯為抗菌肽，其原意為抗細(xì)菌肽。隨著人們研究工作的深入開展，發(fā)現(xiàn)某些抗細(xì)菌肽對(duì)部分真菌、原蟲、病毒及癌細(xì)胞等均具有強(qiáng)有力的殺傷作用，因而對(duì)這類活性多肽的命名許多學(xué)者傾向于稱之為"peptideantibiotics"—多肽抗生素。目前，所有的常規(guī)抗生素都出現(xiàn)了相應(yīng)的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性問題已經(jīng)R益嚴(yán)重地威脅著人們的健康。尋找全新類型的抗生素是解決抗藥性問題的一條有效途徑?？咕囊?yàn)榭咕钚愿?，抗菌譜廣，種類多，可供選擇的范圍廣，靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等原因，而被認(rèn)為將會(huì)在醫(yī)藥工業(yè)上有著廣闊的應(yīng)用前景。目前，己有多種多肽抗生素正在進(jìn)行臨床前的可行性研究，其中magainins己經(jīng)進(jìn)入三期臨床試驗(yàn)階段。
超高壓技術(shù)是是一種新型的冷殺菌技術(shù)，它的基本原理是將100 1 OOOMPa的壓力施加于細(xì)菌，改變微生物的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，破壞微生物細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物流失，抑制生化反應(yīng)，阻遏了細(xì)胞的新陳代謝過程，使細(xì)菌分裂減慢，生長(zhǎng)滯后，甚至停止生長(zhǎng)，常用于食品的滅菌和保鮮。
目前傳統(tǒng)的菌影制備方法存在以下不足菌影的裂解效率一直很難提高，菌體內(nèi)
含物釋放不徹底，菌體滅活不徹底；構(gòu)建裂解載體費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作繁復(fù)；傳統(tǒng)的菌影
制備方法是建立在裂解載體的基礎(chǔ)上，制備不同細(xì)菌的菌影需要不同的裂解載體，如
果沒有相應(yīng)的載體則無法制備該細(xì)菌的菌影。
目前國(guó)內(nèi)外還沒有將抗菌肽和超高壓技術(shù)結(jié)合用于制備菌影的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容-
本發(fā)明公開一種聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備細(xì)菌菌影的方法，提供了一種新的細(xì)菌菌影制備方法。
本發(fā)明公開了聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備的細(xì)菌菌影，可以作為一種新的候選疫苗使用。
本發(fā)明的聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備細(xì)菌菌影的方法，其特征在于聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓替代傳統(tǒng)方法來制備細(xì)菌菌影，提供了一種新的細(xì)菌菌影制備方法。本發(fā)明的聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備細(xì)菌菌影的方法如下-利用基因工程表達(dá)的方法，獲得抗菌肽；將細(xì)菌菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600為0.4 0.6)時(shí)，加入抗菌肽，4"作用過夜或室溫作用2 4h;離心收集菌體并用生理鹽水重復(fù)洗兩次，加入生理鹽水重懸，進(jìn)行200 250MPa超高壓處理；離心收集菌體并用生理鹽水重復(fù)洗兩次，即制備成細(xì)菌菌影，冷凍干燥保存于一2(TC或一8(TC
備用o
本發(fā)明的聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備細(xì)菌菌影的應(yīng)用，包括以下步驟制備細(xì)菌菌影，免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可剌激機(jī)體產(chǎn)生特異的體液免疫和細(xì)胞免疫，與滅活苗相比有相同的保護(hù)率，具有良好的免疫效果，可以作為一種新的候選疫苗。
本發(fā)明的積極效果在于-傳統(tǒng)的菌影制備方法存在以下不足菌影的裂解效率一直很難提高，菌體內(nèi)含物
釋放不充分，菌體滅活不徹底；構(gòu)建裂解載體費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作繁復(fù)；傳統(tǒng)的菌影制備
方法是建立在裂解載體的基礎(chǔ)上，制備不同細(xì)菌的菌影需要不同的裂解載體，如果沒
有相應(yīng)的載體則無法制備該細(xì)菌的菌影。本發(fā)明聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備細(xì)菌菌
影，提供了一種新的細(xì)菌菌影制備方法，取得了良好的效果，裂解效率高，可達(dá)
99.9999999%以上，并且操作簡(jiǎn)單，可廣泛用于細(xì)菌的菌影制備；對(duì)制備的細(xì)菌菌影
進(jìn)行了應(yīng)用，具有良好的免疫效果，可以作為一種新的候選疫苗使用。


圖1.正常豬胸膜肺炎放線桿菌的TEM照片(13000X);
圖2.豬胸膜肺炎放線桿菌菌影的TEM照片(13000X);
圖3.正?？莶輻U菌的TEM照片(13000X);
圖4.枯草桿菌菌影的TEM照片(13000X);
圖5.正常大腸桿菌0138的TEM照片(13000X);
圖6.大腸桿菌Ou8菌影的TEM照片(13000X);
具體實(shí)施例方式
通過以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。下面用實(shí)施例來進(jìn)一歩說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例1
利用抗菌肽Tachyplesin I制備豬胸膜肺炎放線桿菌的菌影本實(shí)施例選用的抗菌肽為Tachyplesin I ;選用的細(xì)菌為豬胸膜肺炎放線桿菌(革
蘭氏陰性菌)，為本研究室保存。
Tachyplesin I的DNA序列為
aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t 51
Tachyplesin I的氨基酸序列為
Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly lie Cys Tyr Arg Arg Cys Arg
1. 抗菌肽的表達(dá)
利用酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)抗菌肽進(jìn)行真核表達(dá)。
2. 細(xì)菌菌影的制備將細(xì)菌菌株過夜增菌后，按0.5%轉(zhuǎn)接種于培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)OD6W)為0.4 0.6時(shí)，加入表達(dá)的抗菌肽Tachyplesin I至終濃度為3.5ug/mL， 4'C作用過夜或室溫作用2 4h;作用結(jié)束后，4°C， 5 000 rpm離心10 min，離心收集菌體并用生理鹽水重復(fù)洗兩次，制備成細(xì)菌菌影；對(duì)處理前后的細(xì)菌適當(dāng)稀釋進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)(CFU，個(gè)/ml)，計(jì)算裂解率。
3. 菌影的保存
將離心收集菌影細(xì)胞棄盡上清，最后溶于適當(dāng)體積生理鹽水，計(jì)算菌影濃度，分裝于1.5mL疫苗瓶，每瓶800pL左右(含菌影5.0X 10^個(gè)/mL)，高度不超過0.5cm，冷凍干燥后保存于一20。C或一8(TC。
實(shí)施例2
聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備豬胸膜肺炎放線桿菌的菌影本實(shí)施例選用的抗菌肽為Tachyplesin I ，選用的細(xì)菌為豬胸膜肺炎放線桿菌(革
蘭氏陰性菌)，為本研究室保存。
Tachyplesin I的DNA序列為
aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t 51
Tachyplesin I的氨基酸序列為
Lys Tip Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly He Cys Tyr Arg Arg Cys Arg
1. 抗菌肽的表達(dá)
利用酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)抗菌肽進(jìn)行真核表達(dá)。
2. 抗菌肽處理細(xì)菌
將細(xì)菌菌株過夜增菌后，按0.5%轉(zhuǎn)接種于培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)0D6QG為0.4 0.6時(shí)，加入表達(dá)的抗菌肽至終濃度為0.35ug/mL，4'C作用過夜或室溫作用2 4h;4'C，5 000 rpm離心10 min，離心收集菌體并用生理鹽水重復(fù)洗兩次。對(duì)處理前后的細(xì)菌適當(dāng)稀釋進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)(CFU，個(gè)/ml)，計(jì)算裂解率。
3.超高壓處理
將用抗菌肽處理過的菌液裝入無菌處理的聚乙烯復(fù)合袋中，真空密封，放入超高壓裝置中；經(jīng)過200MPa，保壓10min，進(jìn)行超高壓處理，離心收集菌體并用生理鹽水重復(fù)洗兩次，制備成細(xì)菌菌影；對(duì)處理前后的細(xì)菌適當(dāng)稀釋進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)(CFU，個(gè)/ml)，計(jì)算裂解率。
4. 菌影的保存將離心收集菌影細(xì)胞棄盡上清，最后溶于適當(dāng)體積生理鹽水，計(jì)算菌影濃度，分裝于1.5mL疫苗瓶，每瓶800iaL左右(含菌影5.0X 1(T個(gè)/mL)，高度不超過0.5cm，冷凍干燥后保存于一2(TC或一8(TC。
實(shí)施例3
聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備枯草桿菌的菌影
本實(shí)施例選用的抗菌肽為Catesbeianin-l，選用的細(xì)菌為枯草桿菌(革蘭氏陽性菌)，為本研究室保存。
Catesbeianin-l的DNA序列為
atgatgaggg tgatgaggag gaagactaaa gttatttggg aaaaaaagga ctttattgga 60ttatacagta ttgattga 78Catesbeianin-1的氨基酸序列為
Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val lie Tip Glu Lys LysAsp Phe lie Gly Leu Tyr Ser lie Asp
1. 抗菌肽的表達(dá)
利用酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)抗菌肽進(jìn)行真核表達(dá)。
2. 抗菌肽處理細(xì)菌
將細(xì)菌菌株過夜增菌后，按0.5X轉(zhuǎn)接種于培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)OD6oo為0.4 0.6時(shí)，加入表達(dá)的抗菌肽至終濃度為0.35ug/mL,4。C作用過夜或室溫作用2 4h;4"C，5 000 rpm離心10min，離心收集菌體并用生理鹽水重復(fù)洗兩次。對(duì)處理前后的細(xì)菌適當(dāng)稀釋進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)(CFU，個(gè)/ml)，計(jì)算裂解率。
3.超高壓處理
將用抗菌肽處理過的菌液裝入無菌處理的聚乙烯復(fù)合袋中，真空密封，放入超高壓裝置中；經(jīng)過250MPa，保壓10min，進(jìn)行超高壓處理，離心收集菌體并用生理鹽水重復(fù)洗兩次，制備成細(xì)菌菌影；對(duì)處理前后的細(xì)菌適當(dāng)稀釋進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)(CFU，個(gè)/ml)，計(jì)算裂解率。
4.菌影的保存
將離心收集菌影細(xì)胞棄盡上清，最后溶于適當(dāng)體積生理鹽水，計(jì)算菌影濃度，分裝于1.5mL疫苗瓶，每瓶800pL左右(含菌影5.0X 10"個(gè)/mL)，高度不超過0.5cm，冷凍干燥后保存于一20。C或一80。C。
實(shí)施例4聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備大腸桿菌o138的菌影
本實(shí)施例選用的抗菌肽為Tachyplesin I，選用的細(xì)菌為大腸桿菌0138 (革蘭氏 陰性菌)，為本研究室保存。
Tachyplesin I的DNA序列為
aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t 51 Tachyplesin I的氨基酸序列為
Lys Tip Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly He Cys Tyr Arg Arg Cys Arg
1. 抗菌肽的表達(dá)
利用酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)抗菌肽進(jìn)行真核表達(dá)。
2. 抗菌肽處理細(xì)菌
將細(xì)菌菌株過夜增菌后，按0.5%轉(zhuǎn)接種于培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)OD6QQ為0.4 0.6時(shí)，加入表達(dá)的抗菌肽至終濃度為0.35ug/mL，4'C作用過夜或室溫作用2 4h;4'C， 5 000 rpm離心10min，離心收集菌體并用生理鹽水重復(fù)洗兩次。對(duì)處理前后的細(xì)菌 適當(dāng)稀釋進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)(CFU,個(gè)/ml)，計(jì)算裂解率。
3.超高壓處理
將用抗菌肽處理過的菌液裝入無菌處理的聚乙烯復(fù)合袋中，真空密封，放入超高 壓裝置中；經(jīng)過250MPa，保壓10min，進(jìn)行超高壓處理，離心收集菌體并用生理鹽 水重復(fù)洗兩次，制備成細(xì)菌菌影；對(duì)處理前后的細(xì)菌適當(dāng)稀釋進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)(CFU， 個(gè)/ml)，計(jì)算裂解率。
4.菌影的保存
將離心收集菌影細(xì)胞棄盡上清，最后溶于適當(dāng)體積生理鹽水，計(jì)算菌影濃度， 分裝于1.5mL疫苗瓶，每瓶800pL左右(含菌影5.0X 10^個(gè)/mL)，高度不超過0.5cm， 冷凍干燥后保存于一20。C或一8(TC。
實(shí)驗(yàn)例l
細(xì)菌菌影的裂解效率及透射電鏡(TEM)觀察
按實(shí)施例1、 2、 3和4制備細(xì)菌菌影，測(cè)定裂解效率，經(jīng)測(cè)定實(shí)施例1的裂解 效率可達(dá)99.9999%以上。實(shí)施例2、 3和4裂解效率可達(dá)99.9999999%以上。由此 可見，聯(lián)合使用抗菌肽和超高壓制備的菌影比單純使用抗菌肽制備的菌影裂解效率要 高。
按實(shí)施例2、 3和4制備細(xì)菌菌影，用2.5 %戊二醛固定4 h， 1 %鋨酸固定1 h，30 %乙醇脫水10 min， 50 %乙醇脫水15 min， 70 %醋酸鈾作用12h， 80 %乙醇脫水 15 min， 95 %乙醇脫水20 min，兩次無水乙醇脫水40 min，然后用環(huán)氧丙烷脫水30 min， 加入1 : 1的環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹脂作用2 h，加入純環(huán)氧樹脂滲透3 h，然后在50 'C下 環(huán)氧樹脂包埋12h，最后用環(huán)氧樹脂繼續(xù)包埋48h。包埋后超薄切片機(jī)制成切片，放 入銅網(wǎng)中。切片進(jìn)行染色，以醋酸鈾作用30min，水洗，然后加入檸檬酸鉛作用20min， 水洗。于透射電鏡(TEM)下觀察。
電鏡結(jié)果見圖l一圖6，由圖可以看出，聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓的方法成功制 備了豬胸膜肺炎放線桿菌(革蘭氏陰性菌)、枯草桿菌(革蘭氏陽性菌)和大腸桿菌 0138 (革蘭氏陰性菌)的菌影。
實(shí)驗(yàn)例2
細(xì)菌菌影的免疫效果評(píng)價(jià)
1. 細(xì)菌菌影的制備
按實(shí)施例1制備豬胸膜肺炎放線桿菌的菌影，重懸于適當(dāng)體積生理鹽水，使菌 影濃度為5.0Xl()io個(gè)/mL，充分混勻。
2. 甲醛滅活鋁佐劑苗的制備
將豬胸膜肺炎放線桿菌接種于培養(yǎng)基中，經(jīng)37'C培養(yǎng)18-24h后制備成種子菌液， 接種于液體培養(yǎng)基，37t:培養(yǎng)18-24h后取出少量進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，其余菌液按0.1%加 入甲醛，37。C滅活24h， 4。C保存?zhèn)溆?。使用時(shí)5000rpm離心，并用生理鹽水洗兩次 后，按l: 5比例加入氫氧化鋁膠，充分振蕩即為甲醛滅活鋁佐劑苗。
3. 無菌檢驗(yàn)
將所制備豬胸膜肺炎放線桿菌的菌影和甲醛滅活鋁佐劑苗隨機(jī)抽樣，接種于LB 平板，37'C培養(yǎng)48h，檢査有無細(xì)菌生長(zhǎng)。
4. 安全性檢驗(yàn)
取10只18—22g小鼠，每只腹腔注射細(xì)菌菌影，注射劑量約為免疫劑量的10倍， 連續(xù)觀察7—10d;甲醛滅活鋁佐劑苗同上。腹腔注射細(xì)菌菌影及甲醛滅活鋁佐劑苗后 小鼠無死亡及發(fā)病癥狀，肝臟組織觸片鏡檢無豬胸膜肺炎放線桿菌，表明細(xì)菌菌影及 甲醛滅活鋁佐劑苗安全合格。
5. 免疫實(shí)驗(yàn)
小鼠隨機(jī)分組，每組20只，接種不同抗原進(jìn)行免疫，空白對(duì)照組免相同劑量生 理鹽水，相同條件下分籠飼養(yǎng)，免疫程序見下表。_免疫實(shí)驗(yàn)分組_
分組 免疫原 免疫劑量免疫途徑免疫次數(shù)
_及時(shí)間
A 豬胸膜肺炎放線桿菌菌影 5Xl(^CFU/只腹腔注射三次，間
B 豬胸膜肺炎放線桿菌 5X109CFUAR腹腔注射 隔兩周
滅活鋁佐劑苗
C_生理鹽7jC_100pL/只 腹腔注射_
6. 免疫水平的檢測(cè)
間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞免疫水平。 血清抗體水平檢測(cè)結(jié)果免疫小鼠后間接ELISA定期檢測(cè)血清IgG抗體效價(jià)， 三次免疫后抗體效價(jià)達(dá)到3200 X 。
脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果免疫組較對(duì)照組有明顯的細(xì)胞增值。
7. 攻毒實(shí)驗(yàn)
三免后一周，小鼠腹腔注射3倍最小致死量的活菌進(jìn)行大劑量感染實(shí)驗(yàn)，對(duì)小鼠 存活情況進(jìn)行計(jì)數(shù)，檢測(cè)疫苗的保護(hù)效果。
三次免疫后免疫保護(hù)結(jié)果見下表，細(xì)菌菌影的保護(hù)率與甲醛滅活苗的保護(hù)率都達(dá) 到100%，空白對(duì)照組全部死亡。
疫苗免疫保護(hù)測(cè)定結(jié)果
組別存活數(shù)死亡數(shù)保護(hù)率％
A20/200/20100
B20/200/20畫
C20/2020/200
結(jié)論由以上結(jié)果可以看出，聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備的細(xì)菌菌影比單純利 用抗菌肽制備的菌影裂解率更高，可剌激機(jī)體產(chǎn)生特異的體液免疫和細(xì)胞免疫，與滅 活苗相比有相同的保護(hù)率，具有良好的免疫效果，可以作為一種新的候選疫苗使用。序列表
〈110>吉林大學(xué)
〈120>聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備細(xì)菌菌影的方法及應(yīng)用 <130> 22 <歸 4
<170> Patentln version 3. 5
<210> 1
〈211〉 51
〈212〉 廳
<213>人工合成
〈400〉 1
aaatggtgct tccgtgtttg ctaccgtggt atctgctacc gtcgttgccg t 51
<210> 2
<211> 17
〈212〉 PRT
〈213>人工合成
〈400〉 2
Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly lie Cys Tyr Arg Arg Cys 15 10 15
Arg
〈210> 3 〈211〉 78 〈212>艦 〈213〉人工合成 〈400> 3
atgatgaggg tgatg鄉(xiāng)ag gaagactaaa gttatttggg aaaaaa郷a ctttattgga 60
ttatacagta ttgattga 78
<210> 4
〈211> 25
<212> PRT
〈213〉人工合成
<400> 4
Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val lie Trp Glu Lys Lys 15 10 15
Asp Phe lie Gly Leu Tyr Ser lie Asp 20 25
1權(quán)利要求
1、一種聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備細(xì)菌菌影的方法，包括以下步驟將細(xì)菌菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600為0.4～0.6)時(shí)，加入抗菌肽，4℃作用過夜或室溫作用2～4h；離心收集菌體并用生理鹽水重復(fù)洗兩次，加入生理鹽水重懸，進(jìn)行200～250MPa超高壓處理；離心收集菌體并用生理鹽水重復(fù)洗兩次，即制備成細(xì)菌菌影。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聯(lián)合利用抗菌肽和超高壓制備細(xì)菌菌影的方法及應(yīng)用，將細(xì)菌菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD₆₀₀為0.4～0.6)時(shí)，加入抗菌肽，4℃作用過夜或室溫作用2～4h；離心收集菌體并用生理鹽水重復(fù)洗兩次，加入生理鹽水重懸，進(jìn)行200～250MPa超高壓處理；離心收集菌體并用生理鹽水重復(fù)洗兩次，即制備成細(xì)菌菌影。本發(fā)明提供了一種新的細(xì)菌菌影制備方法，取得了良好的效果，裂解效率高，可達(dá)99.9999999％以上，并且操作簡(jiǎn)單，可廣泛用于細(xì)菌的菌影制備；對(duì)制備的細(xì)菌菌影進(jìn)行了應(yīng)用，具有良好的免疫效果，可以作為一種新的候選疫苗使用。
文檔編號(hào)A61K47/46GK101683524SQ20091006728
公開日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2009年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月15日
發(fā)明者孫長(zhǎng)江, 杜崇濤, 江麗娜, 盛相鵬, 芳 謝, 雷連成, 韓文瑜 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)