中成藥或含中藥材保健品的dna的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明設(shè)及一種優(yōu)化的中成藥或含中 藥材保健品的DNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] CTAB (hexade巧Itrimeth^ammonium bromide,十六烷基S甲基漠化錠）是一種陽(yáng) 離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶 液中（〉0. 7mol/L化C1)，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過(guò)有 機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酪類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。
[0003] 在傳統(tǒng)CTAB法提取中成藥或含中藥材保健品中的DNA的過(guò)程中，異丙醇沉淀DNA 時(shí)出現(xiàn)分層現(xiàn)象，造成DNA提取量極低；申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)運(yùn)是由于輔料添加淀粉或者藥源性淀 粉對(duì)傳統(tǒng)CTAB法提取DNA造成了不利影響。如果不對(duì)傳統(tǒng)CTAB法進(jìn)行改進(jìn)，分子鑒定技 術(shù)難W成為中成藥或含中藥材保健品的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于此，本發(fā)明的目的在于提供一種改良的提取中成藥或含中藥材保健品的DNA 的方法，旨在解決由于輔料添加淀粉或者藥源性淀粉對(duì)傳統(tǒng)CTAB法提取DNA造成的不利影 響，從而提局DNA的提取效率和質(zhì)量。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了 W下技術(shù)方案：
[0006] 一種中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，在傳統(tǒng)CTAB法過(guò)程中增加了甲 醇沉淀DNA的步驟。
[0007] 在其中一些實(shí)施例中，所述甲醇沉淀DNA的步驟發(fā)生在異丙醇沉淀之前，或者發(fā) 生在異丙醇沉淀之后。優(yōu)選在異丙醇沉淀之前。
[0008] 在其中一些實(shí)施例中，所述甲醇的工作濃度為60~90%。
[0009] 在其中一些實(shí)施例中，所述甲醇的工作濃度為70%。
[0010] 本發(fā)明通過(guò)系統(tǒng)篩查中成藥或含中藥材保健品中存在的各種成分及其性質(zhì)，分析 傳統(tǒng)CTAB法提取過(guò)程中影響DNA產(chǎn)量和質(zhì)量的原因，首次發(fā)現(xiàn)中成藥或含中藥材的保健品 中的淀粉類成分會(huì)與CTAB形成高極性的復(fù)合物，從而大大影響了 DNA的沉淀分離效果，導(dǎo) 致沉淀效果低，也影響了 DNA的質(zhì)量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果： 1] 1、本發(fā)明的DNA提取方法發(fā)現(xiàn)在CTAB法過(guò)程的任何步驟中增加甲醇沉淀DNA的 步驟，都可W顯著提高DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量，并能成功進(jìn)行DNA分子鑒定。由于甲醇與乙醇、 異丙醇性質(zhì)相似，傳統(tǒng)CTAB方法已經(jīng)使用了乙醇或異丙醇進(jìn)行處理，故當(dāng)傳統(tǒng)方法提取的 DNA達(dá)不到分子鑒定的要求時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員一般不會(huì)考慮使用甲醇解決此問(wèn)題，本發(fā)明 創(chuàng)造性地在傳統(tǒng)CTAB方法中增加一個(gè)關(guān)鍵的甲醇沉淀步驟，解決了此問(wèn)題，具有顯著的新 穎性和獨(dú)創(chuàng)性；
[0012] 2、本發(fā)明W人參類成藥制劑為例，考察了甲醇和乙醇用于沉淀、分離中成藥或含 中藥材保健品的DM的效果比較試驗(yàn)，比較試驗(yàn)的設(shè)計(jì)分別觀察了 DM提取率和上清殘留 兩個(gè)指標(biāo)，DNA提取率、上清液DNA巧光分析兩種方法互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)，從而得出更為客觀的結(jié)果 和分析；W人參類成藥制劑為例闡述成藥制劑DNA提取技術(shù)，有效避免了因?yàn)镈NA量低質(zhì)差 而無(wú)法跑出理想DNA電泳條帶的缺陷，通過(guò)分子鑒定結(jié)果評(píng)估優(yōu)化了的DNA提取技術(shù)顯得 更有說(shuō)服力。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中的11種含人參中成藥或保健品的分子鑒定圖譜；
[0014] 圖2為本發(fā)明試驗(yàn)例1中采用甲醇和乙醇沉淀DNA的提取率比較圖；
[0015] 圖3為本發(fā)明試驗(yàn)例1中采用甲醇和乙醇沉淀DNA時(shí)的相對(duì)巧光強(qiáng)度比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限定 本發(fā)明。
[0017] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理做進(jìn)一步描述。
[0018] W下實(shí)施例中，所用試劑均為分析純，除了特殊說(shuō)明外，所有試劑均來(lái)源于市售。
[0019] 實(shí)施例1
[0020] 本實(shí)施例的一種中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，包括W下步驟： 陽(yáng)02U (1)、分別將表1所示的樣品細(xì)粉約2g置于10ml離屯、管中，加65°C預(yù)熱的2XCTAB 提取緩沖液2. 5ml及琉基乙醇100 y L于65°C水浴裂解化，8 000巧m離屯、5min，期間常顛 倒混勻；
[0022] 表1試驗(yàn)用人參類成藥制劑情況
[0023]
陽(yáng)0巧](2)、取上清液加甲醇5ml，-20°C沉淀比，8 000巧m離屯、5min ; 陽(yáng)0%] (3)、取沉淀轉(zhuǎn)移到2ml EP管中，加入65°C預(yù)熱的2XCTAB提取緩沖液600 y L及 琉基乙醇16 置于65°C裂解20min，期間常震蕩；
[0027] (4)、加等體積氯仿：異戊醇（24:1)顛倒混勻5min，12 00化pm離屯、15min ;取上清 液加等體積-20°C預(yù)冷的異丙醇，-20°C沉淀化，12 00化pm離屯、15min ;
[0028] 巧）、取沉淀用無(wú)菌水600 yL溶解，隨后加入乙醇1 200 yL及3M醋酸鋼溶液 60 y L，混勻，置-20°C沉淀比，12 00化pm離屯、15min，根據(jù)DNA的質(zhì)量重復(fù)本操作2~3次；
[0029] 化）、取沉淀置于37°C烘箱溫育比，直至乙醇揮干，隨后加約200iiL無(wú)菌水溶 解，-20°C冷凍備用，即得DNA模板。
[0030] 使用化ngtaoWang等的方法對(duì)采用該實(shí)施例提取的DNA進(jìn)行分子鑒定。
[0031] 基于SNP方法針對(duì)人參ETS基因設(shè)計(jì)特征性引物ETSR燈TTGCAAGTCGTGTGAGTTG); A評(píng)(GTGTTGGCATAGTGTACGTTA) ;P評(píng)(AGAGCAGTAAGCCTTGGAAAAT)。
[0032]使用 50 y L 體系：DNA 模板 lOng、引物各 0. 5 化，W 及 10 y L2XPremixDNA polymerase,補(bǔ)水至 50yL ;
[0033] PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C變性4min，然后94°C解鏈30s、63°C退火30s、72°C延伸30s 進(jìn)行35次循環(huán)，72°C延伸5min，4°C保存。
[0034]通過(guò)10 %瓊脂糖矣別父檢測(cè)，結(jié)果如圖1所不。11種商品中,序號(hào)為1、2、3、4、6、7、 8、10的樣品與商品描述相符合，序號(hào)為11的樣品有滲偽情況，序號(hào)為5、9的樣品與商品描 述不相符。 陽(yáng)0對(duì)實(shí)施例2
[0036] 本實(shí)施例的一種中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，包括W下步驟：
[0037](1)、分別取表1所列的樣品細(xì)粉若干，置于2ml的EP管中，加65°C預(yù)熱的2 X CTAB 提取緩沖液600 y 1及琉基乙醇16 y 1，于65°C裂解化，期間常顛倒混勻；
[0038] (2)、加等體積氯仿-異戊醇（24:1)顛倒混勻5min，12 000巧m離屯、15min ;取上 清液加等體積-20°C預(yù)冷的異丙醇，-20°C沉淀化，12 00化pm離屯、15min ;
[0039](3)、取下層溶液補(bǔ)無(wú)菌水至600 y 1，加甲醇1200 y 1及3M醋酸鋼溶液60 y 1，混 勻，置-20°C沉淀比，12 000巧m離屯、15min ; W40] (4)、取沉淀，用無(wú)菌水600iiL溶解，隨后加入乙醇1 200iiL及的3M醋酸鋼溶液 60yL，混勻，置-20°C沉淀比，12 00化pm離屯、15min，根據(jù)DNA的質(zhì)量重復(fù)本操作2~3次；
[0041] 巧）、取沉淀，置于37°C烘箱溫育比，直至乙醇揮干，隨后加無(wú)菌水100~200iiL 溶解，-20°C冷凍備用，即得DM模板。
[0042] 對(duì)采用該實(shí)施例提取的DNA采用實(shí)施例1下的相同方法進(jìn)行分子鑒定，通過(guò)10% 瓊脂糖凝膠檢測(cè)，結(jié)果與實(shí)施例1的相同。 陽(yáng)0創(chuàng)試驗(yàn)例1甲醇和乙醇沉淀對(duì)DNA提取效率的影響
[0044] 本試驗(yàn)例W人參類成藥制劑為例，考察了甲醇和乙醇用于沉淀、分離中成藥或含 中藥材保健品的DNAW及來(lái)自于人參葉的標(biāo)準(zhǔn)DNA的效果比較試驗(yàn)，結(jié)果分別如表2、圖2 和圖3所示。
[0045] 表2不同DNA提取試驗(yàn)微量分光亮度計(jì)檢測(cè)值（N= 3)
[0046]
[0047] ***T-Tes巧<0. 01，與傳統(tǒng)方法比較。
[0048] 從表2結(jié)果可知，在異丙醇沉淀之前增加一步甲醇沉淀DNA步驟，可W顯著提高 DM的產(chǎn)量和質(zhì)量，并能成功進(jìn)行DNA分子鑒定。從圖2和圖3結(jié)果可知，與乙醇相比，使用 甲醇進(jìn)行沉淀標(biāo)準(zhǔn)DNA，具有更高的提取率，且甲醇的工作濃度為60-90%，最佳工作濃度 為 70%。 W例 CTAB法提取中成藥或含中藥材保健品的DNA過(guò)程中遇到困難，是一個(gè)實(shí)驗(yàn)人員已 經(jīng)關(guān)注到便沒(méi)有被解決的問(wèn)題。本發(fā)明的發(fā)明人在使用傳統(tǒng)CTAB法提取人參類成藥制劑， 并對(duì)其進(jìn)行分子鑒定時(shí)，因?yàn)镈NA提取困難，無(wú)檢測(cè)結(jié)果，其劑型主要為顆粒劑、粉劑。經(jīng)過(guò) 分析，發(fā)現(xiàn)其原因在于中成藥中所含的淀粉與CTAB在加熱條件下反應(yīng)生成高極性富正電 荷的復(fù)合物，并影響了的DNA沉淀效果，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)采用甲醇處理可W有效去除運(yùn)種復(fù)合 物的影響，W人參類成藥制劑為例闡述成藥制劑DNA提取技術(shù)優(yōu)化過(guò)程，最終建立的優(yōu)化 方法有效避免了傳統(tǒng)CTAB法用于中成藥時(shí)因?yàn)樘崛〉玫降腄NA量少質(zhì)差而無(wú)法跑出理想 DNA電泳條帶的缺陷，采用該優(yōu)化方法提取得到的DNA可成功用于含人參中成藥的人參藥 材分子鑒定，使得該DNA提取技術(shù)更有說(shuō)服力。
[0050] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)， 如：在整個(gè)CTAB法提取中成藥或保健品DNA過(guò)程中任何步驟使用甲醇沉淀、純化DNA也在 本發(fā)明之內(nèi)。
[0051] W上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái) 說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干變形和改進(jìn)，運(yùn)些都屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)W所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，其特征在于，在傳統(tǒng)CTAB法過(guò)程 中增加了甲醇沉淀DNA的步驟。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，其特征在于，所 述甲醇沉淀DNA的步驟發(fā)生在異丙醇沉淀之前，或者發(fā)生在異丙醇沉淀之后。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，其特征在 于，所述甲醇的工作濃度為60~90 %。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，其特征在于，所 述甲醇的工作濃度為70%。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，其是在傳統(tǒng)CTAB法過(guò)程中增加了甲醇沉淀DNA的步驟。本發(fā)明通過(guò)系統(tǒng)篩查CTAB法提取過(guò)程中影響DNA產(chǎn)量和質(zhì)量的原因，首次發(fā)現(xiàn)中成藥及含中藥材的保健品中的淀粉類成分會(huì)與CTAB形成高極性的復(fù)合物，從而影響后續(xù)異丙醇沉淀DNA的效果，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在CTAB法過(guò)程中的任何步驟增加甲醇沉淀DNA的步驟，則可以顯著提高DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量，并能成功進(jìn)行DNA分子鑒定。
【IPC分類】C12N15/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105002160
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510415609
【發(fā)明人】周華, 程春松, 劉良
【申請(qǐng)人】澳門(mén)科技大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年7月15日